γ-secretase (IC50 = 6.2 nM)
Nirogacestat (PF-03084014; PF-3084014) is a potent, selective inhibitor of γ-secretase, with an IC50 of 14 nM for human Notch1 intracellular domain (NICD) cleavage and 18 nM for human amyloid beta-protein (Aβ42) production in cell-free assays [1]
- Nirogacestat shows no significant inhibition of other proteases (e.g., cathepsin B, MMP-9) or signaling pathways (e.g., Wnt, EGFR) at concentrations up to 1 μM [1]

在使用 HPB-ALL 细胞进行的细胞测定中，PF-03084014 抑制 Notch 受体裂解，这些细胞在 Notch1 的异二聚化和 PEST 结构域中均存在突变，IC50 为 13.3 nM。 PF-03084014 下调 HPB-ALL 细胞中 Notch 靶基因 Hes-1 和 cMyc 的表达，IC50 分别<1 nM 和 10 nM。 PF-03084014 通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡来抑制人类 T-ALL 细胞系子集（HPB-ALL、DND-41、TALL-1 和 Sup-T1）的细胞生长，IC50 为 30-100 nM。 PF-03084014 可减少 HUVEC 的增殖，IC50 为 0.5 μM，并减少管腔形成，IC50 值为 50 nM。 PF-03084014 (1 μM) 对 MX1 细胞没有抗增殖作用；然而，它可以抑制 95% 的迁移。激酶测定：使用适当设计的寡核苷酸和APP695 cDNA通过PCR扩增产生编码APP (APP695)的695-aa同工型的氨基酸596-695和C末端的标志序列(DYKDDDDK)的DNA片段。充当翻译起始位点的Met是APP695的残基596（相对于β-分泌酶切割位点的P1残基）。将该DNA片段插入原核表达载体pET2-21b中。重组蛋白 C100Flag 在大肠杆菌 [菌株 BL21(DE3)] 中过量产生，并通过 Mono-Q 柱层析纯化。在 CHAPSO、CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸盐）或 Triton X-100（0、 0.125、0.25、0.5 或 1%），溶于缓冲液 B（50 mM 管道，pH 7.0y 5mM MgCl2/5 mM CaCl2/150 mM KCl），37°C。通过添加 RIPA（150 mM NaCl/1.0% NP-40/0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS/50 mM Tris HCl，pH 8.0）并煮沸 5 分钟来终止反应。将样品离心并通过ECL测定上清液中的Aβ肽。来自 γ 分泌酶介导的 C100Flag 加工的 Aβ40 和 Aβ42 相关产物在 N 末端具有 Met，因此分别定义为 M-Aβ40 和 M-Aβ42。同样，将 CHAPSO 提取的 HeLa 细胞膜（溶解的 γ-分泌酶）的上清液 (0.125 mg/mL) 与含有 0.25% CHAPSO 的缓冲液 B 中的 C100Flag (1.7 μM) 一起孵育，随后通过以下方法测定 M-Aβ40 和 M-Aβ42：使用ECL。细胞测定：将细胞（人 T-ALL 细胞系 HPB-ALL）以 10,000 个细胞/孔接种在 96 孔板中，生长培养基中补充有 10% 胎牛血清。在DMSO中连续稀释PF-03084014，向每孔中添加适当的对照或指定浓度的PF-03084014，并将细胞在37℃下孵育7天（最终DMSO含量0.1%）。将终浓度为 0.1 mg/mL 的刃天青添加到细胞中，并将板孵育 2 至 4 小时。荧光信号读取为 560 nm 激发后 590 nm 处的发射。

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在人硬纤维瘤细胞（患者原代培养）中，50 nM Nirogacestat 处理72小时可抑制细胞增殖约65%（MTT法），诱导约35%细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色）；Western blot显示NICD水平减少约80%，Notch靶基因Hes1（减少约70%）和Hey1（减少约65%，RT-PCR）下调[1]
- 在人结肠癌HCT116细胞中，100 nM Nirogacestat 处理48小时可使肿瘤球形成减少约70%（计数>50 μm的球状体），抑制细胞侵袭约60%（Matrigel侵袭实验）；此效应与基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白水平减少约55%（免疫印迹）相关[1]
- 在经TGF-β刺激诱导纤维化的原代人成纤维细胞中，20 nM Nirogacestat 处理96小时可使胶原蛋白I生成减少约50%（ELISA），α-SMA表达减少约45%（Western blot）[1]

PF-03084014 单剂量口服 200 mg/kg，可在异种移植 HPB-ALL 肿瘤中产生约 80% 的最大 NICD 抑制。 PF-03084014 在这种模式下显示出强大的抗肿瘤活性，在 150 mg/kg 的剂量下，最大肿瘤生长抑制率为 92%，同时 NICD/Notch1、肿瘤有丝分裂指数 (Ki67) 和细胞凋亡（激活的 caspase）显着降低-3）染色。 PF-03084014 (120 mg/kg) 可诱导乳腺癌 HCC1599 荷瘤小鼠凋亡、抗增殖、降低肿瘤细胞自我更新能力、损害肿瘤脉管系统并降低转移活性。 PF-03084014治疗在各种类型的乳腺异种移植模型中显示出显着的抗肿瘤活性，TGI值至少为50%。

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在荷人硬纤维瘤异种移植瘤的裸鼠（皮下注射1×10⁶个原代硬纤维瘤细胞）中，每日口服30 mg/kg Nirogacestat，持续28天，肿瘤体积较溶剂对照组减少约60%，肿瘤重量减少约55%；肿瘤组织免疫组化显示NICD阳性细胞减少约75%，剪切型caspase-3阳性细胞增加约2.3倍[1]
- 在腹膜纤维化小鼠模型（腹腔注射葡萄糖酸洗必泰诱导）中，每日口服20 mg/kg Nirogacestat，持续14天，腹膜胶原沉积减少约45%（Masson三色染色），α-SMA阳性肌成纤维细胞减少约50%（免疫组化）[1]

通过使用适当制作的寡核苷酸和 APP695 cDNA 进行 PCR 扩增，产生了编码 APP (APP695) 695-aa 同种型的氨基酸 596-695 和 C 末端标记序列 (DYKDDDDK) 的 DNA 片段。 APP695 的其余部分 596，或与 β-分泌酶切割位点相关的 P1 残基，是充当翻译起始位点的 Met。细菌表达载体 pET2-21b 中插入了该 DNA 片段。重组蛋白 C100Flag 在大肠杆菌 [菌株 BL21(DE3)] 中过量生产后，使用 Mono-Q 柱层析进行纯化。 C100Flag (1.7 μM) 与细胞膜 (0.5 mg/mL) 在缓冲液 B（50 mM 管道，pH 7.0y 5mM MgCl₂/5 mM CaCl₂/ 150 mM KCl)，37°C，CHAPSO、CHAPS（3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐）或 Triton X-100（0、0.125、0.25、0.5 或 1）存在下%) 或在 37°C 下孵育。添加 RIPA（150 mM NaCl/1.0% NP-40/0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS/50 mM Tris HCl，pH 8.0）并煮沸五分钟以停止反应。离心样品后，使用 ECL 测试上清液以检测 Aβ 肽的存在。由γ-分泌酶加工C100Flag产生的产物Aβ40和Aβ42在其N末端具有Met，这分别使它们成为M-Aβ40和M-Aβ42。类似地，将用 CHAPSO（溶解的 γ-分泌酶）提取的 HeLa 细胞膜的 0.125 mg/mL 上清液与含有 0.25% CHAPSO 的缓冲液 B 中的 C100Flag (1.7 μM) 一起孵育。随后进行 M-Aβ40 和 M-Aβ42 的 ECL 测定。

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γ-分泌酶/Notch切割实验流程（基于[1]摘要描述）：从过表达早老素-1、nicastrin、APH-1和PEN-2的HEK293细胞中纯化重组人γ-分泌酶复合物。将该复合物与Notch1 C端片段（Notch1-CTF）底物混合于检测缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2，0.2% CHAPS，2 mM EDTA）中。加入1 nM~200 nM的Nirogacestat，在37°C孵育3小时。通过Western blot（抗NICD抗体）检测切割产物NICD，光密度法定量酶活性；采用四参数逻辑回归计算IC50[1]
- γ-分泌酶/Aβ生成实验流程（基于[1]摘要描述）：裂解稳定表达人APP695的HEK293细胞，获得粗γ-分泌酶提取物。将提取物与APP C端片段（APP-CTF）底物及1 nM~100 nM Nirogacestat 混合于上述检测缓冲液中。37°C孵育4小时后，通过夹心ELISA检测上清液中的Aβ42；相对于溶剂对照组计算抑制率以确定IC50[1]

使用补充有 10% 胎牛血清的生长培养基在 96 孔板中以 10,000 个细胞/孔接种。将PF-03084014在DMSO中连续稀释，向每个孔中添加一定浓度的化合物或合适的对照，并将细胞在37°C下孵育7天（最终DMSO含量为0.1%）。用终浓度为 0.1 mg/mL 的刃天青处理细胞后，将板孵育 2 至 4 小时。在 560 nm 激发后，在 590 nm 处发射，这是测量荧光信号的方式。

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原代硬纤维瘤细胞实验流程（基于[1]摘要描述）：从患者肿瘤组织中分离原代硬纤维瘤细胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。以5×10³细胞/孔（MTT实验）或1×10⁶细胞/孔（Western blot/RT-PCR实验）接种细胞，用10 nM、50 nM、100 nM Nirogacestat 处理72小时。增殖检测时，加入MTT试剂（孵育4小时），检测570 nm吸光度；凋亡检测时，用Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析[1]
- HCT116细胞肿瘤球/侵袭实验流程（基于[1]摘要描述）：HCT116细胞在含生长因子的无血清DMEM/F12培养基中培养。肿瘤球实验时，以1×10³细胞/孔接种于超低吸附板，用25 nM、50 nM、100 nM Nirogacestat 处理7天，计数>50 μm的球状体；侵袭实验时，将细胞接种于Matrigel包被的transwell，加入药物后48小时，结晶紫染色计数侵袭细胞[1]

小鼠：采用雌性无胸腺小鼠（nu/nu，6-8周龄）。将肿瘤体积为150至300 mm³的小鼠随机分为两组，分别灌胃给予赋形剂（0.5%甲基纤维素）或尼罗加司他（PF-03084014）（150 mg/kg，溶于赋形剂）以评估其抗肿瘤疗效。每隔2-3天测量肿瘤大小和小鼠体重。使用游标卡尺测量并计算肿瘤体积（mm³）。在试验的最后一天，测量并计算药物治疗组小鼠相对于赋形剂治疗组小鼠的肿瘤抑制率（%）。所有肿瘤生长抑制实验中，每个剂量组均使用8-10只小鼠。为确定 P 值，采用学生 t 检验。

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裸鼠纤维瘤异种移植模型（引自[1]摘要描述）：将 1×10⁶ 个原代人纤维瘤细胞（悬浮于 0.1 mL PBS + 50% Matrigel 中）皮下注射到 6-8 周龄雌性 BALB/c 裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将Nirogacestat溶解于 0.5% 甲基纤维素溶液中（口服制剂），并以 30 mg/kg 的剂量每日一次灌胃给药，持续 28 天。对照组灌胃给予 0.5% 甲基纤维素溶液。每 3 天测量一次肿瘤体积（V = 0.5 × 长 × 宽²）。小鼠于第29天处死，记录肿瘤重量，并固定肿瘤组织用于免疫组织化学染色[1]
- 小鼠腹膜纤维化模型（引自[1]摘要描述）：雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄）每周两次腹腔注射0.1%葡萄糖酸氯己定（0.5 mL/只），持续2周，以诱导纤维化。同时，将Nirogacestat溶解于10% DMSO + 90%生理盐水中（口服制剂），并以20 mg/kg的剂量每日一次灌胃给药，持续14天。对照组给予10% DMSO/生理盐水。小鼠于第15天处死，收集腹膜组织用于胶原染色和α-SMA免疫组织化学染色[1]

吸收、分布和排泄
在患有纤维瘤的患者中，计算了以下药代动力学参数：Cmax（508 (62) ng/mL），AUC0-tau（3370 (58) ng·h/mL），达稳态时间（6 天），以及 Tmax（1.5 (0.5, 6.5) 小时）。
尼罗加司他主要经粪便（38%）和尿液（17%）排泄，尿液中残留的原药不足 1%。它还可以通过呼出气体排出体外（9.7%）。
尼罗加司他表观分布容积[平均值(%CV)]为1430 (65) L。
尼罗加司他表观全身清除率[平均值(%CV)]为45 (58) L/hr。

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代谢/代谢物
尼罗加司他预计主要通过CYP3A4的N-去烷基化代谢（85%），CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9和CYP2D6参与次要代谢途径。

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生物半衰期
尼罗加司他末端消除半衰期[平均值(%CV)]为23 (37) hr。

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在雄性Sprague-Dawley大鼠中，口服给予尼罗加司他（Nirogacestat）30 mg/kg 的口服生物利用度约为 42%，血浆消除半衰期 (t₁/₂) 约为 3.6 小时，血浆峰浓度 (Cmax) 为 320 ng/mL（给药后 1.2 小时达到）[1]
- 在雄性比格犬中，尼罗加司他（Nirogacestat）15 mg/kg 的口服生物利用度约为 38%，t₁/₂ 约为 4.0 小时，脑血浆浓度比约为 0.4（给药后 2 小时测得）[1]
- 尼罗加司他在人、大鼠和犬血浆中具有较高的血浆蛋白结合率 (>97%)（通过超滤法测定）[1]

蛋白质结合
尼罗加司他血清蛋白结合率高达99.6%，其中与血清白蛋白的结合率为94.6%，与α-1酸性糖蛋白的结合率为97.9%。

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在一项为期28天的大鼠毒性研究中（口服尼罗加司他，剂量分别为5、20、60 mg/kg/天），未观察到不良反应剂量（NOAEL）为20 mg/kg/天；在60 mg/kg/天剂量下，5只大鼠中有2只出现轻度胃肠道黏膜增生（停药后可逆）[1]
-在比格犬中，以15 mg/kg/天的剂量口服尼罗加司他28天，未检测到体重、血清ALT、AST、肌酐或BUN水平的显著变化；肝脏、肾脏和脑组织的病理学分析显示无异常[1]
- 用Nirogacestat（30 mg/kg 口服，28 天）治疗的裸鼠未观察到与治疗相关的死亡或严重毒性[1]

[1]. Clin Cancer Res . 2012 Sep 15;18(18):5008-19.

[2]. Clin Cancer Res . 2012 Sep 15;18(18):5008-19.

[3]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2000 May 23;97(11):6138-43.

尼罗加司他（Nirogacestat）属于咪唑类化合物，其结构为1H-咪唑，1位被1-[(2,2-二甲基丙基)氨基]-2-甲基丙-2-基取代，4位被{N-[(2S)-6,8-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基]-L-正缬氨酰}氨基取代。它是一种γ-分泌酶抑制剂，其氢溴酸盐适用于需要全身治疗的进展性纤维瘤成人患者。它具有抗肿瘤活性和γ-分泌酶调节作用。尼罗加司他属于四氢萘类化合物、有机氟化合物、仲酰胺类化合物、仲氨基化合物和咪唑类化合物。它是nirogacestat(2+)的共轭碱。
Nirogacestat是一种小分子γ-分泌酶抑制剂，曾被研究作为治疗纤维瘤的潜在药物。纤维瘤的典型特征是Notch信号通路异常激活。Notch受体与其配体之间的相互作用会激活γ-分泌酶的蛋白水解作用；因此，抑制γ-分泌酶可能抑制Notch信号通路，从而阻碍纤维瘤的生长。2023年11月27日，Nirogacestat以商品名OGSIVEO获得FDA批准，用于治疗需要全身治疗的进展性纤维瘤成年患者。该药物此前已获得治疗纤维瘤的突破性疗法认定、快速通道资格认定和孤儿药资格认定，最终获批是基于其在3期DeFi试验中获得的积极结果。该试验中，确认的客观缓解率达到41%，而安慰剂组仅为8%。
尼罗加司他是一种具有抗肿瘤活性的选择性γ-分泌酶（GS）抑制剂。给药后，尼罗加司他靶向并结合GS，从而阻断Notch受体的蛋白水解激活。这会抑制Notch信号通路，并诱导Notch过表达的肿瘤细胞凋亡。整合膜蛋白GS是一种多亚基蛋白酶复合物，它能切割Notch受体等单次跨膜蛋白的跨膜结构域内的残基。 Notch信号通路过度表达与肿瘤细胞生长和存活率增加相关。

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药物适应症
尼罗加司他适用于需要全身治疗的进展性纤维瘤成年患者。

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作用机制
尼罗加司他是一种γ-分泌酶抑制剂，可阻断Notch受体的蛋白水解激活。当Notch失调时，可激活促进肿瘤生长的信号通路。

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药效学
尼罗加司他暴露量与3级低磷血症之间存在暴露-反应关系，暴露量越高，发生3级低磷血症的风险越高。在推荐剂量下，未观察到 QTc 间期平均增加 > 20 ms。

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Nirogacestat 是一种小分子 γ-分泌酶抑制剂，最初开发用于治疗 Notch 激活的疾病，包括韧带样瘤（侵袭性纤维瘤病）和某些癌症（例如结肠癌），以及纤维化疾病 [1]
- 与非选择性 γ-分泌酶抑制剂不同，Nirogacestat 对 γ-分泌酶具有更高的选择性和更好的口服生物利用度，从而降低了脱靶毒性（例如皮疹、胃肠道不适）的风险 [1]
- Nirogacestat 已进入韧带样瘤的 III 期临床试验；初步数据显示肿瘤体积显著缩小，患者报告的症状（例如疼痛、功能障碍）得到改善 [1]

C27H41F2N5O

489.64

489.328

C, 66.23; H, 8.44; F, 7.76; N, 14.30; O, 3.27

1290543-63-3

Nirogacestat dihydrobromide;1962925-29-6; Nirogacestat;1290543-63-3; 865773-15-5; 1962925-29-6 (HBr); 2664906-78-7 (HBr); 2929404-66-8 (racemate free base)

46224413

White to yellow solid powder

6.217

74.47

3

6

11

35

685

2

FC1=C([H])C(=C([H])C2=C1C([H])([H])[C@]([H])(C([H])([H])C2([H])[H])N([H])[C@]([H])(C(N([H])C1=C([H])N(C([H])=N1)C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])N([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H])F

VFCRKLWBYMDAED-REWPJTCUSA-N

InChI=1S/C27H41F2N5O/c1-7-8-23(32-20-10-9-18-11-19(28)12-22(29)21(18)13-20)25(35)33-24-14-34(17-31-24)27(5,6)16-30-15-26(2,3)4/h11-12,14,17,20,23,30,32H,7-10,13,15-16H2,1-6H3,(H,33,35)/t20-,23-/m0/s1

(2S)-2-[[(2S)-6,8-difluoro-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-2-yl]amino]-N-[1-[1-(2,2-dimethylpropylamino)-2-methylpropan-2-yl]imidazol-4-yl]pentanamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.11 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.11 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.11 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 1.43 mg/mL (2.92 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: 5% DMSO+40% PEG 300+5%Tween80+ 50%ddH2O: 2.4mg/ml

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。