7-Aminoactinomycin D   中文名称: 7-氨基放线菌素D

RNA polymerase; DNA dye

7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 是一种 DNA 染料，可在流式细胞术中区分活细胞、肝癌细胞和晚期染色/死亡细胞。 7-氨基放线菌素 D 染色剂量为 5 μg/mL、10 μg/mL 和 20 μg/mL（而不是 1 μg/mL）可用于流式细胞术中细胞填充的测量 [1]。 7-氨基放线菌素 D 通常以低浓度 (0.5-5 μg/mL) 使用，用于在流动操作过程中标记和消除死细胞。根据研究，在较高浓度 (10 -20 μg/mL) 下，7-氨基放线菌素 D 也可用于区分活细胞（7-AAD 阴性）和扫描细胞 (7-AADdim) 或死细胞 (7-AADbright)细胞膜的通透性和荧光强度，早期硅细胞较低，晚期硅细胞和死细胞较高[1]。

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7-氨基放线菌素D/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 是放线菌素D的荧光衍生物，能特异性结合DNA中的GC富集区。该染料在低浓度（0.5-5 μg/ml）时常用于流式细胞术中的死细胞标记与排除；在较高浓度（10-20 μg/ml）下，则可通过细胞膜通透性差异来区分活细胞（7-AAD阴性）、凋亡细胞（7-AAD弱阳性）和死细胞（7-AAD强阳性）——早期凋亡细胞膜通透性较低导致荧光信号弱，而晚期凋亡细胞和死细胞因膜通透性增高呈现强荧光信号。 7-AAD对早期凋亡细胞的标记效果与Annexin V相当（后者通过结合凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸发挥作用）。细胞分选实验证实，使用20 μg/ml 7-AAD在4°C条件下染色Jurkat和T3M-4细胞20分钟，结合后续TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记）检测及形态学评估，可准确区分不同凋亡状态的细胞群。现有报道中，10 μg/ml浓度染色30分钟也能成功标记，但针对细胞凋亡定量的最佳浓度尚未明确。这一关键缺陷可能是导致该技术应用受限的主因——尽管7-AAD是一种成本低廉的单色染色方案，且能与抗体标记或功能性染色灵活联用。此外，现有方案普遍包含耗时的固定步骤。为此，我们优化了实验流程：取消固定步骤，并对外周血单个核细胞（PBMC）和人白血病细胞系（CEM）测试了1-20 μg/ml浓度梯度。本研究旨在系统评估不同浓度7-AAD在流式细胞术凋亡定量分析中的适用性[2]。

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有效的RNA聚合酶抑制剂放线菌素D和7-Aminoactinomycin D (7-AAD)/7-氨基放线菌素D被证明可以与单链DNA结合。这种结合发生在含有鸟嘌呤残基的特定DNA序列上，其特征是低色紫外吸收变化，类似于药物与双链双链DNA相互作用中观察到的变化。结合的最显著特征是当7-氨基放线菌素与某些单链DNA结合时，荧光会显著增强（约37倍）。复合物的这种荧光的特征还在于药物发射光谱的40nm低致变色偏移，以及相对于游离药物或与小牛胸腺DNA结合的药物的发射各向异性的增加。荧光寿命在单链DNA存在的情况下以与强度差兼容的方式变化。因此，与游离药物的主要约0.5ns寿命相比，与2-ns寿命分量相对应的发射分数有所增加。7-氨基放线菌素D在聚丙烯酰胺凝胶中与单链DNA结合，结合药物的荧光可以通过540nm光的激发来观察。结合相互作用的特征是结合常数为2.0 x 10（6）至1.1 x 10（7）M-1[1]。

通过ficoll密度梯度离心法，从健康献血者的新鲜肝素化血液中分离出PBMCs，这些献血者给出了书面知情同意书。用磷酸缓冲盐水洗涤PBMC两次，并在补充有10%二甲亚砜的胎牛血清中冷冻直至分析。CEM细胞在标准细胞培养条件下培养。为了比较几种7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色方案，如前所述，用100 nM星孢菌素处理PBMC 24小时，然后用7-氨基放线上菌素D。该套件是按照制造商的说明使用的。7-AAD染色如前所述进行，稍作修改，但未固定。简而言之，用补充了2%FCS（37°C）的RPMI 1640细胞培养基（Invitrogen，Karlsruhe，Germany）洗涤处理和未处理的（背景对照）PBMC（105个细胞/样品），并在400g下离心5分钟。将每个样品重新悬浮在含有2%FCS的500μl RPMI中。然后加入7-AAD（1mg在50μl甲醇和950μl PBS中的储备溶液，含有0.9mM Ca2+和0.5mM Mg2+），以获得1、5、10和20μg/ml的浓度。样品在黑暗中在冰上孵育20分钟（n=3-9）。孵育后，将所有样品离心（400g，5分钟，4°C），用1ml含2%FCS的PBS洗涤一次（4℃），再次离心（400g,5分钟，4℃）并重新悬浮在500μl含2%FCS（4°C的PBS中。将样品储存在冰上，并在配备FACS Diva 6.0软件的BD LSRII流式细胞仪上在1小时内通过流式细胞术进行分析。7-AAD和PE在488nm处被激发。在575/26nm处分析PE的荧光，在695/40nm处分析7-AAD的荧光。PE和7-Aminoactinomycin D (7-AAD)根据制造商的说明进行了补偿。使用FlowJo 7.6.5对数据进行了进一步分析。淋巴细胞和CEM细胞根据大小和粒度在前向散点图和侧向散点图中门控。在前向散射与7-AAD点图中分析了活细胞、凋亡细胞和晚期凋亡/死亡细胞。两个对照样品用于细胞群的标准化门控（图1）。未经处理和未染色的细胞作为活细胞的对照。为了准确和可重复地设置凋亡和晚期凋亡/死亡细胞的门，我们测量了第二个对照样品，该样品用浓度为0.01%（PBMCs）或0.08%（CEM细胞）的1、5、10或20μg/ml 7-AAD和皂化碱染色。皂苷作为表面活性糖苷可渗透细胞膜，从而模仿晚期凋亡/死亡细胞的渗漏。由皂化碱处理的细胞定义的门代表晚期凋亡/死亡细胞（图1）。晚期凋亡/死亡细胞和活细胞之间的荧光强度值被认为代表凋亡细胞。使用GraphPad InStat 3.10版通过单因素方差分析（ANOVA）评估染色方案之间差异的统计学意义图2A显示了未经处理的淋巴细胞和用星孢菌素处理24小时的淋巴细胞的凋亡和晚期凋亡/死亡细胞的百分比。PE-annexin检测试剂盒染色的活细胞的绝对百分比比用7-Aminoactinomycin D (7-AAD)染色的细胞的百分比低约10%。未经处理的样本中活细胞的百分比在PE-膜联蛋白检测试剂盒和1μg/ml（P<0.001）、5μg/ml（P<0.001）、10μg/ml（P<0.01）7-Aminoactinomycin D (7-AAD)染色的样本之间存在显著差异。由于除了不同的染色方案外，所有样本都经过了相同的处理，因此预计凋亡的背景值是相似的。根本原因很可能是所描述的染色程序本身对细胞存活率的影响各不相同。考虑到这一事实，在分析凋亡诱导剂的效力时，始终减去背景控制非常重要。因此，为了进一步分析，我们分析了经处理细胞与未经处理细胞的凋亡变化，作为活细胞的比率（经处理除以未经处理），并分析了凋亡细胞和晚期凋亡/死亡细胞的差异（经处理减去未经处理），作为总细胞计数的百分比。活淋巴细胞的比例分别为0.91±0.03（平均值±标准差）（1μg/ml，20分钟）、0.87±0.03（5μg/ml，2 0分钟）、0.83±0.04（10μg/ml，0分钟），0.83±0.07（20μg/ml，10分钟）和0.80±0.1（PE-膜联蛋白检测试剂盒）。凋亡细胞和晚期凋亡/死亡细胞的相对频率如图2B所示。变异系数分别为0.46（1μg/ml，20分钟）、0.37（5μg/ml，二十分钟）、0.34（10μg/ml，20min）、0.57（20μg/ml，20min）和0.47（PE-膜联蛋白检测试剂盒）。在5至20μg/ml的浓度范围内，7-AAD染色显示出相当相似的结果，与广泛接受的市售PE-膜联蛋白检测试剂盒的结果一致。Bonferroni事后检验的单因素方差分析显示，1μg/ml 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)和PE-膜联蛋白检测试剂盒的平均值差异显著（P<0.01），而其他染色方法没有显著差异。由于5、10和20μg/ml 7-AAD似乎同样适用于流式细胞术中的凋亡染色，我们选择使用5μg/ml更详细地描述最经济的方案。因此，我们将该方案应用于比PBMCs更容易获得的第二个细胞系（人白血病CEM细胞），并将其与PE-annexin检测试剂盒和细胞死亡检测ELISAPLUS（以下简称ELISA[酶联免疫吸附试验]检测试剂盒）进行了进一步表征比较，ELISAPPLUS是一种基于组蛋白复合DNA片段免疫化学测定的细胞术无关方法。CEM细胞用11.5μM喜树碱处理16小时（n=4）或用150μM长春新碱处理24小时（n=4）。未经处理的CEM细胞作为背景对照。7-Aminoactinomycin D (7-AAD)染色如上所述进行，但稍作修改，将CEM细胞重新悬浮在250μl含有5μg/ml 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)的RPMI 2%FCS中，该FCS是在一种溶液中为所有样品新鲜制备的。ELISA检测试剂盒按照制造商的说明进行（n=8）。该测试将凋亡量化为处理过的样本与未处理样本中凋亡水平的倍数增加。由于无法计算凋亡细胞的百分比差异，我们偏离了制造商对PE-膜联蛋白检测试剂盒的分析说明。如前所述，为了比较其他染色方法，我们通过将处理过的凋亡CEM细胞的百分比除以未处理过的细胞凋亡CEM的百分比来计算凋亡的倍数增加，以便能够比较所有三种检测的结果。喜树碱处理的CEM细胞凋亡率分别为13.8±1.1（5μg/ml 7-AAD）、11.1±1.8（PE-annexin检测试剂盒）和8.0±4.0（ELISA检测试剂盒。变异系数分别为0.08、0.16和0.5。不同方法的凋亡率比较（通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验进行评估）表明，在喜树碱处理的细胞中，7-AAD与ELISA检测试剂盒存在显著差异（P<0.05）。长春新碱处理的CEM细胞中的比率为4.0±0.6（5μg/ml 7-AAD，20分钟），1.3±0.1（PE-膜联蛋白检测试剂盒）和5.7±0.5（ELISA检测试剂盒”）。变异系数分别为0.02、0.08和0.09。两种方法之间的凋亡率存在显著差异（7-AAD与PE-膜联蛋白检测试剂盒和PE-膜连蛋白检测试剂袋与ELISA检测试剂盒，P<0.001，7-Aminoactinomycin D (7-AAD)与ELISA检测套件，P<0.01）。这些结果表明，三种检测方法根据凋亡诱导剂的不同而得出不同的结果。根本原因很可能是所描述的方法基于参与细胞凋亡的不同生化机制。7-AAD是一种荧光DNA染料，只能通过凋亡或死亡细胞的质膜，膜联蛋白V与细胞外磷脂酰丝氨酸结合，ELISA检测试剂盒通过免疫化学方法测定凋亡细胞的组蛋白复合DNA片段。然而，如果在解释结果时考虑到这一事实，分析的应用就不会受到限制。由于凋亡检测试验本身会影响凋亡细胞的绝对百分比，因此始终分析与未经处理的对照组相关的结果更为重要[1]。

[1]. Actinomycin D and 7-aminoactinomycin D binding to single-stranded DNA. Biochemistry. 1991 Oct 1;30(39):9469-78.

[2]. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 2012 Oct 1;429(1):79-81.

[3]. Molecular detection of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria in semen of male partners of infertile couples in Tunisia: the effect on semen parameters and spermatozoa apoptosis markers. PLoS One. 2014 Jul 14;9(7):e98903.

7-AAD 是一种环状缩肽。
7-氨基放线菌素 D 是一种荧光核酸染料，可选择性地结合双链 DNA 中的 GC 序列。其分子量为 1270.5，最大吸收波长为 546 nm，最大发射波长为 647 nm。它常用于区分活细胞和死细胞。
另见：7-氨基放线菌素 D（注释已移至）。

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7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 是一种 DNA 染料，可在流式细胞术中区分活细胞、凋亡细胞和晚期凋亡/死亡细胞。目前已报道了多种使用 7-AAD 的染色方案，但尚无关于 7-AAD 浓度对读数影响的数据。因此，我们比较了用 1、5、10 和 20 μg/ml 7-AAD 染色 20 分钟后，使用 PE-Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒和细胞死亡检测 ELISAPLUS 试剂盒在淋巴细胞和 CEM 人白血病细胞中得到的结果。结果表明，5、10 和 20 μg/ml 的 7-AAD 染色适用于流式细胞术中细胞凋亡的定量分析，而 1 μg/ml 的 7-AAD 染色则不适用。[2]

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此前已有研究表明，在 4 °C 下，用 20 μg/ml 7-AAD 染色 20 分钟后，Jurkat 和 T3M-4 细胞经细胞分选、TUNEL 检测和形态学评估，可以正确识别早期和晚期凋亡/死亡细胞群，并可用于流式细胞术中细胞凋亡的分析。已有报道指出，使用 10 μg/ml 的 7-AAD 染色 30 分钟即可成功。本研究首次比较了不同浓度的 7-AAD 对检测结果的影响。我们首次证实，使用 5、10 和 20 μg/ml 的 7-AAD 进行染色（20 分钟，4 °C，避光）同样适用于早期凋亡和晚期凋亡/死亡淋巴细胞以及 CEM 细胞的染色，而 1 μg/ml 的浓度则不适用。此外，我们通过省略耗时的固定步骤改进了实验方案。综上所述，7-AAD 检测是一种经济简便的细胞凋亡定量方法。[2]

C62H87N13O16

1270.43168

1269.639

C, 58.62; H, 6.90; N, 14.33; O, 20.15

7240-37-1

65180

Brown to reddish brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1400.8±65.0 °C at 760 mmHg

801.0±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.664

-5.02

386

6

19

8

91

3070

0

O=C(N[C@H](C(N1[C@@](C(N(C)CC(N(C)[C@@H](C(C)C)C(O[C@@H]2C)=O)=O)=O)([H])CCC1)=O)C(C)C)[C@H]2NC(C(C(C(OC3=C(C)C(N)=C4)=C5C)=NC3=C4C(N[C@@H]6C(N[C@H](C(N7[C@@](C(N(C)CC(N(C)[C@@H](C(C)C)C(O[C@@H]6C)=O)=O)=O)([H])CCC7)=O)C(C)C)=O)=O)=C(N)C5=O)=O

YXHLJMWYDTXDHS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C62H87N13O16/c1-26(2)42-59(85)74-21-17-19-36(74)57(83)70(13)24-38(76)72(15)48(28(5)6)61(87)89-32(11)44(55(81)66-42)68-53(79)34-23-35(63)30(9)51-46(34)65-47-40(41(64)50(78)31(10)52(47)91-51)54(80)69-45-33(12)90-62(88)49(29(7)8)73(16)39(77)25-71(14)58(84)37-20-18-22-75(37)60(86)43(27(3)4)67-56(45)82/h23,26-29,32-33,36-37,42-45,48-49H,17-22,24-25,63-64H2,1-16H3,(H,66,81)(H,67,82)(H,68,79)(H,69,80)

2,7-diamino-4,6-dimethyl-3-oxo-1-N,9-N-bis[7,11,14-trimethyl-2,5,9,12,15-pentaoxo-3,10-di(propan-2-yl)-8-oxa-1,4,11,14-tetrazabicyclo[14.3.0]nonadecan-6-yl]phenoxazine-1,9-dicarboxamide

7-Aminoactinomycin D; 7240-37-1; Actinomycin D, 7-amino-; FLU 402; 7-amino-AMD; 7-AAD; 7-Amino-actinomycin D; 7-Amino Actinomycin D;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~78.71 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。