β-lactamase

FPI-1523 的 MIC 和 IC50 值分别为 4 μg/mL 和 0.4 μg/mL，这表明它抑制 K12 大肠杆菌 K12 和 PBP2[1]。 FPI-1523 的最低抑制浓度 (MIC) 较低，为 1-2 μM，可抑制表达不同 β-内酰胺酶或具有空载体的大肠杆菌 BW25113 pGDP-2 转化体[1]。

酶化验。[1]
所有酶检测的缓冲液均为50 mM HEPES， pH为7.5，Tween20为0.01%。OXA-48实验在添加50 mM NaHCO3的条件下进行。酶在BSA中稀释至100 ng/µL。酰化和去酰化实验如前所述进行。2、11。对于所描述的所有化合物，用硝基芬作为报告底物的连续测定法测定了氮酸盐。对于CTX-M-15，将100µL酶（0.2 nM[终值]）加入100µL硝基芬（50µM[终值]）中；Km = 10µM)和抑制剂。CTX-M-15的最大抑制剂浓度为：阿维巴坦0.8µM；Fpi-1465, 9µm；FPI-1523, 4µM；Fpi1602, 9µm。用相同的方法对OXA-48 （0.03 nM[终]）和硝基芬（100µM[终]）进行处理；Km = 50µM)。对于OXA-48，抑制剂使用的最大浓度为：阿维巴坦，50µM；Fpi-1465, 100µm；FPI-1523, 100µM；Fpi-1602, 100µm。对于CTX-M-15，使用跳跃稀释法连续测定脱除率12，其中1µM酶与10µM抑制剂在37°C下孵卵30分钟，然后稀释1/400，然后在测定缓冲液中加入20µL至180µL硝基芬（400µM）。对于OXA-48, 7µM酶与10µM抑制剂孵育1小时后，按上述方法1/16000稀释并添加到底物（200µM）中。对于OXA-48，除FPI-1465外的所有抑制剂均采用不连续取样。浓度-响应实验采用上述测定缓冲液。所有酶（1 nM）与抑制剂在37℃下孵育30分钟，然后用20µM的硝基芬稀释。金属酶添加10µM ZnSO4。阿维巴坦最大使用浓度为20µM。

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抗菌药物敏感性试验。[1]
MIC测试按照临床实验室标准协会进行。13所有实验都是重复进行的，菌株在37°C下生长18小时。在bla启动子的控制下，用该基因构建pGDP以实现高水平的组成表达。

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PBP结合试验。[1]
为了制备细菌膜，将大肠杆菌K-12 （MG1665）在BHI肉汤中培养过夜，在新鲜培养基中稀释，并在37℃搅拌下进一步孵育，使OD600达到~0.6-0.7。在4°C下，3000 g离心15分钟，洗涤后悬浮在KPN （20 mM磷酸钾- 140 mM NaCl， pH 7.5）中。细胞首先用溶菌酶（500µg/mL）在37℃下处理1h，然后加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒、脱氧核糖核酸酶（6µg/mL）和核糖核酸酶（6µg/mL）。处理30分钟后，用法式压滤机破坏细胞，将细菌裂解液在12,000 g下离心10分钟，以去除未破坏的细胞。将上清液在15万g下，在4℃下用固定角度转子离心40分钟，收集膜。膜悬浮在最小体积的KPN缓冲液中，保存在-86°C。用BCA试剂盒 以牛血清白蛋白为标准，用Bradford法测定蛋白浓度。以荧光青霉素BOCILLIN FL作为报告分子，用竞争法测定了测试分子对细菌PBPs的相对结合亲和力。增加测试化合物的浓度添加到反应混合物的整除30μg的细菌膜准备10分钟前在37°C的BOCILLIN FL(100µM)额外的20分钟。Membranecontaining样本然后加热到95°C 3分钟在电泳前加载缓冲区包含SDS电泳和蛋白质的分离SDS-polyacrylamide不连续凝胶系统(5%的叠加和10%的分离胶)。电泳后，快速用水冲洗凝胶，在固定液（50%甲醇- 7%醋酸）中孵育30分钟。凝胶用Molecular Imager FX Pro仪器扫描，激发波长为488nm，发射波长为530 nm，收集PBP剖面图像。阻断BOCILLIN FL随后与每个PBP结合50%所需的测试化合物浓度代表IC50值。

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使用纯化大肠杆菌PBPs进行BOCILLIN FL竞争测定。[1]
为了评估阿维巴坦衍生物对大肠杆菌PBPs的相对抑制作用，以BOCILLIN FL为报告分子，进行了三次SDS-PAGE浓度响应实验。所有试剂在使用前用实验缓冲液稀释。将不同浓度的未标记化合物和27.8 μM BOCILLIN FL同时加入4.7μM纯化的PBP中，最终反应体积为36 μL。反应在25℃下孵育20分钟，加入10倍SDS-PAGE上样染料。相比之下，在预孵育实验中，不同量的抑制剂化合物与4.7μM大肠杆菌PBP1b预孵育48小时，然后在27.8 μM BOCILLIN FL中再孵育20分钟（图S6）。然后将样品煮沸2 min，然后在12% SDS-PAGE预制凝胶上加载10μL。电泳后，使用Syngene ChemiGenius2生物成像系统在紫外光下对凝胶进行成像。如前所述，使用ImageJ进行密度分析。14将单个数据点归一化为荧光强度的最大值，这代表在没有未标记化合物的情况下BOCILLIN FL对蛋白质的总饱和度。以苄青霉素为阳性对照，卡那霉素为阴性对照。IC50值定义为使BOCILLIN FL的残留结合减少50%所需的化合物浓度，并使用SigmaPlot计算。

显微镜。[1]
在标准MIC曲线上培养细胞，然后按照Czarny等人的方法固定和成像。15简单地说，在用分光光度计记录培养密度后，将培养物1:10稀释在2%戊二醛中，用25 mM HEPES （pH 6.8）缓冲1小时。然后，将该溶液15 uL转移到0.17 mm玻璃底384孔微孔板上，并将5 uL 1.5%过滤灭菌的黑素染色液转移到微孔板上。用氮气轻轻冲洗盘子，然后在湿度控制的培养箱中以50°C加热固定。最后，使用Nikon Eclipse Ti-E倒置显微镜在明场下成像。使用Czarny等人的分析管道，使用ImageJ14对细胞特征进行量化。15这些图像特征使用Ward最小方差对药物治疗进行聚类，并计算治疗的相关图和Pearson相关值。

[1]. Structural and Kinetic Characterization of Diazabicyclooctanes as Dual Inhibitors of Both Serine-β-Lactamases and Penicillin-Binding Proteins. ACS Chem Biol. 2016 Apr 15;11(4):864-8.

阿维巴坦是一种二氮杂双环辛烷β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺类抗生素联用时，对多重耐药革兰氏阴性病原体具有显著但并不完全的疗效。由于大量医药企业投资开发阿维巴坦衍生物，因此有必要对其活性进行全面表征。本文通过结构和动力学分析表明，部分二氮杂双环辛烷衍生物对两种具有临床意义的β-内酰胺酶（CTX-M-15和OXA-48）表现出有效但活性各异的抑制作用。此外，这些衍生物对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和肠杆菌属的临床分离株也表现出显著的抗菌活性（MIC ≤ 2 μg/mL）。细胞表型成像以及结构和生化实验明确表明，在大肠杆菌中，这种活性是由于靶向青霉素结合蛋白2所致。我们的研究结果表明，用于药物发现的构效关系研究必须同时考虑β-内酰胺酶和青霉素结合蛋白作为靶点。我们相信，这种方法将产生下一代联合疗法或单药疗法，其活性谱将扩大，可用于治疗目前尚无有效疗法的革兰氏阴性病原体。[1]

C9H14N4O7S

322.30

322.058

1452459-50-5

1452459-52-7

71682990

Typically exists as solid at room temperature

-1.9

154

3

7

3

21

571

2

CC(=O)NNC(=O)[C@@H]1CC[C@@H]2CN1C(=O)N2OS(=O)(=O)O

WVZOCYGRXONJLX-RQJHMYQMSA-N

InChI=1S/C9H14N4O7S/c1-5(14)10-11-8(15)7-3-2-6-4-12(7)9(16)13(6)20-21(17,18)19/h6-7H,2-4H2,1H3,(H,10,14)(H,11,15)(H,17,18,19)/t6-,7+/m1/s1

[(2S,5R)-2-(acetamidocarbamoyl)-7-oxo-1,6-diazabicyclo[3.2.1]octan-6-yl] hydrogen sulfate

FPI-1523; 1452459-50-5; CHEMBL4117879; SCHEMBL15207633;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。