Endogenous Metabolite

背景：需要新的策略来对抗多重耐药细菌。限制细菌对铁的吸收是抑制其生长的一种有前景的方法。我们的目标是通过使用食物成分抑制弧菌的铁离子结合蛋白（FbpA）来抑制弧菌的生长。 方法：选择20种香料进行FbpA抑制剂的筛选。将该候选物应用于抗菌试验，并进一步研究了其作用机制。 结果：筛选出一种活性化合物迷迭香酸（RA）。RA与VmFbpA竞争性结合，比Fe3+更紧密，VmFbaA是来自梅茨尼克弧菌的FbpA，表观KD值为8μM对17μM。此外，在1000μM时，RA可以将梅氏弧菌的生长抑制到对照的三分之一。有趣的是，柠檬酸钠（SC）增强了RA的生长抑制作用，尽管SC仅不抑制生长。RA/SC的组合不仅在100/100μM时完全抑制了梅氏弧菌的生长，而且在100/1000和1000/100μM时分别完全抑制了弧菌病病原体创伤弧菌和副溶血弧菌的生长。然而，RA/SC不影响大肠杆菌的生长。 结论：RA/SC是一种潜在的弧菌抑菌剂，对本土胃肠道细菌几乎没有损伤。[1]

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癌症细胞主要依赖糖酵解产生三磷酸腺苷（ATP）和细胞生长和增殖所需的中间体。因此，抑制糖酵解在抗肿瘤治疗中可能具有治疗价值。我们之前的研究发现，3-溴丙酮酸（BP）和柠檬酸钠（SCT）都可以在体外和体内抑制肿瘤的生长和增殖。然而，BP和SCT介导的抗肿瘤活性的机制尚不完全清楚。本研究表明，BP和SCT分别抑制人癌症细胞系MGC-803的己糖激酶（HK）活性和磷酸果糖激酶（PFK）活性，这两种药物都降低了细胞活力、ATP生成和乳酸含量。这些影响与糖酵解的阻断直接相关。此外，BP和SCT可以诱导线粒体调节的凋亡的特征性表现，如抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的下调、促凋亡蛋白Bax的上调、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活以及细胞色素c（Cyt-c）的泄漏。综上所述，我们的研究结果提供了证据，表明BP和SCT抑制MGC-803细胞的生长和增殖可能与抑制糖酵解和促进线粒体调节的凋亡有关。[2]

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BP和柠檬酸钠/SCT对MGC-803细胞增殖的抑制作用[2]
为了评估BP和SCT对细胞增殖的影响，我们通过MTT法研究了不同浓度BP和SCT分别处理24小时和48小时后MGC-803细胞的存活率。如图1所示，暴露于BP和SCT后，MGC-803细胞的存活率以剂量和时间依赖的方式显著降低。暴露于BP和SCT 48小时后，IC50分别为5.73±0.75μg/ml和10.08±0.87 mM。此外，用倒置显微镜直接观察细胞形态显示，经BP和SCT处理后，细胞发生了许多形态变化。特别是，在BP和SCT处理48小时后，细胞收缩、细胞质凝结和染色体凝结呈剂量依赖性。

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BP和柠檬酸钠/SCT促进MGC-803细胞凋亡[2]
同时采用Annexin V-PE和7-ADD双染色法分析BP和SCT对MGC-803细胞存活率的影响。图2A和C中的结果显示，BP和SCT均以剂量和时间依赖的方式诱导MGC-803细胞凋亡。然而，5-FU也显著促进了MGC-803细胞的凋亡。

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BP和SCT/柠檬酸钠导致MGC-803细胞周期阻滞在G2/M期[2]
细胞周期在癌症细胞增殖中起着关键作用。PI染色分析细胞周期的重新分配。如图2B和D所示，与对照组相比，用BP和SCT处理的细胞更多地停滞在G2/M期，而G1期的细胞数量减少。结果呈现出浓度依赖性。同时，5-FU对细胞周期的影响与BP和SCT相同。

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BP和SCT/柠檬酸钠降低MGC-803细胞内ATP水平[2]
细胞内ATP水平被认为在恶性肿瘤细胞的生长和增殖中起着关键作用。为了检测细胞内ATP含量，将MGC-803细胞与不同浓度的BP和SCT孵育4小时和8小时。如图3A所示，BP和SCT都能以剂量和时间依赖的方式显著抑制细胞内ATP的产生。此外，5-FU还可以减少MGC-803细胞中ATP的产生。

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BP和SCT/柠檬酸钠抑制MGC-803细胞的乳酸生成[2]
为了研究BP和SCT是否调节MGC-803细胞的糖酵解代谢，我们分别测量了BP和SCT处理24小时和48小时后MGC-803电池中乳酸的产生。如图3B所示，与未处理的细胞相比，经BP和SCT处理的细胞内乳酸产生显著降低，结果显示出剂量和时间依赖性。然而，5-FU组和对照组的细胞内乳酸浓度没有差异。

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BP和SCT/柠檬酸钠对糖酵解关键酶活性的影响[2]
为了研究BP和SCT对糖酵解代谢的影响，考虑了HK和PFK的活性。如图3C和D所示，与BP孵育24小时和48小时后，HK的活性以剂量和时间依赖的方式下调。然而，与对照组相比，SCT和5-FU治疗组的HK活性没有差异。此外，SCT对PFK活性具有浓度和时间依赖性的抑制作用。有趣的是，BP和5-FU对MGC-803细胞中的PFK活性没有明显影响。

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BP和SCT/柠檬酸钠对凋亡相关基因mRNA和蛋白表达的影响[2]
为了研究BP和SCT对凋亡调控基因的影响，分析了抗凋亡Bcl-2和Survivin以及促凋亡Bax、caspase-3和Cyt-c的相对表达情况。将MGC-803细胞暴露于BP和SCT 24小时，然后分别用qPCR和western blot检测凋亡相关基因的mRNA和蛋白质表达水平。如图4所示，BP和SCT均显著降低了抗凋亡Bcl-2和Survivin的mRNA和蛋白质表达，而增加了促凋亡Bax、caspase-3和Cyt的mRNA和蛋白表达水平。BP和SCT对凋亡相关基因的调节作用呈剂量依赖性。同时，5-FU对这些凋亡相关基因的影响也与BP和SCT相同。

柠檬酸钠治疗显著降低了模型组血尿素氮和血清肌酐浓度的升高。苏木精-伊红和Masson染色显示，柠檬酸钠治疗明显改善了CRF大鼠的肾脏病理变化。Western blot分析显示，柠檬酸钠处理降低了转化生长因子β1和IV型胶原的蛋白质水平，而在模型大鼠中，这些蛋白质水平有所升高。此外，免疫组织化学染色表明，柠檬酸钠能有效降低模型大鼠葡萄糖调节蛋白78 kDa和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白的蛋白表达，这与蛋白质印迹结果一致。此外，高剂量的柠檬酸钠对慢性肾衰竭大鼠的保护作用强于低剂量柠檬酸钠。[3]

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柠檬酸钠对血液生化指标的影响[3]
在实验的第6、8、12和16周，采集血液，检查不同组的BUN、Scr钙、钾和磷浓度。实验期间，模型组的BUN水平与对照组相比显著升高（p<0.05）。此外，对照组和柠檬酸钠对照组之间没有显著差异（p>0.05）。此外，与模型组相比，低剂量和高剂量柠檬酸钠治疗组的BUN水平显著降低（p<0.05）。此外，在实验的第12周和第16周，低剂量组和高剂量组之间观察到显著差异。除正常对照组外，BUN水平在实验期间在8或12周达到峰值，然后在16周降至最低水平（图1A）。关于Scr水平，变化与BUN水平一致。与正常组相比，模型组的水平升高，与模型组相比，柠檬酸钠治疗组的水平降低。在实验期间，除对照组外，Scr水平在8周时达到峰值，然后在16周时降至最低水平（图1B）。血清钾（在线供应表S1；所有在线供应材料见www.karger.com/doi/10.1159/000437235）、钙（在线供应表格S2）和磷（在线供应图表S3）浓度在5组之间没有显著差异（p>0.05）。

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柠檬酸钠对肾脏病理变化的影响[3]
根据血液生化指标结果，对照组和柠檬酸钠对照组之间没有显著差异。因此，我们在进一步的研究中消除了柠檬酸钠基团。在实验的第8周，肾脏损伤最为严重。因此，我们选择8周和16周的结果来观察柠檬酸盐对腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾功能衰竭的影响。目视检查8周时的大鼠肾脏。对照组肾脏呈红棕色，有光泽，包膜易脱落，表面光滑无肿胀。与对照组相比，模型组的肾脏颜色苍白，表面有黑斑，大小更大。肾脏皮质和髓质之间的边界不清楚，很难剥离（图2A）。

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柠檬酸钠对TGF-β1和CIV蛋白水平的影响[3]
实验8周后肾损伤最严重；因此，我们使用在8周时间点收集的组织样本来评估TGF-β1和CIV的蛋白表达。与对照组相比，模型组肾纤维化相关蛋白TGF-β1（图3A）和CIV（图3B）的表达显著增加，而柠檬酸钠治疗降低了对照组的表达。此外，高剂量治疗组对TGF-β1和CIV表达的抑制作用大于低剂量治疗组。

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柠檬酸钠在腺嘌呤诱导的慢性肾衰竭大鼠模型中调节GRP78和CHOP[3]
GRP78免疫组织化学结果显示，与对照组相比，模型组GRP78蛋白表达显著增加。在柠檬酸钠处理组中，GRP78蛋白表达与模型组相比有所增加。实验8周后，当肾功能障碍最严重时，除对照组外，其他组的GRP78蛋白表达最高（图4A和C）。CHOP免疫组织化学结果显示，与对照组相比，模型组的CHOP蛋白表达显著增加，而柠檬酸盐处理组的CHAP蛋白表达与模型组相比有所减少。从实验的第6周到第16周，除对照组外，CHOP表达水平均升高（图4B和D）。此外，我们使用蛋白质印迹法检测了8周时GRP78、PERK、ATF6和CHOP的表达水平（图4E和F）。结果显示，与对照组相比，模型组GRP78的表达水平显著升高，并在柠檬酸钠治疗后升高。与对照组相比，模型组PERK、ATF6和CHOP的表达明显增加，而柠檬酸钠治疗组则显著降低。

MTT法[2]
使用MTT法评估细胞存活率。将约3×103个细胞接种到96孔培养板的每个孔中并孵育24小时。使用完整的培养基将药物稀释至所需浓度（1、2、3、4、5、6、8、10和12μg/ml）BP和（1.25、2.5、5、10、15、20、30、40和60 mM）柠檬酸钠/SCT，并将相应的含药物培养基加入每个孔中。在CO2培养箱中分别再培养24小时和48小时。加入30μl MTT溶液，孵育4小时。然后进行上清液抽吸和DMSO添加（150μl/孔），用酶标仪在490 nm处测量OD值。

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流式细胞仪分析[2]
将处于对数生长期的MGC-803细胞胰蛋白酶消化并接种到培养瓶中。细胞分别贴附于培养瓶中24小时后，加入相应的含药物培养基（4、6、8μg/ml的BP；5、10、20mM的柠檬酸钠/SCT和0.5mM的5-FU），同时加入阴性对照组。对于细胞周期分析，在孵育24小时后，收获细胞并用PBS洗涤两次，然后在4°C的70%冷乙醇中固定过夜。RNase A（0.2 mg/ml）在37°C下消化30分钟后，细胞在4°C下在黑暗中用PI（50μg/ml）染色30分钟。为了进行凋亡分析，处理24小时和48小时后收集细胞，用冷PBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在100μl结合缓冲液中，分别加入PE和7-ADD并混合均匀。反应在室温下黑暗中进行30分钟。染色后再加入400μl 0f结合缓冲液。最后，使用流式细胞仪检测细胞周期的重新分配和凋亡。

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乳酸和ATP含量以及糖酵解酶活性的测定[2]
MGC-803细胞分别与相应的药物（4、6、8μg/ml的BP；5、10、20mM的柠檬酸钠/SCT和0.5mM的5-FU）一起孵育。为了检测乳酸和HK和PFK的活性，孵育24小时和48小时。为了检测ATP含量，将细胞孵育4小时和8小时。孵育后，收集细胞并用冷PBS洗涤两次。分别用试剂盒测定乳酸和ATP的含量以及HK和PFK的活性。检测是按照制造商的说明进行的。

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逆转录聚合酶链反应测定[2]
在用相应的药物（4、6、8μg/ml的BP；5、10、20mM的柠檬酸钠/SCT和0.5mM的5-FU）处理后收获MGC-803细胞，同时加入阴性对照组。使用RNeasy试剂盒制备总RNA，并使用PrimeScript®RT试剂盒进行逆转录。xxx合成了Bcl-2、Bax、Survivin、Cyt-C、Casepase-3和GAPDH的引物（见表1）。反应符合SYBR Green PCR Master Mix。根据制造商的说明，使用Applied Biosystems®7500实时PCR系统进行实时PCR检测。实时PCR数据使用2-PCR定量△△Ct法。

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蛋白质印迹分析[2]
MGC-803细胞分别与BP、Sodium citrate/柠檬酸钠和5-FU孵育24小时，收集后用冷PBS洗涤两次，然后在细胞裂解试剂中裂解。反应在冰上进行20分钟，然后将裂解物在4°C 12000 rpm下离心30分钟。保存上清液，用BCA法测量样品的蛋白质浓度。蛋白质在15%SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝化纤维膜上。然后用5%的非扁平乳封闭膜过夜，加入一抗（1:200）在4°C下孵育过夜。在孵育第一抗体后，用PBST洗涤膜三次10分钟，然后与第二抗体（1:4000）孵育1小时。最后，测定蛋白质条带的灰度值。

Establishment of the Animal Model [3]
A total of 48 healthy male Sprague-Dawley rats, weighting 180-250 g, were reared in a temperature-controlled room (22-24°C) with a 12-12 h light-dark cycle. Before the experiment, all rats were housed with food and water freely available for 3 days to adapt the environment. Animals were randomly divided into 5 groups: the control group, normal rats; the Sodium citrate control group, normal rats with high dose treatment of sodium citrate; the model group, rats with renal failure; the low-dose group, model rats with low dose treatment of sodium citrate; and the high-dose group, model rats with high dose treatment of sodium citrate. Rats in the control group and sodium citrate control group received distilled water at 10 ml/kg/day by gavage during the experiment. In the other three groups, a 0.75% adenine suspension was given at a dose of 5.0 ml/kg/day by gavage every morning to induce CRF. For sodium citrate administration, rats were treated with either a low dose (216 mg/kg) or a high dose (746 mg/kg) of Sodium citrate by gavage. The rats were euthanized after 6, 8, 12, and 16 weeks, and blood and renal tissues were collected for analysis.

Exposure Routes
The substance can be absorbed into the body by inhalation of its aerosol and by ingestion.

[1]. Rosmarinic Acid and Sodium Citrate Have a Synergistic Bacteriostatic Effect against Vibrio Species by Inhibiting Iron Uptake. Int J Mol Sci. 2021 Dec 1;22(23):13010.

[2]. 3-Bromopyruvate and sodium citrate induce apoptosis in human gastric cancer cell line MGC-803 by inhibiting glycolysis and promoting mitochondria-regulated apoptosis pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2016 Jun 17;475(1):37-43.

[3]. Sodium Citrate Inhibits Endoplasmic Reticulum Stress in Rats with Adenine-Induced Chronic Renal Failure. Am J Nephrol. 2015;42(1):14-21.

Sodium citrate dihydrate is the dihydrate of trisodium citrate. It has a role as an anticoagulant. It contains a sodium citrate.
Sodium salts of citric acid that are used as buffers and food preservatives. They are used medically as anticoagulants in stored blood, and for urine alkalization in the prevention of KIDNEY STONES.
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Interestingly, E. coli responds to iron restriction by producing citrate and has an Fec(CD)E/A transporter system for ferric citrate uptake, which is absent in V. metschnikovii (Table 1). Furthermore, FecB, the periplasmic subunit of the Fec(CD)E/B system, binds a variety of Fe-citrate complexes (citrate, Fe3+-Cit, [Fe2(Cit2)]2-, and [Fe(Cit)2]5-) as well as other citrate complexes (Ga3+, Al3+, Sc3+, In3+, and Mg2+) with a Kd value in the micromolar range. When FbpAs in E. coli and V. metschnikovii were inhibited by 1000 μM RA, Fe3+ was reduced to Fe2+. Subsequently, adding citrate chelates free Fe2+ into Fe2+-citrate complexes. These Fe2+-citrate complexes can be taken up by E. coli via the Fec(CD)E/B transporter system, whereas the Fe2+-citrate complexes are not bioavailable for V. metschnikovii. This could be why E. coli is more resistant to RA and the combination of RA and SC than V. metschnikovii. Therefore, RA combined with SC could inhibit V. metschnikovii without deleterious effects on indigenous gastrointestinal bacteria. [1]

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In summary, the results of the present study reveal that both BP and Sodium citrate/SCT could inhibit growth and proliferation of MGC-803 cells and block glycolytic pathway and regulated the Bcl-2 family genes to induce mitochondria-regulated apoptosis. These observations will add new light in the field of developing therapeutic strategies for gastric cancer in the near future on BP and SCT. [2]

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Background/aims: Endoplasmic reticulum stress (ERS) is an important self-protective cellular response to harmful stimuli that contribute to various diseases, including chronic renal failure (CRF). Sodium citrate plays an important role in antioxidant and cellular immunity, but whether it improves ERS in CRF is unclear.
Methods: The rats were randomly divided into five groups: the control group, the sodium citrate control group, the model group, model rats with low dose sodium citrate (216 mg/kg), and model rats with a high dose of sodium citrate (746 mg/kg). The rats were euthanized at 6, 8, 12, and 16 weeks with their blood and renal tissue in detection.
In conclusion, this study demonstrates that sodium citrate has a protective effect on CRF rats by inhibiting ERS. In addition, this protective effect was stronger with higher doses of the sodium citrate in CRF rats. Our findings may provide a new therapeutic strategy for treatment of CRF. [3]

C6H9NA3O9

294.0996

293.993

6132-04-3

Lithium citrate tetrahydrate;6080-58-6;Citric acid;77-92-9;Hydroxycitric acid tripotassium hydrate;6100-05-6

71474

White to off-white solid powder

1.76

309.6ºC at 760 mmHg

>300 °C(lit.)

173.9 °C

1.58

159.08

3

9

2

18

211

0

C(C(=O)[O-])C(CC(=O)[O-])(C(=O)[O-])O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+]

NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K

InChI=1S/C6H8O7.3Na.2H2O/c7-3(8)1-6(13,5(11)12)2-4(9)10;;;;;/h13H,1-2H2,(H,7,8)(H,9,10)(H,11,12);;;;2*1H2/q;3*+1;;/p-3

trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;dihydrate

Trisodium citrate dihydrate; B22547B95K; Nauzene; DTXSID1049437; N-1560; Natrii citras, dehydrate; TRISODIUM CITRATE DIHYDRATE (II); ...; 6132-04-3;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~125 mg/mL (~425.03 mM)

配方 1 中的溶解度: 100 mg/mL (340.02 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。