CYP3A4 (IC50 = 74 μM); natural flavonoid from Silybum marianum

报告基因检测表明，水飞蓟成分水飞蓟宾和异水飞蓟宾负责抑制水飞蓟中PXR介导的CYP3A4激活。与水飞蓟宾相比，其异构体异水飞蓟宾是 PXR 介导的 CYP3A4 激活的更强抑制剂。 89、133 和 200 μM 的异水飞蓟宾溶液分别显着降低 CYP3A4 诱导 64%、82% 和 88%。 Isosilybin 抑制 CYP3A4 诱导，IC50 为 74 μM[1]。异水飞蓟宾 B 和异水飞蓟宾 A 是从水飞蓟素中获得的两种非对映异构体，具有通过细胞周期停滞和细胞凋亡激活介导的抗前列腺癌 (PCA) 作用。使用异水飞蓟宾 B 和异水飞蓟宾 A 治疗会导致人前列腺癌 LNCaP 和 22Rv1 细胞的生长抑制和细胞死亡，以及显着的 G(1) 停滞和细胞凋亡 [2]。异水飞蓟宾 B 会增强 Akt（Ser-473 和 Thr-308）和 Mdm2（Ser-166）的磷酸化，这与用 PI3K 抑制剂 (LY294002) 预处理恢复雄激素受体水平是一致的。与身体退化有关。异水飞蓟宾 B 疗法可以加速 Akt、Mdm2 和 AR 之间复合物的形成，从而促进磷酸化依赖性 AR 泛素化以及随后被蛋白酶体破坏 [3]。异水飞蓟宾 A 在 30 μM 剂量下强烈激活 PPARγ（2.08±0.48 倍，p<0.01）。 Isosilybin A 以浓度依赖性方式刺激 PPARγ 依赖性荧光素酶报告基因的反式激活。计算机对接研究表明，3的结合方式与非活性水飞蓟素成分不同，在受体配体结合域的入口区与Ser342存在额外的氢键[4]。

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水飞蓟中产生这种作用的成分被鉴定为水飞蓟宾和异水飞蓟宾。此外，计算分子对接显示水飞蓟宾和异水飞蓟宾与PXR之间存在很强的相互作用，这在TR-FRET PXR实验中得到了证实。综上所述，水飞蓟宾和异水飞蓟宾可能是设计有效的PXR拮抗剂的合适人选，以防止癌症患者通过CYP3A4药物相互作用。[1]

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水飞蓟素及其成分水飞蓟宾素对前列腺癌（PCA）有较强的治疗作用；然而，水飞蓟素的其他成分的抗癌功效和相关机制在很大程度上是未知的，水飞蓟素是黄酮木质素的混合物。本研究从水飞蓟素中分离得到两种纯化合物异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A，对人前列腺癌LNCaP和22Rv1细胞的抗癌作用进行了评价。异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A处理导致两种细胞系的生长抑制和细胞死亡，并伴有强烈的G(1)阻滞和凋亡。在检测细胞周期和凋亡调节因子变化的研究中，异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A导致细胞周期蛋白（D1, D3， E和A）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk2， Cdk4和细胞分裂周期25A）的水平降低，但导致p21， p27和p53水平升高，除了在22Rv1细胞中异水飞蓟宾B导致p21蛋白水平降低。异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾a诱导的细胞凋亡伴随着聚adp核糖聚合酶、caspase-9和caspase-3裂解的增加和survivin水平的降低。与LNCaP和22Rv1细胞相比，异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A在非肿瘤性人前列腺上皮细胞PWR-1E中的抗增殖和细胞毒潜能要小得多，这表明这些化合物具有转化选择性作用。本研究首次发现从水飞蓟素中分离的异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A这两种非对映异构体具有通过细胞周期阻滞和诱导凋亡介导的抗pca活性。[2]

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鉴定和开发针对雄激素和雄激素受体（AR）信号传导的新型无毒植物化学物质仍然是前列腺癌（PCA）控制的优先事项。在本研究中，我们利用人PCA LNCaP（突变AR）、22Rv1（突变AR）和LAPC4（野生型AR）细胞评估异水蓟宾B的抗雄激素作用。异水飞草宾B（10-90微米）可降低LNCaP、22Rv1和LAPC4细胞的AR和前列腺特异性抗原（PSA）水平，但对非肿瘤性人前列腺上皮细胞PWR-1E无影响。异水飞蓟宾B处理还抑制了合成雄激素r1881诱导的AR核定位、PSA表达和细胞生长，并引起G(1)阻滞。在确定AR降解的机制研究中，异水飞蓟宾B引起Akt （Ser-473和Thr-308）和Mdm2 （Ser-166）磷酸化增加，这与AR降解有关，PI3K抑制剂（LY294002）预处理可恢复AR水平。此外，激酶死亡Akt的过表达在很大程度上逆转了异水飞蓟宾B介导的AR降解，这表明Akt在AR降解中起关键作用。抗体下拉结果也表明异水飞蓟宾B处理增强Akt、Mdm2和AR之间复合物的形成，促进磷酸化依赖性AR泛素化及其被蛋白酶体降解。总之，目前的研究结果确定了异水飞蓟宾b介导的人类PCA细胞抗癌作用的新机制。[3]

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过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)是葡萄糖和脂质代谢的关键调节因子。这种核受体的激动剂用于治疗2型糖尿病，也被研究作为其他代谢性疾病的潜在治疗方法，包括非酒精性脂肪性肝病。水飞蓟素是一种从水飞蓟种子中提取的浓缩酚类混合物，被广泛用作治疗多种肝脏疾病的辅助剂。本研究对水飞蓟素及其主要成分的PPARγ激活电位进行了研究。异水飞蓟宾A(3)以浓度依赖性的方式引起ppar γ依赖性荧光素酶报告基因的转激活。与PPARγ拮抗剂T0070907共处理后，这种作用可以逆转。硅对接研究表明，3的结合模式不同于无活性水飞蓟素成分，在受体的配体结合域的入口区域与Ser342有一个额外的氢键。因此，异水飞蓟宾A(3)已被确定为第一个黄酮木脂素PPARγ激动剂，表明其作为核受体调节剂的进一步研究。［４］

细胞培养和处理[3]
LNCaP、22Rv1和PWR-1E细胞按照前面描述的方法进行培养（Deep et al., 2007）， LAPC4细胞在Iscoves改良的Dulbecco培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（P-S）。用不同浓度(10-90 μM) 的异水飞蓟宾B，和/或异水飞蓟宾A、水飞蓟宾A和水飞蓟宾B （90 μM）二甲亚砜（DMSO）处理细胞一段时间。在包括对照在内的每个处理中均存在等量的DMSO（媒介物），不超过0.1% （v/v）。LNCaP细胞在含10% cFBS和1% P-S的无酚红培养基中，加或不加合成雄激素R1881培养4 d，再加入Isosilybin BB培养24 h。分别收集培养基样品，处理细胞进行全细胞裂解液、细胞质和细胞核提取物、FACS分析或前面提到的细胞活力测定(Muller等人，1989；Zi et al., 1998；Zi和Agarwal， 1999)。

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Western免疫印迹，蛋白结合和激酶测定[3]
对于western blotting，每个样品40-70 μg的蛋白质在2 × sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）样品缓冲液中变性，然后在6、8或12%聚丙烯酰胺三甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE，然后按照前面的描述进行免疫印迹(Muller等，1989；Zi et al., 1998)。蛋白质-蛋白质结合研究如前所述（Zi et al., 1998）。Akt的激酶活性测定是根据供应商的协议进行的，并进行了一些修改（Dhanalakshmi等人，2005）。

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免疫荧光染色及共聚焦成像[3]
LNCaP细胞在含10% cFBS的无酚红培养基中4室载玻片中生长，用Isosilybin B (90 μM)或DMSO预处理120 min，然后用合成雄性激素R1881 （1 nM）预处理150 min。然后将细胞在2%多聚甲醛中于4°C下固定过夜，用0.1% Triton X-100渗透15分钟，然后用山羊血清孵育。用含0.25% BSA的PBS洗涤细胞，用AR抗体孵育1小时，再用荧光素标记的二抗孵育45分钟，DAPI反染色5分钟。在尼康倒置共聚焦显微镜上，使用488/402 nm激光波长以× 400倍率捕获细胞图像，分别检测荧光素和DAPI的发射。

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转染[3]< br > 按照供应商的方案，使用GeneJuice转染LNCaP细胞。简单地说，将细胞置于60 mm培养皿中，以约50-60%的合流度转染，其中0.5 μg的pCMV5-HA cAkt KM（激酶突变体）或pCMV5-HA（对照）与GeneJuice/无血清培养基混合物孵育15分钟，然后滴注到细胞中。转染24 h后用DMSO或异水蓟宾B处理细胞，24 h后制备细胞裂解物。

[1]. Milk thistle's active components silybin and isosilybin: novel inhibitors of PXR-mediated CYP3A4 induction. Drug Metab Dispos. 2013 Aug;41(8):1494-504.

[2]. Isosilybin B and isosilybin A inhibit growth, induce G1 arrest and cause apoptosis in human prostate cancer LNCaP and 22Rv1 cells. Carcinogenesis. 2007 Jul;28(7):1533-42.

[3]. Isosilybin B causes androgen receptor degradation in human prostate carcinoma cells via PI3K-Akt-Mdm2-mediated pathway. Oncogene. 2008 Jun 26;27(28):3986-98.

[4]. Identification of isosilybin a from milk thistle seeds as an agonist of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Nat Prod. 2014 Apr 25;77(4):842-7.

Isosilybin is a flavonolignan isolated from Silybum marianum. It has a role as a plant metabolite. It is a flavonolignan, a polyphenol, a member of guaiacols and a secondary alpha-hydroxy ketone.
(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one has been reported in Silybum marianum with data available.
See also: Isosilybin B (annotation moved to).

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Because cancer is often treated with combination therapy, unexpected pharmacological effects can occur because of drug-drug interactions. Several drugs are able to cause upregulation or downregulation of drug transporters or cytochrome P450 enzymes, particularly CYP3A4. Induction of CYP3A4 may result in decreased plasma levels and therapeutic efficacy of anticancer drugs. Since the pregnane X receptor (PXR) is one of the major transcriptional regulators of CYP3A4, PXR antagonists can possibly prevent CYP3A4 induction. Currently, a limited number of PXR antagonists are available. Some of these antagonists, such as sulphoraphane and coumestrol, belong to the so-called complementary and alternative medicines (CAM). Therefore, the aim was to determine the potential of selected CAM (β-carotene, Echinacea purpurea, garlic, Ginkgo biloba, ginseng, grape seed, green tea, milk thistle, saw palmetto, valerian, St. John's Wort, and vitamins B6, B12, and C) to inhibit PXR-mediated CYP3A4 induction at the transcriptional level, using a reporter gene assay and a real-time polymerase chain reaction assay in LS180 colon adenocarcinoma cells. Furthermore, computational molecular docking and a LanthaScreen time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) PXR competitive binding assay were performed to explore whether the inhibiting CAM components interact with PXR. The results demonstrated that milk thistle is a strong inhibitor of PXR-mediated CYP3A4 induction. The components of milk thistle responsible for this effect were identified as silybin and isosilybin. Furthermore, computational molecular docking revealed a strong interaction between both silybin and isosilybin and PXR, which was confirmed in the TR-FRET PXR assay. In conclusion, silybin and isosilybin might be suitable candidates to design potent PXR antagonists to prevent drug-drug interactions via CYP3A4 in cancer patients.[1]

C25H22O10

482.4362

482.121

72581-71-6

Silybin A;22888-70-6;Silybin;802918-57-6;Silybin B;142797-34-0

21723007

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

793.0±60.0 °C at 760 mmHg

274.5±26.4 °C

0.0±2.9 mmHg at 25°C

1.684

2.59

155.14

5

10

4

35

750

2

COC1=C(C=CC(=C1)C2C(OC3=C(O2)C=CC(=C3)[C@@H]4[C@H](C(=O)C5=C(C=C(C=C5O4)O)O)O)CO)O

FDQAOULAVFHKBX-DBMPWETRSA-N

InChI=1S/C25H22O10/c1-32-17-6-11(2-4-14(17)28)24-20(10-26)33-18-7-12(3-5-16(18)34-24)25-23(31)22(30)21-15(29)8-13(27)9-19(21)35-25/h2-9,20,23-29,31H,10H2,1H3/t20?,23-,24?,25+/m0/s1

(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one

Isosilybin; 72581-71-6; 3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one; 3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one; 4H-1-Benzopyran-4-one, 2-(2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-1,4-benzodioxin-6-yl)-2,3-dihydro-3,5,7-trihydroxy-; CHEBI:80744; 3,5,7-trihydroxy-2-(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2,3-dihydrochromen-4-one; 3,5,7-trihydroxy-2-(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~207.28 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。