Natural anticancer agent

在 p53 野生型和 p53 肝癌细胞系中，水飞蓟宾 A 强烈增加非甾体抗炎药激活基因 1 (NAG-1) 的表达 [1]。人乳腺癌细胞系 MCF7 和 MDA-MB-231 由水飞蓟宾 A 诱导。水飞蓟宾 A 以时间和剂量依赖性方式抑制 HCC 细胞活力 [3]。水飞蓟宾 A 会增加琼脂相关蛋白 Bax，同时减少 RBP-Jκ、Hes1 和 Notch1 胞内结构域 (NICD) 蛋白。减少细胞周期蛋白 D1、生存素和 Bcl2[3]。

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水飞蓟宾是一种有效的抗癌和化学预防剂，已被证明对癌细胞具有多种作用，包括抑制细胞增殖和迁移。然而，导致这些效应的分子机制尚未完全了解。我们观察到水飞蓟宾显著诱导非甾体抗炎药激活基因-1 （NAG-1）在p53野生型和p53缺失癌细胞系中的表达，提示水飞蓟宾诱导的NAG-1上调是p53不依赖的方式。水飞蓟宾上调早期生长反应-1 （EGR-1）表达。EGR-1的异位表达显著增加了NAG-1启动子活性和NAG-1蛋白的表达，并呈剂量依赖性。此外，使用siRNA下调EGR-1表达可显著降低水飞蓟宾介导的NAG-1表达，表明EGR-1的表达对水飞蓟宾诱导的NAG-1表达至关重要。我们还观察到水飞蓟宾产生活性氧（ROS）；然而，ROS不影响水飞蓟宾诱导的NAG-1表达和细胞凋亡。此外，我们证明了丝裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）信号转导途径参与水飞蓟宾诱导的NAG-1表达。p38 MAP激酶（SB203580）抑制剂可减弱水飞蓟宾诱导的NAG-1表达。此外，我们发现sirna介导的NAG-1敲低可减弱水飞蓟宾诱导的细胞凋亡。综上所述，本研究的结果首次证明了NAG-1的上调有助于水飞蓟宾诱导的癌细胞凋亡。[1]

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本研究旨在确定水飞蓟宾诱导人乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231细胞死亡的潜在机制。抗氧化剂、n-乙酰半胱氨酸（NAC）和6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2-羧酸均能减轻水飞蓟宾诱导的细胞死亡，提示水飞蓟宾的作用依赖于活性氧（ROS）的产生。Western blot分析显示，水飞蓟宾可诱导细胞外信号调节激酶（ERK）和Akt下调。当细胞瞬时转染组成活性（ca）丝裂原活化蛋白激酶（MEK）， ERK和caAkt的上游激酶时，它们对水飞蓟宾诱导的细胞死亡表现出抗性。水飞蓟宾降低了Notch-1 mRNA的切割和蛋白水平。notch -1过表达的细胞对水飞蓟宾诱导的细胞死亡具有抗性。Notch-1信号的抑制依赖于ros的生成。Notch-1过表达可阻止水飞蓟宾诱导的ERK和Akt磷酸化抑制。水飞蓟宾诱导的细胞死亡伴随着caspase-3切割的增加，在MDA-MB-231细胞中，caspase-3抑制剂可以阻止这种现象，但在MCF7细胞中没有。水飞蓟宾可诱导NAC阻断的凋亡诱导因子（AIF）易位，并转染caMEK和caAkt。MCF7细胞可通过使用小干扰AIF RNA沉默AIF表达来阻止水飞蓟宾诱导的细胞死亡，而MDA-MB-231细胞则不能。综上所述，水飞蓟宾在MCF7细胞中通过aif依赖机制诱导细胞死亡，在MDA-MB-231细胞中通过caspase-3依赖机制诱导细胞死亡，ROS生成和Notch-1信号通路在ERK和Akt通路上游作用。这些数据表明水飞蓟宾可能是一种潜在的诱导人乳腺癌细胞凋亡的药物。[2]

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肝细胞癌（HCC）是一种全球性的健康负担，与有限的治疗选择和不良的患者预后有关。水飞蓟宾（Silybin， SIL）是一种从水飞蓟植物（Silybum marianum）中提取的抗氧化剂，据报道在体内和体外均具有保护肝脏和抗肿瘤的作用。虽然SIL已被证明对包括HCC在内的各种类型的癌症具有有效的抗肿瘤活性，但其作用的分子机制仍在很大程度上未知。Notch信号通路在肿瘤发生和免疫发育中起着至关重要的作用。在本研究中，我们在体外和体内评估了SIL对人肝癌HepG2细胞的抗肿瘤活性，并探讨了Notch通路和凋亡相关信号通路对SIL活性的作用。SIL治疗导致HCC细胞活力的剂量和时间依赖性抑制。此外，SIL具有很强的抗肿瘤活性，不仅可以降低肿瘤细胞的粘附、迁移、细胞内谷胱甘肽（GSH）水平和总抗氧化能力（T-AOC），还可以增加凋亡指数、caspase3活性和活性氧（ROS）。此外，SIL处理可降低Notch1细胞内结构域（NICD）、RBP-Jκ和Hes1蛋白的表达，上调凋亡通路相关蛋白Bax，下调Bcl2、survivin和cyclin D1的表达。Notch1 siRNA（体外）或DAPT（体内已知的Notch1抑制剂）进一步增强SIL的抗肿瘤活性，重组Jagged1蛋白（体外已知的Notch配体）减弱SIL的抗肿瘤活性。综上所述，这些数据表明SIL是靶向Notch信号通路的HCC细胞生长的有效抑制剂，并提示抑制Notch信号通路可能是HCC的一种新的治疗干预措施 [3]。

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水飞蓟宾对葡萄糖诱导的小鼠足细胞超氧化物生成的影响[5]
采用DHE荧光和共聚焦显微镜观察水飞蓟宾对hg诱导的小鼠足细胞内ROS生成的影响。如图1A所示，足细胞暴露于HG导致细胞内ROS生成增加70%，而这种增加被10 μM水飞蓟宾共孵育的细胞完全抑制。通过高效液相色谱法对DHE的超氧化物特异性产物2-OH-E+的生成进行定量分析。足细胞暴露于HG后，2-OH-E+的产量增加了60%，与水飞蓟宾共孵育消除了这种影响（图1B）。图1C显示了对水飞蓟宾的剂量依赖性反应；0.1 μM水飞蓟宾可部分抑制hg诱导的2-OH-E+的生成，而1和10 μM水飞蓟宾可完全抑制2-OH-E+的生成。

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水飞蓟宾对葡萄糖诱导足细胞NADPH氧化酶活性的影响[5]
由于Nox家族的NADPH氧化酶是肾细胞（包括足细胞）中超氧化物的主要来源，我们在与上述相同的实验条件下，使用lucigenin增强化学发光法评估了足细胞中NADPH氧化酶的活性。将细胞暴露于HG 24小时后，NADPH依赖性超氧化物的产生增加了90%。水飞蓟宾处理完全抑制HG诱导的NADPH氧化酶活性的增加（图2A）。Western blot分析显示，水飞蓟宾处理完全抑制hg介导的Nox4蛋白表达增加（图2B）。对Nox1的分析也得到了类似的结果，尽管该蛋白的组成和hg诱导的表达比Nox4弱（图2C）。

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水飞蓟宾对葡萄糖诱导足细胞损伤的影响。[5]
细胞凋亡是糖尿病足细胞损伤的表现之一。通过两种不同的方法，Hoechst染色法和DNA片段法检测足细胞凋亡（20）。Hoechst染色（图3A）显示，与NG相比，将足细胞暴露于HG 24小时可导致显著的足细胞凋亡，而水飞蓟宾可防止HG诱导的足细胞凋亡。同样，水飞蓟宾完全阻止了HG诱导足细胞凋亡的DNA断裂（图3B）。

中东地区局部应用水飞蓟宾A（水飞蓟宾A），剂量为9 mg/只，可有效抑制氧化、灭活介质、预防肿瘤发生[4]。超氧化物的产生增加，并且 Nox4 的表达高于小鼠皮质。用水飞蓟宾 A 治疗的小鼠没有表现出对照 OVE26 小鼠肾小球中观察到的 35% 足细胞残留 [5]。

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水飞蓟宾A (Silibinin A)对肿瘤异种移植物体内的影响[3]
进一步进行了体内肿瘤异种移植实验来验证我们之前的体内实验。为了确定水飞蓟宾A (Silibinin A)/SIL是否能抑制动物肿瘤生长，我们在胸腺裸鼠中建立HepG2异种移植。我们发现所有治疗组的小鼠都出现了皮下肿瘤。如图8A和8B所示，与对照组相比，SIL治疗（200或400 mg/kg）显著抑制肿瘤生长（P<0.01）。此外，Western blot分析显示，与对照组相比，SIL治疗可诱导NICD、cyclin D1和survivin的剂量依赖性下调（P<0.01）；图8 c)。与对照组相比，SIL组线粒体凋亡通路相关蛋白Bax上调，Bcl2下调（P<0.01）；图8 c)。

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水飞蓟宾A (Silibinin A)联合DAPT对肿瘤异种移植物体内的影响[3]
DAPT研究Notch信号下调对体内 /SIL /SIL抗肿瘤活性的影响。如图9A、9B所示，与对照组相比，单用SIL或DAPT治疗可显著抑制肿瘤生长（P<0.01或P<0.05）。与SIL或DAPT组相比，SIL联合DAPT组进一步抑制肿瘤生长（P<0.01）。Western blot分析显示，与SIL和DAPT组相比，SIL和DAPT联合治疗进一步降低了NICD、cyclin D1和survivin的表达（P<0.01）；图9 c)。此外，与SIL和D组相比，SIL和DAPT共处理进一步上调了Bax，下调了Bcl2 (P<0.01)；图9 c)。

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水飞蓟宾A (Silibinin A)是存在于水飞蓟（Silybum marianum）中的主要生物活性黄酮木脂素，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性。然而，确切的潜在机制仍有待阐明。本研究旨在探讨水飞蓟宾抗化学诱导的瑞士白化病小鼠皮肤肿瘤发生的潜在分子机制。鉴于核因子κ b （NF-κB）、环氧合酶-2 （COX-2）、iNOS、促炎细胞因子、血管内皮生长因子、氧化应激在癌变过程中的重要作用，从细胞保护酶活性、脂质过氧化、炎症反应等方面研究水飞蓟宾对7,12 -二甲基苯[a]蒽/12- o -十四烷酰基酚-13-乙酸酯诱导的2期皮肤癌的化学预防作用。以及各种分子标记物在皮肤组织中的表达。我们发现，外用水飞蓟宾（9mg /只）能有效抑制氧化应激，解除炎症介质激活和肿瘤发生的调节。因此，本研究结果提示水飞蓟宾的化学预防作用与上调内源性细胞保护机制和下调炎症介质（一氧化氮、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、COX-2、iNOS和NF-κB）有关。[4]

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1型糖尿病小鼠模型的研究。[5]
为了在培养的永生化小鼠足细胞中验证这一发现，我们研究了水飞蓟宾A (Silibinin A)对建立的1型糖尿病小鼠模型OVE26小鼠的影响。这些小鼠出现了人类糖尿病肾病的形态和结构变化特征（63）。研究三组小鼠：1)FVB对照组动物，2)对照糖尿病OVE26小鼠，3)水飞蓟宾治疗OVE26糖尿病小鼠，持续6周。FVB对照动物的血糖水平为130.4±12.4 mg/dl，而OVE26糖尿病组的血糖水平高于检测限（600 mg/dl），无论给药还是水飞蓟宾。

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水飞蓟宾A (Silibinin A)对肾皮质超氧化物生成的影响[5]
采用DHE和HPLC法测定肾皮质超氧化物的生成。糖尿病小鼠肾皮质中2-OH-E+的生成增加，水飞蓟宾处理显著降低了OVE26小鼠中2-OH-E+的增加（图4A）。此外，肾皮质免疫组织化学显示，与FVB对照小鼠相比，OVE26小鼠的Nox4表达增加（图4B）。水飞蓟宾处理阻止了OVE26小鼠中Nox4表达的增加（图4B）。

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水飞蓟宾A (Silibinin A)对蛋白尿的影响[5]
与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠出现了严重的蛋白尿。水飞蓟宾使糖尿病小鼠蛋白尿减少54% (P = 0.06；图5 d)。

条件永生化的小鼠足细胞在生长许可条件下（33°C）在涂有I型胶原的烧瓶中生长至近汇合，并在5% CO2的湿室中重新播种三次。生长培养基为RPMI 1640，含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素/链霉素，5 mM d-葡萄糖（NG）。在培养液中添加50 U/ml的小鼠干扰素-γ (INF-γ)，在第1代和第2代和第3代分别添加10 U/ml的INF-γ。然后将细胞在不含INF-γ的含血清培养基中于37°C非允许条件下传代培养10-14天（46）。实验前用含NG和0.2%牛血清白蛋白的RPMI 1640对细胞进行血清饥饿处理24 h。实验采用水飞蓟宾A (Silibinin A)终浓度为10 μM或载药隔夜预处理。然后将细胞暴露于NG或25 mM d-葡萄糖（HG）中，有或没有水飞蓟宾A（水飞蓟宾A），持续24小时。[5]

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细胞培养与处理[3]
人肝癌HepG2细胞在Dulbecco改良Eagle培养基 中培养，培养基中添加10%胎牛血清、l -谷氨酰胺（2mm）、青霉素（100单位/ml）、链霉素（100单位/ml）和HEPES （25 mM）。细胞在37°C 5% CO2存在下保存。在指定的时间段内，用不同浓度的<强>水飞蓟宾A（水飞蓟宾A）水飞蓟宾A（50、100和200µM溶解在DMSO中）处理细胞。在包括对照在内的每个处理中均存在等量的二甲基亚砜（媒介物）；各处理DMSO浓度均未超过0.1% （v/v）。

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细胞凋亡分析[3]
采用FITC-Annexin V/PI染色试剂盒检测HepG2细胞凋亡。水飞硅宾A (Silibinin A)处理后，收获细胞，在冰冷的PBS中洗涤，用荧光素偶联的Annexin V和PI孵卵15分钟，使用配备FACStation数据管理系统和Cell Quest软件的FACScan流式细胞仪进行分析。

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细胞内活性氧（ROS）生成、GSH水平和T-AOC 分析[3]
细胞内ROS的测定是基于ROS介导的非荧光2 ',7 ' -DCFH-DA转化为荧光DCFH。水飞蓟宾A (Silibinin A)处理后，胰蛋白酶化细胞，然后在PBS中与DCFH- da（20µM）在37℃下孵育2 h。孵育后，使用FLX 800微孔板荧光仪测量每孔细胞的DCFH荧光，发射波长为530 nm，激发波长为485 nm。在无细胞条件下确定背景，对照组的荧光强度定义为100%。细胞内还原性GSH的产生、细胞还原性能力的指标和T-AOC根据制造商的推荐说明使用适当的试剂盒进行测量。对照组GSH水平和T-AOC均为100%。

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细胞粘附和迁移分析[3]
在我们的初步实验中，我们发现水飞蓟宾A (Silibinin A)/SIL（浓度小于20µM）处理24 h对HepG2细胞增殖没有影响。因此，我们进行了24小时<强>水飞蓟宾A（水飞蓟宾A）处理（5、10和20µM）的粘附和迁移实验。这些试验按前面所述进行。在 /SIL /SIL的水飞蓟宾A （Silibinin A）处理后，将细胞离心，并在含有10%胎牛血清的基础培养基中重悬。处理后的细胞（1×104细胞/孔）置于96孔板中，37℃孵育30分钟。细胞粘附30分钟后，用PBS轻轻洗涤3次。对贴壁细胞进行MTT染色，倒置相差显微镜下观察。使用BX61相机拍摄照片。最后，每孔加入100µL DMSO， 37℃摇匀孵育15 min。用SpectraMax 190分光光度计在490 nm处测量孔，对照组OD值设为100%。 采用细胞培养创面愈合实验分析细胞迁移。将细胞培养至合流，用200µl微管针尖在合流单层上形成线状创口。然后用PBS洗涤细胞以消除离体细胞。用 /SIL（5、10、20µM）浓度/SIL处理24 h后，在显微镜下观察创口边缘运动情况。结果表示为划痕两侧细胞之间的距离。

OVE26 mice were used as a model of type 1 diabetes mellitus and FVB mice as nondiabetic control animals. At 6 wk of age, mice were started on an animal protein-based diet (Teklad irradiated global soy protein-free extruded rodent diet-2920X) and animals were provided food and water ad libitum; at 10 wk they were started on 100 mg/kg Silybin A (Silibinin A) or vehicle given intraperitoneally for 6 wk (6 animals in each group). Urine collections were done in metabolic cages, and the urine albumin-to-creatinine ratio was measured using commercial kits for mouse albumin and creatinine. Blood glucose was measured using a glucose meter with detection range 10–600 mg/dl. The animals were killed by exsanguination under anesthesia. The cortex of one kidney was flash-frozen in liquid nitrogen for microscopy and image analysis, while the contralateral organ was fixed in 10% formalin for 24 h and then embedded in paraffin for immunohistochemistry. [5]

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Antitumor Activity in a Xenograft Model [3]
Male athymic nude mice were used. All surgeries were performed under sodium pentobarbital anesthesia, and all efforts were made to minimize animal suffering. HepG2 cell tumor xenografts were established by subcutaneously injecting 1×106 cells into the right flanks of 4 to 6-week-old male athymic nude mice. Based on the data from a pilot study, we initiated treatment when the tumor volumes reached approximately 100 mm3. The tumor volumes (V) were calculated with the following formula: V = A×B2/2 (A = largest diameter; B = smallest diameter). First, the mice were randomly divided into 3 groups (n = 6 per group): control (saline) and Silybin A (Silibinin A) at either 200 or 400 mg/kg body weight, 5 days/week, suspended in saline and fed by oral gavage. Next, the mice were randomly divided into control, Silybin A (Silibinin A), DAPT+Silybin A (Silibinin A), and DAPT groups (n = 6). Silybin A (Silibinin A) was orally administered to the mice at doses of 400 mg/kg body weight per day (5 days/week); DAPT (10 mg/kg) or control (0.05% DMSO) was diluted with saline and administered intraperitoneally (5 days/week). Tumor sizes were measured every 3 days using calipers (days 2, 5, 8, 11, 14, 17, and 20). On day 20, tumors were excised from euthanized mice for Western blot analysis.

Metabolism / Metabolites
Silybin has known human metabolites that include O-demethylated-silybin.

31553 mouse LD50 intravenous 1056 mg/kg Yaoxue Tongbao. Bulletin of Pharmacology., 18(404), 1983
31553 rabbit LDLo unreported 300 mg/kg Yaoxue Tongbao. Bulletin of Pharmacology., 18(404), 1983

[1]. Silibinin induces apoptosis of HT29 colon carcinoma cells through early growth response-1 (EGR-1)-mediated non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1 (NAG-1) up-regulation. Chem Biol Interact. 2014 Jan 16;211C:36-43.

[2]. Silibinin induces cell death through ROS-dependent down-regulation of Notch-1/ERK/Akt signaling in human breast cancer cells. J Pharmacol Exp Ther. 2014 May;349(2):268-78.

[3]. Silybin-mediated inhibition of Notch signaling exerts antitumor activity in human hepatocellular carcinoma cells. PLoS One. 2013 Dec 27;8(12):e83699.

[4]. Silibinin Inhibits Tumor Promotional Triggers and Tumorigenesis Against Chemically Induced Two-Stage Skin Carcinogenesis in Swiss Albino Mice: Possible Role of Oxidative Stress and Inflammation. Nutr Cancer. 2014;66(2):249-58.

[5]. The antioxidant silybin prevents high glucose-induced oxidative stress and podocyte injury in vitro and in vivo. Am J Physiol Renal Physiol. 2013 Sep 1;305(5):F691-700.

Silibinin is a flavonolignan isolated from milk thistle, Silybum marianum, that has been shown to exhibit antioxidant and antineoplastic activities. It has a role as an antioxidant, an antineoplastic agent, a hepatoprotective agent and a plant metabolite. It is a flavonolignan, a polyphenol, an aromatic ether, a benzodioxine and a secondary alpha-hydroxy ketone.
Silibinin is the major active constituent of silymarin, a standardized extract of the milk thistle seeds, containing a mixture of flavonolignans consisting of silibinin, isosilibinin, silicristin, silidianin and others. Silibinin is presented as a mixture of two diastereomers, silybin A and silybin B, which are found in an approximately equimolar ratio. Both in vitro and animal research suggest that silibinin has hepatoprotective (antihepatotoxic) properties that protect liver cells against toxins. Silibinin has also demonstrated in vitro anti-cancer effects against human prostate adenocarcinoma cells, estrogen-dependent and -independent human breast carcinoma cells, human ectocervical carcinoma cells, human colon cancer cells, and both small and nonsmall human lung carcinoma cells.
Silibinin has been reported in Aspergillus iizukae, Silybum eburneum, and other organisms with data available.
Silymarin is a mixture of flavonolignans isolated from the milk thistle plant Silybum marianum. Silymarin may act as an antioxidant, protecting hepatic cells from chemotherapy-related free radical damage. This agent may also promote the growth of new hepatic cells. (NCI04)
The major active component of silymarin flavonoids extracted from seeds of the MILK THISTLE, Silybum marianum; it is used in the treatment of HEPATITIS; LIVER CIRRHOSIS; and CHEMICAL AND DRUG INDUCED LIVER INJURY, and has antineoplastic activity; silybins A and B are diastereomers.

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Drug Indication
Currently being tested as a treatment of severe intoxications with hepatotoxic substances, such as death cap (Amanita phalloides) poisoning.

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Podocyte injury, a major contributor to the pathogenesis of diabetic nephropathy, is caused at least in part by the excessive generation of reactive oxygen species (ROS). Overproduction of superoxide by the NADPH oxidase isoform Nox4 plays an important role in podocyte injury. The plant extract silymarin is attributed antioxidant and antiproteinuric effects in humans and in animal models of diabetic nephropathy. We investigated the effect of silybin, the active constituent of silymarin, in cultures of mouse podocytes and in the OVE26 mouse, a model of type 1 diabetes mellitus and diabetic nephropathy. Exposure of podocytes to high glucose (HG) increased 60% the intracellular superoxide production, 90% the NADPH oxidase activity, 100% the Nox4 expression, and 150% the number of apoptotic cells, effects that were completely blocked by 10 μM silybin. These in vitro observations were confirmed by similar in vivo findings. The kidney cortex of vehicle-treated control OVE26 mice displayed greater Nox4 expression and twice as much superoxide production than cortex of silybin-treated mice. The glomeruli of control OVE26 mice displayed 35% podocyte drop out that was not present in the silybin-treated mice. Finally, the OVE26 mice experienced 54% more pronounced albuminuria than the silybin-treated animals. In conclusion, this study demonstrates a protective effect of silybin against HG-induced podocyte injury and extends this finding to an animal model of diabetic nephropathy.[5]

C25H22O10

482.44

482.121

C, 62.24; H, 4.60; O, 33.16

22888-70-6

Isosilybin;72581-71-6;Silybin;802918-57-6;Silybin B;142797-34-0;Silymarin;65666-07-1

31553

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

793.0±60.0 °C at 760 mmHg

164-174°C

274.5±26.4 °C

0.0±2.9 mmHg at 25°C

1.684

2.59

155.14

5

10

4

35

750

4

COC1=C(C=CC(=C1)[C@@H]2[C@H](OC3=C(O2)C=C(C=C3)[C@@H]4[C@H](C(=O)C5=C(C=C(C=C5O4)O)O)O)CO)O

SEBFKMXJBCUCAI-HKTJVKLFSA-N

InChI=1S/C25H22O10/c1-32-17-6-11(2-4-14(17)28)24-20(10-26)33-16-5-3-12(7-18(16)34-24)25-23(31)22(30)21-15(29)8-13(27)9-19(21)35-25/h2-9,20,23-29,31H,10H2,1H3/t20-,23+,24-,25-/m1/s1

(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-[(2R,3R)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydrochromen-4-one

Silybin; Silibinin; silibinin; Silybin; 22888-70-6; Silybin A; Silibinin A; Silymarin I; Flavobin; Silibinine; Flavobin

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~518.20 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。