CYP3A4 (IC50 = 74 μM); natural flavonoid from Silybum marianum

报告基因检测表明，水飞蓟成分水飞蓟宾和异水飞蓟宾负责抑制水飞蓟中PXR介导的CYP3A4激活。与水飞蓟宾相比，其异构体异水飞蓟宾是 PXR 介导的 CYP3A4 激活的更强抑制剂。 89、133 和 200 μM 的异水飞蓟宾溶液分别显着降低 CYP3A4 诱导 64%、82% 和 88%。 Isosilybin 抑制 CYP3A4 诱导，IC50 为 74 μM[1]。异水飞蓟宾 B 和异水飞蓟宾 A 是从水飞蓟素中获得的两种非对映异构体，具有通过细胞周期停滞和细胞凋亡激活介导的抗前列腺癌 (PCA) 作用。使用异水飞蓟宾 B 和异水飞蓟宾 A 治疗会导致人前列腺癌 LNCaP 和 22Rv1 细胞的生长抑制和细胞死亡，以及显着的 G(1) 停滞和细胞凋亡 [2]。异水飞蓟宾 B 会增强 Akt（Ser-473 和 Thr-308）和 Mdm2（Ser-166）的磷酸化，这与用 PI3K 抑制剂 (LY294002) 预处理恢复雄激素受体水平是一致的。与身体退化有关。异水飞蓟宾 B 疗法可以加速 Akt、Mdm2 和 AR 之间复合物的形成，从而促进磷酸化依赖性 AR 泛素化以及随后被蛋白酶体破坏 [3]。异水飞蓟宾 A 在 30 μM 剂量下强烈激活 PPARγ（2.08±0.48 倍，p<0.01）。 Isosilybin A 以浓度依赖性方式刺激 PPARγ 依赖性荧光素酶报告基因的反式激活。计算机对接研究表明，3的结合方式与非活性水飞蓟素成分不同，在受体配体结合域的入口区与Ser342存在额外的氢键[4]。

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水飞蓟中产生这种作用的成分被鉴定为水飞蓟宾和异水飞蓟宾。此外，计算分子对接显示水飞蓟宾和异水飞蓟宾与PXR之间存在很强的相互作用，这在TR-FRET PXR实验中得到了证实。综上所述，水飞蓟宾和异水飞蓟宾可能是设计有效的PXR拮抗剂的合适人选，以防止癌症患者通过CYP3A4药物相互作用。[1]

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水飞蓟素及其成分水飞蓟宾素对前列腺癌（PCA）有较强的治疗作用；然而，水飞蓟素的其他成分的抗癌功效和相关机制在很大程度上是未知的，水飞蓟素是黄酮木质素的混合物。本研究从水飞蓟素中分离得到两种纯化合物异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A，对人前列腺癌LNCaP和22Rv1细胞的抗癌作用进行了评价。异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A处理导致两种细胞系的生长抑制和细胞死亡，并伴有强烈的G(1)阻滞和凋亡。在检测细胞周期和凋亡调节因子变化的研究中，异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A导致细胞周期蛋白（D1, D3， E和A）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk2， Cdk4和细胞分裂周期25A）的水平降低，但导致p21， p27和p53水平升高，除了在22Rv1细胞中异水飞蓟宾B导致p21蛋白水平降低。异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾a诱导的细胞凋亡伴随着聚adp核糖聚合酶、caspase-9和caspase-3裂解的增加和survivin水平的降低。与LNCaP和22Rv1细胞相比，异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A在非肿瘤性人前列腺上皮细胞PWR-1E中的抗增殖和细胞毒潜能要小得多，这表明这些化合物具有转化选择性作用。本研究首次发现从水飞蓟素中分离的异水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A这两种非对映异构体具有通过细胞周期阻滞和诱导凋亡介导的抗pca活性。[2]

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鉴定和开发针对雄激素和雄激素受体（AR）信号传导的新型无毒植物化学物质仍然是前列腺癌（PCA）控制的优先事项。在本研究中，我们利用人PCA LNCaP（突变AR）、22Rv1（突变AR）和LAPC4（野生型AR）细胞评估异水蓟宾B的抗雄激素作用。异水飞草宾B（10-90微米）可降低LNCaP、22Rv1和LAPC4细胞的AR和前列腺特异性抗原（PSA）水平，但对非肿瘤性人前列腺上皮细胞PWR-1E无影响。异水飞蓟宾B处理还抑制了合成雄激素r1881诱导的AR核定位、PSA表达和细胞生长，并引起G(1)阻滞。在确定AR降解的机制研究中，异水飞蓟宾B引起Akt （Ser-473和Thr-308）和Mdm2 （Ser-166）磷酸化增加，这与AR降解有关，PI3K抑制剂（LY294002）预处理可恢复AR水平。此外，激酶死亡Akt的过表达在很大程度上逆转了异水飞蓟宾B介导的AR降解，这表明Akt在AR降解中起关键作用。抗体下拉结果也表明异水飞蓟宾B处理增强Akt、Mdm2和AR之间复合物的形成，促进磷酸化依赖性AR泛素化及其被蛋白酶体降解。总之，目前的研究结果确定了异水飞蓟宾b介导的人类PCA细胞抗癌作用的新机制。[3]

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过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)是葡萄糖和脂质代谢的关键调节因子。这种核受体的激动剂用于治疗2型糖尿病，也被研究作为其他代谢性疾病的潜在治疗方法，包括非酒精性脂肪性肝病。水飞蓟素是一种从水飞蓟种子中提取的浓缩酚类混合物，被广泛用作治疗多种肝脏疾病的辅助剂。本研究对水飞蓟素及其主要成分的PPARγ激活电位进行了研究。异水飞蓟宾A(3)以浓度依赖性的方式引起ppar γ依赖性荧光素酶报告基因的转激活。与PPARγ拮抗剂T0070907共处理后，这种作用可以逆转。硅对接研究表明，3的结合模式不同于无活性水飞蓟素成分，在受体的配体结合域的入口区域与Ser342有一个额外的氢键。因此，异水飞蓟宾A(3)已被确定为第一个黄酮木脂素PPARγ激动剂，表明其作为核受体调节剂的进一步研究。［４］

细胞培养和处理[3]
LNCaP、22Rv1和PWR-1E细胞按照前面描述的方法进行培养（Deep et al., 2007）， LAPC4细胞在Iscoves改良的Dulbecco培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（P-S）。用不同浓度(10-90 μM) 的异水飞蓟宾B，和/或异水飞蓟宾A、水飞蓟宾A和水飞蓟宾B （90 μM）二甲亚砜（DMSO）处理细胞一段时间。在包括对照在内的每个处理中均存在等量的DMSO（媒介物），不超过0.1% （v/v）。LNCaP细胞在含10% cFBS和1% P-S的无酚红培养基中，加或不加合成雄激素R1881培养4 d，再加入Isosilybin BB培养24 h。分别收集培养基样品，处理细胞进行全细胞裂解液、细胞质和细胞核提取物、FACS分析或前面提到的细胞活力测定(Muller等人，1989；Zi et al., 1998；Zi和Agarwal， 1999)。

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Western免疫印迹，蛋白结合和激酶测定[3]
对于western blotting，每个样品40-70 μg的蛋白质在2 × sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）样品缓冲液中变性，然后在6、8或12%聚丙烯酰胺三甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE，然后按照前面的描述进行免疫印迹(Muller等，1989；Zi et al., 1998)。蛋白质-蛋白质结合研究如前所述（Zi et al., 1998）。Akt的激酶活性测定是根据供应商的协议进行的，并进行了一些修改（Dhanalakshmi等人，2005）。

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免疫荧光染色及共聚焦成像[3]
LNCaP细胞在含10% cFBS的无酚红培养基中4室载玻片中生长，用Isosilybin B (90 μM)或DMSO预处理120 min，然后用合成雄性激素R1881 （1 nM）预处理150 min。然后将细胞在2%多聚甲醛中于4°C下固定过夜，用0.1% Triton X-100渗透15分钟，然后用山羊血清孵育。用含0.25% BSA的PBS洗涤细胞，用AR抗体孵育1小时，再用荧光素标记的二抗孵育45分钟，DAPI反染色5分钟。在尼康倒置共聚焦显微镜上，使用488/402 nm激光波长以× 400倍率捕获细胞图像，分别检测荧光素和DAPI的发射。

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转染[3]< br > 按照供应商的方案，使用GeneJuice转染LNCaP细胞。简单地说，将细胞置于60 mm培养皿中，以约50-60%的合流度转染，其中0.5 μg的pCMV5-HA cAkt KM（激酶突变体）或pCMV5-HA（对照）与GeneJuice/无血清培养基混合物孵育15分钟，然后滴注到细胞中。转染24 h后用DMSO或异水蓟宾B处理细胞，24 h后制备细胞裂解物。

[1]. Milk thistle's active components silybin and isosilybin: novel inhibitors of PXR-mediated CYP3A4 induction. Drug Metab Dispos. 2013 Aug;41(8):1494-504.

[2]. Isosilybin B and isosilybin A inhibit growth, induce G1 arrest and cause apoptosis in human prostate cancer LNCaP and 22Rv1 cells. Carcinogenesis. 2007 Jul;28(7):1533-42.

[3]. Isosilybin B causes androgen receptor degradation in human prostate carcinoma cells via PI3K-Akt-Mdm2-mediated pathway. Oncogene. 2008 Jun 26;27(28):3986-98.

[4]. Identification of isosilybin a from milk thistle seeds as an agonist of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Nat Prod. 2014 Apr 25;77(4):842-7.

异水飞蓟宾是从水飞蓟（Silybum marianum）中分离得到的一种黄酮木脂素。它是一种植物代谢产物。它是一种黄酮木脂素、多酚、愈创木酚类化合物和仲α-羟基酮。
(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-[2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-(羟甲基)-2,3-二氢-1,4-苯并二恶英-6-基]-2,3-二氢色烯-4-酮已在水飞蓟中被报道，并有相关数据。
另见：异水飞蓟宾B（注释已移至）。

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由于癌症治疗通常采用联合疗法，药物相互作用可能导致意想不到的药理作用。一些药物能够引起药物转运蛋白或细胞色素P450酶（尤其是CYP3A4）的上调或下调。 CYP3A4的诱导可能导致抗癌药物的血浆浓度降低，从而降低其治疗效果。由于孕烷X受体（PXR）是CYP3A4的主要转录调控因子之一，PXR拮抗剂可能抑制CYP3A4的诱导。目前，可用的PXR拮抗剂种类有限。其中一些拮抗剂，例如萝卜硫素和香豆雌酚，属于所谓的补充和替代医学（CAM）药物。因此，本研究旨在利用报告基因检测和实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测，在LS180结肠腺癌细胞中，确定几种选定的CAM（β-胡萝卜素、紫锥菊、大蒜、银杏、人参、葡萄籽、绿茶、水飞蓟、锯棕榈、缬草、圣约翰草以及维生素B6、B12和C）在转录水平上抑制PXR介导的CYP3A4诱导的潜力。此外，还进行了计算机分子对接和LanthaScreen时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）PXR竞争性结合实验，以探究这些具有抑制作用的CAM成分是否与PXR相互作用。结果表明，水飞蓟是PXR介导的CYP3A4诱导的强效抑制剂。水飞蓟中负责此作用的成分被鉴定为水飞蓟宾和异水飞蓟宾。此外，计算分子对接结果显示，水飞蓟宾和异水飞蓟宾均与PXR存在强烈的相互作用，这一结果在TR-FRET PXR检测中得到了证实。综上所述，水飞蓟宾和异水飞蓟宾可能是设计强效PXR拮抗剂的合适候选药物，可用于预防癌症患者体内通过CYP3A4途径发生的药物相互作用。[1]

C25H22O10

482.4362

482.121

72581-71-6

Silybin A;22888-70-6;Silybin;802918-57-6;Silybin B;142797-34-0

21723007

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

793.0±60.0 °C at 760 mmHg

274.5±26.4 °C

0.0±2.9 mmHg at 25°C

1.684

2.59

155.14

5

10

4

35

750

2

COC1=C(C=CC(=C1)C2C(OC3=C(O2)C=CC(=C3)[C@@H]4[C@H](C(=O)C5=C(C=C(C=C5O4)O)O)O)CO)O

FDQAOULAVFHKBX-DBMPWETRSA-N

InChI=1S/C25H22O10/c1-32-17-6-11(2-4-14(17)28)24-20(10-26)33-18-7-12(3-5-16(18)34-24)25-23(31)22(30)21-15(29)8-13(27)9-19(21)35-25/h2-9,20,23-29,31H,10H2,1H3/t20?,23-,24?,25+/m0/s1

(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one

Isosilybin; 72581-71-6; 3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one; 3,5,7-trihydroxy-2-[2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one; 4H-1-Benzopyran-4-one, 2-(2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-1,4-benzodioxin-6-yl)-2,3-dihydro-3,5,7-trihydroxy-; CHEBI:80744; 3,5,7-trihydroxy-2-(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2,3-dihydrochromen-4-one; 3,5,7-trihydroxy-2-(2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~207.28 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。