Inaxaplin (VX-147)

Apolipoprotein L1 (APOL1)

研究人员使用四环素诱导的APOL1人胚胎肾（HEK293）细胞来评估小分子化合物伊那沙普林抑制APOL1通道功能的能力。Inaxaplin是载脂蛋白L1的功能性激酶。它在体外抑制选择性抑制的APOL1通道功能[1]。

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体外和体内研究表明，Inaxapli直接与APOL1蛋白结合，抑制APOL1通道功能。具体而言，在细胞检测中，Inaxapli以浓度依赖的方式阻断了APOL1的通道功能，如四环素诱导的APOL1 HEK293细胞中APOL1诱导的铊离子通量减少所示（图1A）。在该细胞模型中，在没有APOL1表达的情况下，铊通量最小，通过给予伊那沙普林，APOL1介导的铊通量几乎被消除（图1B）。Inaxaplin直接与APOL1蛋白结合，如微型热泳结合试验所示（图1C）[1]。

在APOL1 G2纯合转基因小鼠模型中，注射干扰素γ导致严重蛋白尿；相比之下，当对照Friend白血病病毒B（FVB）小鼠暴露于干扰素γ时，没有观察到蛋白尿。预防性给药Inaxaplin/伊那沙普林（每公斤3毫克，每天三次）或赋形剂3天，第一剂在干扰素-γ注射前约1.5小时的第1天给药，显著降低了注射干扰素-γ的G2纯合子小鼠的平均尿白蛋白与肌酐比值的曲线下面积，平均降低了74.1%（图1D和图S3）。

为了评估Inaxaplin/伊那沙普林对APOL1的直接靶向作用，研究人员开发了一种使用荧光标记的重组APOL1蛋白的微型热泳结合试验。通过荧光标记的APOL1的变化来定量伊那沙普林与APOL1的结合[1]。

为了量化Inaxaplin/伊那沙普林对APOL1离子通量的影响，研究人员构建了在四环素启动子控制下表达APOL1参考序列（G0）和两种疾病相关变体（G1和G2）的诱导、培养的人胚胎肾（HEK293）细胞系。对Inaxaplin对铊离子通量的影响进行了评估，铊离子通量是钾离子通量的替代品。使用铊敏感染料对铊离子流入细胞的流量进行定量[1]。

研究人员构建了APOL1 G2变异纯合子的转基因小鼠模型，并通过向G2纯合子小鼠注射γ干扰素诱导肾功能障碍；生理盐水（载体）注射作为阴性对照。为了评估降低蛋白尿的潜力，我们在γ干扰素注射前3天，对G2纯合子小鼠预防性地给予伊那沙普林（剂量为每公斤体重3毫克，每日三次）或载体（见补充附录图S1，可在NEJM.org网站查阅本文全文）。我们每24小时采集一次尿白蛋白/肌酐比值，持续72小时。[1]

[1]. WO2020131807.

背景：载脂蛋白L1 (APOL1) 基因中存在毒性功能获得性变异的个体，罹患快速进展性蛋白尿肾病的风险更高。尽管已知其遗传病因，但目前尚缺乏针对携带两种APOL1变异体（G1或G2）患者的蛋白尿肾病的有效疗法。方法：我们利用四环素诱导型APOL1人胚肾细胞(HEK293)评估了小分子化合物inaxaplin抑制APOL1通道功能的能力。此外，我们还利用APOL1 G2同源转基因小鼠蛋白尿肾病模型评估了inaxaplin治疗蛋白尿的疗效。随后，我们开展了一项单组、开放标签的 IIa 期临床研究，研究中，我们向携带两种 APOL1 变异、经活检证实患有局灶节段性肾小球硬化症且伴有蛋白尿（尿蛋白/肌酐比值 ≥0.7 至 <10 [蛋白质和肌酐均以克为单位]，且估算肾小球滤过率 ≥27 ml/min/1.73 m² 体表面积）的受试者给予伊那沙普林治疗。受试者每日服用伊那沙普林，持续 13 周（前 2 周 15 mg，后 11 周 45 mg），同时接受标准治疗。主要终点是第 13 周时尿蛋白/肌酐比值较基线的百分比变化，研究对象为至少 80% 依从伊那沙普林治疗的受试者。安全性也进行了评估。结果：在临床前研究中，inaxaplin 在体外选择性抑制 APOL1 通道功能，并降低了小鼠模型中的蛋白尿。共有 16 名受试者入组 IIa 期研究。在接受 inaxaplin 治疗且达到依从性阈值的 13 名受试者中，第 13 周时尿蛋白/肌酐比值较基线平均下降 47.6%（95% 置信区间，-60.0 至 -31.3）。在纳入所有受试者（无论其 inaxaplin 治疗依从性如何）的分析中，除 1 名受试者外，其余受试者均观察到与主要分析中相似的下降。不良事件的严重程度为轻度或中度；无不良事件导致研究终止。结论：使用 inaxaplin 靶向抑制 APOL1 通道功能可降低携带两种 APOL1 变异体和局灶节段性肾小球硬化症患者的蛋白尿。 （由Vertex Pharmaceuticals公司资助；ClinicalTrials.gov注册号：VX19-147-101，NCT04340362。）[1]

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引言：毒性功能获得性载脂蛋白L1 (APOL1) 变异体是导致蛋白尿性肾病（统称为APOL1介导的肾病，AMKD）的因素之一。尽管接受了标准治疗，AMKD患者仍会加速进展至终末期肾病。两种APOL1变异体被确定为AMKD的遗传病因，这促使人们开发了inaxaplin，一种APOL1通道活性抑制剂，可降低AMKD患者的蛋白尿。方法：我们开展了两项I期临床研究，评估健康受试者单次递增剂量（SAD）和多次递增剂量（MAD）inaxaplin的安全性、耐受性和药代动力学。在单次给药（SAD）组中，受试者被随机分配接受单剂量伊那沙普林（剂量范围：7.5 mg 至 165 mg）或安慰剂。在多次给药（MAD）组中，受试者被随机分配接受多次给药伊那沙普林（剂量范围：每日 15 至 120 mg）或安慰剂，疗程为 14 天。我们根据不良事件（AE）、临床实验室检查值、心电图（ECG）和生命体征评估了安全性和耐受性。结果：两项研究的 SAD/MAD 组中共有 178 名受试者被随机分配（平均年龄：36.7 岁；94.9% 为男性）。伊那沙普林组（24.6%）和安慰剂组（22.7%）中出现任何不良事件的受试者比例相似。所有不良事件均为轻度或中度；未发生严重不良事件。头痛是最常见的不良事件：在伊那沙普林组和安慰剂组中分别为 10.4% 和 2.3%。未发生与药物相关的治疗中断，实验室检查值、心电图或生命体征也未出现具有临床意义的趋势。讨论/结论：单次服用剂量高达 165 mg 的伊那沙普林以及每日多次服用剂量高达 120 mg（持续 14 天）的伊那沙普林均安全且耐受性良好。这些结果与已完成的 IIa 期概念验证研究中伊那沙普林良好的安全性特征相符。综上所述，这些发现支持在正在进行的 II/III 期关键性试验中继续评估伊那沙普林作为 AMKD 患者潜在精准治疗药物的价值。[2]

C21H18F3N3O3

417.381135463715

417.13

C, 60.43; H, 4.35; F, 13.66; N, 10.07; O, 11.50

2446816-88-0

147289591

White to off-white solid powder

2.1

94.2Ų

4

6

5

30

646

2

C1[C@H]([C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CCC2=C(NC3=C2C=C(C=C3F)F)C4=CC=C(C=C4)F)O

CTXLPYZCBOVVQK-UZLBHIALSA-N

InChI=1S/C21H18F3N3O3/c22-11-3-1-10(2-4-11)18-13(14-7-12(23)8-15(24)19(14)27-18)5-6-17(29)26-20-16(28)9-25-21(20)30/h1-4,7-8,16,20,27-28H,5-6,9H2,(H,25,30)(H,26,29)/t16-,20+/m1/s1

3-[5,7-difluoro-2-(4-fluorophenyl)-1H-indol-3-yl]-N-[(3S,4R)-4-hydroxy-2-oxopyrrolidin-3-yl]propanamide

Inaxaplin; S2SJ2RVZ6Y; UNII-S2SJ2RVZ6Y; VX-147; Inaxaplin?; CHEMBL5083170; Inaxapline; Inaxaplina;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~119.79 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。