Inaxaplin (VX-147)

Apolipoprotein L1 (APOL1)
Inaxaplin targets apolipoprotein L1 (APOL1), a protein that forms ion channels in cell membranes. Certain variants of APOL1 (G1 and G2) are associated with an increased risk of kidney disease, particularly in individuals of African descent. Inaxaplin binds to APOL1 and inhibits its channel function, thereby preventing APOL1-mediated cell death and reducing kidney damage.

研究人员利用四环素诱导型APOL1人胚肾细胞（HEK293）评估了小分子化合物伊那沙普林抑制APOL1通道功能的能力。伊那沙普林是载脂蛋白L1的功能性激酶，它能选择性地抑制体外已表达的APOL1通道功能[1]。体外和体内研究表明，伊那沙普林直接与APOL1蛋白结合，抑制APOL1通道功能。具体而言，在细胞实验中，伊那沙普林以浓度依赖的方式阻断APOL1通道功能，表现为四环素诱导型APOL1 HEK293细胞中APOL1诱导的铊离子通量降低（图1A）。在该细胞模型中，在APOL1表达缺失的情况下，铊离子通量极低；而给予伊那沙普林后，APOL1介导的铊离子通量几乎完全消失（图1B）。如微尺度热泳结合实验所示（图1C）[1]，伊那沙普林可直接与APOL1蛋白结合。体外实验表明，伊那沙普林是APOL1的强效抑制剂。它能抑制APOL1介导的细胞通量，对APOL1 G0、APOL1 G1和APOL1 G2的IC50值分别为2.3 nM、1.3 nM和1.1 nM。此外，它还能抑制APOL1介导的细胞死亡。这些数据证实了其对APOL1通道具有强效且选择性的活性。

在APOL1 G2纯合转基因小鼠模型中，注射γ干扰素导致大量蛋白尿；相反，对照组Friend白血病病毒B（FVB）小鼠暴露于γ干扰素后未观察到蛋白尿。预防性给予inaxaplin（3 mg/kg，每日三次）或赋形剂，持续3天，首次给药于第1天，在γ干扰素注射前约1.5小时，可显著降低γ干扰素注射后G2纯合小鼠的平均尿白蛋白/肌酐比值曲线下面积，平均降低74.1%（图1D和图S3）。

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体内，inaxaplin是一种口服活性化合物，目前正在开发用于治疗APOL1相关肾病。作为首个APOL1抑制剂，它代表了一种治疗该疾病的新型疗法。具体体内疗效数据，包括给药方案和动物模型，将在原始文献和临床试验报告中详细说明。

为了评估伊那沙普林与APOL1的直接靶向结合，研究人员开发了一种利用荧光标记的重组APOL1蛋白的微尺度热泳结合分析方法。伊那沙普林与APOL1的结合通过荧光标记的APOL1的变化进行定量[1]。

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伊那沙普林的抑制活性通过体外测定APOL1介导的离子流来评估。表达APOL1变体的细胞用不同浓度的化合物处理，并使用荧光染料或膜片钳电生理技术测量离子流。计算抑制APOL1介导离子流的IC50值。

为了量化伊那沙普林对APOL1离子流的影响，研究人员构建了可诱导表达APOL1参考序列（G0）和两种疾病相关变体（G1和G2）的培养人胚肾（HEK293）细胞系，这些变体在四环素启动子的控制下表达。研究人员评估了伊那沙普林对铊离子流（钾离子流的替代指标）的影响。使用铊敏感染料[1]定量了铊离子流入细胞的情况。

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在表达APOL1变体的细胞中评估了伊那沙普林的细胞活性。用该化合物处理细胞，并评估其对APOL1介导的细胞死亡的影响。通过测量离子流证实了该化合物抑制APOL1通道功能的能力。此外，还评估了其对细胞活力和信号通路的影响。

研究人员构建了APOL1 G2变异纯合子的转基因小鼠模型，并通过向G2纯合子小鼠注射γ干扰素诱导肾功能障碍；生理盐水（载体）注射作为阴性对照。为了评估降低蛋白尿的潜力，我们在γ干扰素注射前3天，对G2纯合子小鼠预防性地给予伊那沙普林（剂量为3 mg/kg体重，每日三次）或载体（见补充附录图S1，可在NEJM.org网站查阅本文全文）。我们每24小时采集一次尿白蛋白/肌酐比值，持续72小时。[1]在动物研究中，伊那沙普林通常以口服方式用于APOL1相关肾病模型。给药方案根据其药代动力学特性确定。疗效终点包括肾功能评估（例如，蛋白尿、肾小球滤过率）、组织病理学和肾损伤生物标志物。

伊那沙普林的分子量为 417.38 g/mol，化学式为 C21H18F3N3O3。它可口服，通常以粉末形式储存于 -20°C。详细的药代动力学参数，例如半衰期和生物利用度，可从临床前和临床研究中获得。

伊那沙普林的毒性特征正在临床前和临床研究中进行评估。作为首创的APOL1抑制剂，其安全性是研发的关键考量因素。目前正在临床试验中评估其在肾病患者中的安全性。

[1]. WO2020131807.

背景：载脂蛋白L1 (APOL1) 基因中存在毒性功能获得性变异的个体罹患快速进展性蛋白尿肾病的风险更高。尽管其遗传病因已明确，但目前尚缺乏针对携带两种APOL1变异体（G1或G2）患者的蛋白尿肾病的有效治疗方法。方法：我们使用四环素诱导的APOL1人胚肾细胞(HEK293)评估了小分子化合物inaxaplin抑制APOL1通道功能的能力。此外，我们还使用APOL1 G2同源转基因小鼠蛋白尿肾病模型评估了inaxaplin治疗蛋白尿的疗效。随后，我们开展了一项单臂、开放标签的IIa期临床试验，对携带两种APOL1变异体、经活检确诊为局灶节段性肾小球硬化症和蛋白尿（尿蛋白/肌酐比值≥0.7至<10 [蛋白质和肌酐单位为克]，且估算肾小球滤过率≥27 ml/min/1.73 m²体表面积）的受试者给予依诺普利林治疗。受试者每日服用依诺普利林，持续13周（前2周15 mg，后11周45 mg），同时接受标准治疗。主要终点为第13周尿蛋白/肌酐比值较基线的百分比变化，且至少80%的受试者坚持服用依诺普利林。同时评估了安全性。结果：在临床前研究中，依诺普利林在体外选择性抑制APOL1通道功能，并在小鼠模型中降低蛋白尿。共有16名受试者入组IIa期研究。在13名接受伊那沙普林治疗且达到依从性阈值的受试者中，第13周时尿蛋白/肌酐比值较基线平均下降47.6%（95%置信区间，-60.0%至-31.3%）。在纳入所有受试者（无论伊那沙普林依从性如何）的分析中，除1名受试者外，其余受试者均观察到与主要分析中类似的下降。不良事件的严重程度为轻度或中度；无不良事件导致研究终止。结论：伊那沙普林靶向抑制APOL1通道功能可降低携带两种APOL1变异体和局灶节段性肾小球硬化症患者的蛋白尿。 （由Vertex Pharmaceuticals赞助；ClinicalTrials.gov注册号：VX19-147-101，NCT04340362。）[1]

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引言：毒性增强型载脂蛋白L1 (APOL1) 变异体是导致蛋白尿性肾病（统称为APOL1介导的肾病，AMKD）的因素之一。尽管接受标准治疗，AMKD患者仍会更快地进展至终末期肾病。目前已确定两种APOL1变异体是AMKD的遗传病因，这促使人们开发了inaxaplin，一种APOL1通道活性抑制剂，可降低AMKD患者的蛋白尿。方法：我们开展了两项I期临床研究，以评估单次递增（SAD）和多次递增（MAD）inaxaplin在健康受试者中的安全性、耐受性和药代动力学。在单剂量（SAD）组中，受试者被随机分配接受单次剂量的依诺普利林（剂量范围：7.5 mg 至 165 mg）或安慰剂。在多剂量（MAD）组中，受试者被随机分配接受多次剂量的依诺普利林（剂量范围：每日 15 至 120 mg）或安慰剂，疗程为 14 天。我们根据不良事件（AE）、临床实验室检查值、心电图（ECG）和生命体征评估了安全性和耐受性。结果：两项研究的 SAD/MAD 组共纳入 178 名受试者（平均年龄：36.7 岁；94.9% 为男性）。依诺普利林组（24.6%）和安慰剂组（22.7%）发生不良事件的受试者比例相似。所有不良事件均为轻度或中度；未发生严重不良事件。头痛是最常见的不良事件：依诺普利林组为 10.4%，安慰剂组为 2.3%。未发生与药物相关的治疗中断，实验室检查值、心电图或生命体征均未观察到具有临床意义的趋势。讨论/结论：单次服用剂量高达 165 mg 的依诺普利林以及每日多次服用剂量高达 120 mg（持续 14 天）的依诺普利林均安全且耐受性良好。这些结果与已完成的 IIa 期概念验证研究中依诺普利林良好的安全性特征一致。总之，这些发现支持在正在进行的关键性 II/III 期试验中继续评估依诺普利林作为 AMKD 患者潜在精准治疗药物的疗效。[2]

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Inaxaplin（VX-147，CAS：2446816-88-0）是一种首创的口服活性 APOL1 功能抑制剂。该药物对APOL1具有强效抑制作用（IC50值在低纳摩尔范围内），使其成为治疗APOL1相关肾病的一种极具前景的疗法。它的研发代表了该疾病治疗领域的一项重大进展，并凸显了靶向APOL1的巨大潜力。

C21H18F3N3O3

417.381135463715

417.13

C, 60.43; H, 4.35; F, 13.66; N, 10.07; O, 11.50

2446816-88-0

147289591

White to off-white solid powder

2.1

94.2Ų

4

6

5

30

646

2

C1[C@H]([C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CCC2=C(NC3=C2C=C(C=C3F)F)C4=CC=C(C=C4)F)O

CTXLPYZCBOVVQK-UZLBHIALSA-N

InChI=1S/C21H18F3N3O3/c22-11-3-1-10(2-4-11)18-13(14-7-12(23)8-15(24)19(14)27-18)5-6-17(29)26-20-16(28)9-25-21(20)30/h1-4,7-8,16,20,27-28H,5-6,9H2,(H,25,30)(H,26,29)/t16-,20+/m1/s1

3-[5,7-difluoro-2-(4-fluorophenyl)-1H-indol-3-yl]-N-[(3S,4R)-4-hydroxy-2-oxopyrrolidin-3-yl]propanamide

Inaxaplin; S2SJ2RVZ6Y; UNII-S2SJ2RVZ6Y; VX-147; Inaxaplin?; CHEMBL5083170; Inaxapline; Inaxaplina;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~119.79 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。