20S(OH)D3   中文名称: 20S-（羟基）维生素D3

VDR/vitamin D receptor

化学合成的20S-（OH）D3具有生物活性[1]
在人类正常表皮角质形成细胞、永生化HaCaT角质形成细胞和仓鼠AbC1黑色素瘤细胞中测量的20S-（OH）D3的生物活性显示出与P450scc产生的化合物相似的效果。

首先，我们测试了对角质形成细胞增殖的影响，发现与对照（载体处理）细胞相比，用浓度为10-8M和10-6M的220S-（OH）D3和1,25（OH）2D3处理正常人表皮角质形成细胞24小时，可抑制细胞增殖（图5）。同样，20S-（OH）D3以剂量依赖的方式抑制HaCaT永生化表皮角质形成细胞的增殖（通过3H-胸苷掺入DNA来测量）（图6）。抑制作用与1,25（OH）2D3相似，在低至10-11M的浓度下可见（图6）。有趣的是，前体化合物20S-（OH）-7DHC也抑制了DNA合成，尽管浓度更高（≥10-10M）

接下来，我们测试了20S-（OH）D3对维生素D受体（VDR）、外皮蛋白和CYP24基因表达的影响，发现20S-（OH）D3在与1,25（OH）2D3相当的水平上刺激了VDR的表达（图7A）。然而，与1,25（OH）2D3相比，它在刺激外皮蛋白（2倍对5倍）和CYP24（60倍对10000倍）表达方面的效果较差（图7B和7C）。1,25（OH）2D3和20S-（OH）D3在诱导CYP 24表达方面的差异超过100倍，这与之前报道的生化合成的20S-（羟基）D3相似[18,19,33]，这表明20S-（OH）D3对维生素D3活性形式的失活（24羟基化）影响很小。

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20S-（OH）D3抑制癌症在单层和软琼脂中的菌落形成[2]
通过测量20S-(OH)D3和1，25（OH）2D3抑制癌症细胞集落形成的能力，将它们的抗肿瘤活性进行比较。首先，我们测试了这些化合物对HepG2肝细胞癌集落生长的影响，发现20S-(OH)D3和1,25（OH）2D3以浓度依赖的方式抑制HepG2增殖<与对照（载体处理）细胞相比，浓度为100 nM的strong>20S-（OH）D3和1,25（OH）2D3有效地减少了大于0.2 mm（分别为54±14%和50±6%）和大于0.5 mm（分别是70±20%和92±6%）的集落的CFU（图1A和B）。用较低浓度（0.1和10 nM）的维生素D3衍生物治疗对大于0.2 mm的菌落总数没有显著影响（图1A），但大大阻止了大于0.5 mm的菌落的形成（图1B）。在所有三种测试浓度下，1,25（OH）2D3比20（OH）D3更能抑制大菌落（尺寸>0.5mm）的形成。

接下来，我们测试了20S-(OH)D3对MDA-MB-453人乳腺癌细胞在软琼脂中生长的影响。与对照（载体处理）细胞相比，浓度为100 nM的20（OH）D3和25（OH）D2有效抑制了大于0.2 mm的MDA-MB-453集落的形成（分别为CFU的54±4%和43±7%）（图2A和B）。在两个100nM治疗组中均未检测到大于1.5mm的菌落。在10 nM的浓度下，20（OH）D3抑制了大于1.5 mm的MDA-MB-453集落的形成（图2B）85±11%，而25（OH）D2的作用没有统计学意义。

最后，我们在软琼脂上测试了20S-（OH）D3对MCF7乳腺癌症细胞集落形成的影响。由于该细胞系的集落形成缓慢，我们将测试期延长至26天，以研究其抗增殖作用。浓度为100 nM的20（OH）D3抑制了大于0.2 mm的菌落形成78±28%（图3A）。然而，1α，25（OH）2D3在该模型中表现出相对较强的作用，在低至0.1 nM的浓度下抑制了62±6%的集落形成（图3B）。

高剂量的20S-（OH）D3在治疗3周后对小鼠没有钙血症影响[2]
文献报道，在大鼠模型中，连续7天以3μg/kg的剂量服用20S-(OH)D3对全身钙水平没有影响。在目前的研究中，我们通过给C57BL/6小鼠服用不同剂量的20（OH）D3来评估其潜在毒性，最高剂量为30μg/kg。作为阳性对照，我们使用了25（OH）D2和1,25（OH）2D3，因为据报道，它们在小鼠或大鼠体内浓度≥1μg/kg时会产生高钙血症。如图4所示，即使在3周腹腔注射治疗的最高测试剂量（30μg/kg）下，20（OH）D3也没有显示出高钙血症活性（钙=9.7±0.69，而赋形剂对照组为9.4±0.25mg/dl）。相比之下，剂量仅为2μg/kg的1,25（OH）2D3导致钙的预期急剧上升，高达14.6±0.48mg/dl。剂量为2μg/kg的25（OH）D3显示出轻微的高钙血症作用，将血清钙水平提高到11.5±0.48mg/dl，超过了正常血清钙的10.5mg/dl上限。

细胞色素P450scc和CYP27B1代谢20S-（OH）D3 [1]
如前所述，将20S-（OH）D3掺入磷脂囊泡，并通过P450scc测量其代谢。孵育混合物由510μM磷脂囊泡组成，其中含有20S-（OH）D3，与磷脂的比例为0.1mol/mol，2μM牛细胞色素P450scc，15μM肾上腺素毒素，0.4μM肾上腺毒素还原酶，2 mM葡萄糖6-磷酸，2 U/ml葡萄糖6-磷酸脱氢酶和50μM NADPH。样品预孵育8分钟，通过加入NADPH开始反应，在37°C下振荡孵育6分钟。用二氯甲烷提取后，使用C18柱（Grace 15 cm×4.6 mm，粒径7μm）通过HPLC分析样品。通过与上述类似的程序测量CYP27B1（25-羟基维生素D3 1α-羟化酶）对20S-（OH）D3的代谢。

集落形成试验[2]
该测定遵循如前所述的标准方法。简而言之，将细胞以20个细胞/9.6 cm2的密度铺在24孔板中，培养基含有5%木炭处理的FBS、1%抗生素溶液和分级浓度的20S-（OH）D3、1,25（OH）2D3或25（OH）D3，或乙醇（载体对照）。细胞在37°C下培养7天，每3天更换一次培养基。孵育结束时，用4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲溶液（PBS）在4°C下固定菌落过夜，洗涤，用5%结晶紫的PBS染色30分钟，冲洗并风干。使用ARTEK计数器880测量菌落的数量和大小。集落形成单位（CFU）是通过将集落数量除以细胞数量，然后乘以100来计算的。

如前所述，MCF7细胞在软琼脂中生长。HepG2、MCF7和MDA-MB-453细胞的致瘤性是通过它们在软琼脂中形成集落的能力来确定的。细胞在单层中生长，胰蛋白酶消化，并重新悬浮在含有0.4%琼脂糖和10%木炭剥离血清的0.25ml培养基中（1000个细胞/孔）。将细胞悬浮液添加到24孔板中0.8%琼脂层中20S-（OH）D3，25（OH）D3，或1α，25（羟基）2D3从乙醇原料中加入，最终浓度范围为0.1-100nM。试验中包括乙醇对照。两周后，在软琼脂中形成的菌落用MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）试剂（0.5mg/ml）染色，并在显微镜下评分。单位数由形成的集落数除以接种的细胞数×100计算得出。

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细胞增殖试验[1]
1.MTS测试[1]
将HEKn角质形成细胞铺在96孔板中，10000个细胞/孔。细胞孵育过夜后，向培养基中加入1,25（OH）2D3或化学合成的20S-（OH）D3，最初溶解在乙醇中，然后稀释在含有0.5%BSA的KGM培养基中，使最终浓度达到0.01μM或1μM，而在对照培养中，乙醇载体的最终浓度为0.1%。与这些化合物孵育20小时后，向细胞中加入20μl MTS/PMS溶液。4小时后，使用ELISA平板读数器在490nm处记录吸光度。在六个重复中测量活细胞的数量。

2.DNA合成[1]
如前所述进行DNA合成测试。根据细胞类型，将细胞以5000-25000个细胞/孔的速度接种到24孔板中。在37°C下孵育过夜后，将培养物置于无血清培养基中，使细胞同步处于细胞周期的G0/G1期。24小时后，将20S-(OH)D3加入含有生长补充剂的新鲜培养基中，并再孵育72小时。在规定的时间后，将[3H]-胸苷（比活度88.0 Ci/mmol）加入培养基中至终浓度为0.5μCi/mL。在37°C下孵育4小时后，丢弃培养基，细胞在PBS（磷酸盐缓冲盐水）中的10%TCA中沉淀30分钟，用1 mL PBS洗涤两次，然后在37°C下用1 N NaOH/1%SDS（250μL/孔）孵育30分钟。将提取物收集在闪烁瓶中，并向每个瓶中加入5mL闪烁鸡尾酒。用β计数器测量掺入DNA的3H放射性。

3.集落形成试验[1]
如前所述，该测定遵循我们的标准方法。简而言之，将细胞以192个细胞/孔的密度铺在含有5%ctFBS（木炭处理的胎牛血清）、1%抗生素溶液和分级浓度的20S-（OH）D3或乙醇（载体对照）的培养基中。细胞在37°C下培养7天，每3天更换一次培养基。孵育结束时，将菌落用4%多聚甲醛的PBS溶液在4°C下固定过夜，洗涤，用5%结晶紫的PBS溶液染色30分钟，冲洗并风干。使用ARTEK计数器880测量菌落的数量和大小。集落形成单位是通过将集落数量除以细胞数量，然后乘以100来计算的。

4.ApoTox-Glo三重检测[1]
将黑色素瘤细胞铺在96孔板上，10000个细胞/孔。细胞孵育过夜后，如上所述，将1,25（OH）2D3或20S-（OH）D3加入培养基中。与这些化合物孵育24小时后，向细胞中加入20μl含有GF-AFC底物和双-AAF-R110底物的存活/细胞毒性试剂。在37°C下孵育30分钟后，使用荧光和发光微孔板读数器在400 nm激发/505 nm发射下记录荧光，以检测存活率，在485 nm激发/520 nm发射下检测细胞毒性。将100μl Caspase-Glo 3/7试剂进一步加入细胞中，在室温下孵育30分钟后，记录发光。在四个重复实验中测量了活细胞、细胞毒性细胞和凋亡细胞的数量。 实时荧光定量PCR 使用Absolutely RNA Miniprep试剂盒分离用20S-（OH）D3或1,25（OH）2D3处理的HEKn角质形成细胞的RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA合成试剂盒进行逆转录（1μg RNA/反应）。使用在无菌水中稀释5倍的cDNA和TaqMan PCR主混合物进行实时PCR。反应（一式三份）在95°C下进行5分钟，然后进行45个循环，95°C 10秒，60°C 30秒，72°C 30秒钟。引物和探针使用通用探针库设计。数据在罗氏Light Cycler 480上收集。使用比较CT方法将每个基因的扩增产物的量与亲环素B的扩增产物量进行比较。用于RTPCR DNA扩增的引物列表如表2所示。

体内毒性研究[2]
使用雄性C57/BL6小鼠评估了20S-(OH)D3的潜在毒性。小鼠体重约25-26 g，7周龄。两种阳性对照化合物1,25(OH)2D3和25(OH)D3购自xx。将溶于高压灭菌芝麻油中的20(OH)D3以5、10、20和30 μg/kg体重的剂量，连续三周，每日一次腹腔注射（ip）（50 μl/只）给每组五只小鼠。在阳性对照组中，以相同的方式腹腔注射1,25(OH)2D3或25(OH)D3，剂量为2 μg/kg体重。另一组五只小鼠每日注射50 μl/只经高压灭菌的芝麻油，作为溶剂对照。在整个实验期间，每周两次评估毒性临床症状和体重。在为期三周的治疗结束后，通过心脏穿刺采集终末血样（800~1000 μl/只）。立即使用BD Microtainer®管分离血清（约300 μl/只），并储存于-20°C。所有动物在采血后立即通过颈椎脱臼处死，并收集每只小鼠的主要器官（心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺和一块皮肤），分别保存在10%中性缓冲福尔马林溶液中，以备后续病理分析。

[1]. Chemical synthesis of 20S-hydroxyvitamin D3, which shows antiproliferative activity. Steroids. 2010 Dec;75(12):926-35.
[2]. 20-hydroxyvitamin D₃ inhibits proliferation of cancer cells with high efficacy while being non-toxic. Anticancer Res. 2012 Mar;32(3):739-46.
[3]. Design, Synthesis and Biological Activities of Novel Gemini 20S-Hydroxyvitamin D3 Analogs. Anticancer Res. 2016 Mar;36(3):877-86.
[4]. Design, synthesis, and biological action of 20R-hydroxyvitamin D3. J Med Chem. 2012 Apr 12;55(7):3573-7.

20S-羟基维生素D3 (20S-(OH)D3) 是细胞色素P450scc代谢维生素D3的体外产物，近期被分离鉴定，并证实具有抗增殖活性且不引起高钙血症。然而，20S-(OH)D3的酶法合成繁琐、成本高昂，且无法满足广泛的化学和生物学研究需求。本文首次报道了20S-(OH)D3的化学合成方法，该方法合成的20S-(OH)D3展现出与P450scc生成的化合物相似的生物学特性。具体而言，20S-(OH)D3经P450scc羟基化生成20,23-二羟基维生素D3和17,20-二羟基维生素D3，并经CYP27B1转化为1α,20-二羟基维生素D3。在正常人表皮角质形成细胞中，该化合物抑制人表皮角质形成细胞增殖的效力低于1α,25-二羟基维生素D3 (1,25(OH)2D3)，但在永生化HaCaT角质形成细胞中，其效力与1,25(OH)2D3相当。该化合物刺激VDR基因表达的效力与1,25(OH)2D3相似，并刺激包膜蛋白（一种分化标志物）和CYP24基因表达，但对后者的效力低于1,25(OH)2D3。在仓鼠黑色素瘤细胞中进行的测试表明，该化合物对细胞增殖和集落形成能力的抑制作用呈剂量依赖性，且与1,25(OH)2D3相似或更强。因此，我们开发了一种合成20S-(OH)D3的化学方法，该方法可用于制备一系列20S-(OH)D3类似物，以研究其构效关系，从而进一步优化此类化合物的治疗用途。[1]

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目的
为了确定20-羟基维生素D3 (20(OH)D3) 作为抗肿瘤药物的潜在用途，我们评估了其体外抗增殖活性和体内毒性。
材料与方法
我们使用克隆形成实验测试了20(OH)D3对乳腺癌和肝癌细胞系的抗肿瘤活性。为了评估体内毒性，我们每天腹腔注射小鼠5-30 μg/kg 20(OH)D3，持续3周。采集血液和器官样本进行临床病理分析。
结果
20(OH)D3 对 MDA-MB-453 和 MCF7 乳腺癌以及 HepG2 肝癌均表现出相似的抑瘤活性，且呈剂量依赖性。该化合物不会引起高钙血症，在小鼠中，即使剂量高达 30 μg/kg，也不会对肝脏、肾脏或血液生化指标造成可检测到的毒性。相比之下，25(OH)D3 和 1,25(OH)2D3 在 2 μg/kg 的剂量下均引起严重的血钙过高。
结论
20(OH)D3 在体外对抑制癌细胞增殖具有高效性，且在体内无毒，支持其作为潜在抗癌治疗药物的进一步开发。[2]

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维生素 D3 (D3) 可通过细胞色素 P450scc (CYP11A1) 代谢为 20S-羟基维生素 D3 (20D3)，后者是其主要代谢产物。这种生物活性代谢物在高浓度下无毒（不引起血钙过高），且具有显著的抗增殖、抗纤维化、促分化和抗炎作用。由于具有两个对称侧链的D3类似物（双子类似物）能有效激活维生素D受体（VDR），我们假设含有20-羟基的这类类似物的链长和组成会影响其生物活性。在本研究中，我们设计并合成了一系列双子20D3类似物。生物学实验表明，其中一些类似物是VDR的部分激活剂，能够显著刺激VDR及其调控基因（包括CYP24A1和瞬时受体电位阳离子通道V6 (TRPV6)）的mRNA表达。这些类似物抑制黑色素瘤细胞增殖的能力与1α,25-二羟基维生素D3相当。此外，这些类似物降低了脾细胞中干扰素γ的水平，并上调了白细胞相关免疫球蛋白样受体1的表达，表明它们具有显著的抗炎活性。双子链长度与其VDR激活或生物活性之间没有明显的关联，这与VDR配体结合口袋的高度灵活性相符。[3]

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基于化学设计和假设，合成了非天然存在的20-羟基维生素D3的20R差向异构体。采用半制备型高效液相色谱法分离了20R异构体，并对其结构进行了表征。生物学评价中，20R异构体与其20S对应物的比较表明，它们在抗增殖和代谢研究中表现出不同的行为。[4]

C27H44O2

400.637068748474

400.334

651734-12-2

651734-12-2

162367340

Typically exists as white solid at room temperature

6.2

40.5

2

2

6

29

657

4

CC(C)CCC[C@@](C)([C@H]1CCC\2[C@@]1(CCC/C2=C\C=C/3\C[C@H](CCC3=C)O)C)O

IQEQEOBGZMEDBQ-LWVSKBGXSA-N

InChI=1S/C27H44O2/c1-19(2)8-6-17-27(5,29)25-15-14-24-21(9-7-16-26(24,25)4)11-12-22-18-23(28)13-10-20(22)3/h11-12,19,23-25,28-29H,3,6-10,13-18H2,1-2,4-5H3/b21-11+,22-12-/t23-,24?,25-,26-,27-/m0/s1

(1S,3Z)-3-[(2E)-2-[(1S,7aS)-1-[(2S)-2-hydroxy-6-methylheptan-2-yl]-7a-methyl-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1H-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexan-1-ol

20(OH)D3; 20-Hydroxyvitamin D3; 20S(OH)D3; (S,Z)-3-((E)-2-((1S,3aS,7aS)-1-((S)-2-Hydroxy-6-methylheptan-2-yl)-7a-methylhexahydro-1H-inden-4(2H)-ylidene)ethylidene)-4-methylenecyclohexanol; 20-Hydroxyvitamin D3; 651734-12-2; (1S,3Z)-3-[(2E)-2-[(1S,7aS)-1-[(2S)-2-hydroxy-6-methylheptan-2-yl]-7a-methyl-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1H-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexan-1-ol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。