Trifluoromethyl-tubercidin (TFMT)   中文名称: 三氟甲基结核菌素

MTr1 (2'-O-ribose methyltransferase 1)

在第三步中，研究人员评估了哪些已鉴定的化合物在最低浓度下具有抑制作用，并最终确定了最有效的化合物是Trifluoromethyl-tubercidin/三氟甲基tubercidin（TFMT）（图2A在图像查看器中打开，图S8、A和B）。我们分别通过计算机对接和体外热位移分析证实了TFMT与MTr1和重组MTr1的SAM结合袋的结合（图2BOpen in image viewer和图S8C）。此外，我们证实TFMT抑制重组MTr1蛋白的MTase活性（图S8D）。我们还证实，TFMT对IAV和IBV有效，但对HAZV或STBV无效（图2COpen在图像查看器中），与图1Open在图像浏览器和图S6中显示的MTr1缺乏症表型完全匹配。TFMT对IAV感染的中位抑制浓度（IC50）为0.30μM，在有效浓度范围内没有观察到明显的体外毒性，如水溶性四唑（WST）-8细胞存活率测定所示（图2D在图像查看器中打开）。TFMT治疗在感染后3至4小时给药时也大大抑制了IAV的复制；然而，如果稍后给药，效果会减弱或不可见（图S8E）[1]。

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Trifluoromethyl-tubercidin/三氟甲基结核菌素/TFMT[1]的抗流感疗效
接下来，研究人员检测了正常人支气管上皮（NHBE）细胞中三氟甲基结核菌素/TFMT的抗IAV活性。TFMT治疗以剂量依赖的方式显著降低了IAV（H1N1，PR8）的RNA和蛋白质水平。组织学分析还显示，TFMT处理的NHBE细胞中IAV NP水平显著降低，且无细胞毒性。TFMT处理没有抑制HAZV复制，表明即使在人类原代细胞中，该化合物对某些病毒的特异性疗效也得以保留。由于该化合物在人NHBE细胞中有效，这促使我们将TFMT作为离体环境在人肺外植体中进行评估（图S9A）。我们用IAV（H1N1，2019年的季节性分离株）感染肺组织，并在感染后1、24、48和72小时用空斑试验测定上清液中的病毒滴度。如图3A所示，在图像查看器中打开时，感染后48或72小时，未处理样本的滴度增加了>105个斑块形成单位（PFU）/ml，而TFMT处理的肺外植体的滴度保持在<103个PFU/ml，表明治疗抑制了100到1000倍。所有六个独立供体的滴度之和显示了对照组和TFMT治疗之间的差异——培养上清液中的IAV滴度降低。感染后12小时IAV的TFMT治疗显著损害了人肺外植体中的病毒生长（图S9C）。与观察到的病毒滴度一致，在用TFMT治疗的IAV感染的肺组织中没有观察到IAV NP阳性细胞或形态学变化。这些结果表明，TFMT抑制季节性IAV分离物的体外复制，并显示出临床转化的潜力。

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TFMT/三氟甲基结核菌素/Trifluoromethyl-tubercidin抑制IAV帽夺[1]
如图4A所示，在图像查看器中打开，TFMT处理对IAV复制的影响与IFIT1依赖的RNA或RIG-I或MDA5信号隔离无关。我们发现RIG-I-MTr1双KO细胞或IFIT1-MTr1双KO细胞中没有IAV的复制，与MTr1 KO细胞相似（图S11、A和B）。此外，JAK抑制剂托法替尼阻断IFN信号传导时，MTr1 KO细胞中的IAV复制并不伴随（图S12、C和D）。已知缺失非结构蛋白1（IAVΔNS1）的甲型流感病毒可诱导高IFN反应，在没有IFN和ISG（干扰素刺激基因）诱导的情况下，其在MTr1缺陷细胞中的复制被阻止，但被MTr1过表达挽救（图S2、D和E）。TFMT治疗在A549细胞和PBMC中均未诱导IFN-β或抗病毒ISG。这些结果证实，观察到的抗病毒作用不依赖于抗病毒IFN反应的激活。TFMT治疗不会改变IFN敏感的非帽状RNA病毒的复制，如仙台病毒（SeV）、水疱性口炎病毒（VSV）和脑心肌炎病毒（EMCV），同样，在MTr1 KO细胞中（图S13）也是如此。TFMT处理会损害特异性从U2剪接体snRNA中捕获的IAV mRNA（片段1）的表达，与MTr1缺乏的影响相似。因此，我们得出结论，TFMT治疗通过直接影响IAV的夺帽活性而不是通过免疫调节来抑制IAV的复制。

研究人员在小鼠身上测试了这种化合物的体内功效。他们首先证实，TFMT/三氟甲基结核菌素在IAV感染的小鼠细胞系LA-4中显示出抑制活性，尽管其效力（IC50=7.7μM）低于人类细胞（图S10A）。接下来，我们评估了小鼠每天一次鼻内接种2天的体内毒性。尽管用亲本化合物tubercidin治疗导致小鼠体重大幅减轻，但我们没有观察到所选衍生物TFMT在肺部有任何体重减轻或细胞毒性（图3D在图像查看器中打开，图S10B）。最后，我们在感染IAV后2天检查了TFMT治疗的效果。此时，TFMT治疗显著降低了小鼠肺部NP和PB2 mRNA水平，表明三氟甲基取代的tubercidin将体内毒性降低到我们无法检测到的水平，但保留了抗IAV的功效（图3E在图像查看器中打开）。我们还证实了在这种情况下，巴洛西韦（BXM）在体内的抗病毒功效（图S10C）。综上所述，TFMT显示出在所有测试系统中抑制IAV复制的潜力，包括体外的人细胞系和NHBE细胞、体外的人肺外植体和体内的小鼠[1]。

[1]. Inhibition of cellular RNA methyltransferase abrogates influenza virus capping and replication. Science. 2023 Feb 10;379(6632):586-591.

Orthomyxoviruses and Bunyaviruses steal the 5' cap structure of the host RNA to initiate their own transcription, a process known as "cap stealing". We found that RNA modification of the cap structure by the host 2'-O-ribose methyltransferase 1 (MTr1) is crucial for the initiation of influenza A and B virus replication, but not for other cap stealing viruses. We identified a streptococcal natural product derivative, trifluoromethyltuberculin (TFMT), by interacting with the S-adenosine-L-methionine binding pocket of MTr1 to inhibit MTr1 and thus limit influenza virus replication. Mechanistically, TFMT weakens the binding of the host cap RNA to the basic protein 2 subunit of the viral polymerase, a phenomenon observed in human lung tissue explants and in vivo mice. TFMT has a synergistic effect with approved anti-influenza drugs. [1]

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There are currently approved drugs targeting influenza virus proteins; however, all drugs have been found to have drug-resistant viral mutants. Host-targeted antiviral drugs have a low likelihood of inducing resistance. The host mitogen-activated protein kinase inhibitor ATR-002 has been shown to have broad efficacy against various RNA viruses, including influenza and SARS-CoV-2, through its mechanism of action by inhibiting viral replication and modulating the inflammatory response. In this study, we demonstrated the anti-influenza efficacy of the cellular RNA methyltransferase inhibitor trifluoromethyltuberculin/TFMT. Considering the potential toxicity of long-term host-targeting, dose reduction and combination with other approved antiviral drugs (such as BXM and oseltamivir) are feasible. We found that TFMT is a highly specific and non-toxic MTr1 inhibitor that specifically inhibits the replication of cap-dependent viruses (such as IAV and IBV) (Figure S19). Overall, our data indicate that TFMT's inhibition of MTr1 cap-dependent replication specifically inhibits the replication of various IAV and IBV strains, including seasonal H1N1 isolates and a highly pathogenic avian influenza virus resistant to BXM. Mechanistically, TFMT leads to MTr1 dysfunction and cap0 RNA accumulation, thereby impairing the binding of the viral polymerase subunit PB2 to the host cap RNA, thus hindering IAV polymerase-mediated cap capture and viral RNA synthesis. TFMT and BXM have a synergistic effect because the two drugs target different polymerase subunits, PB2 and PA, respectively. TFMT-dependent IAV inhibition is independent of RIG-I and IFIT1-mediated innate immune responses, and TFMT has no effect on the replication of interferon-sensitive viruses (such as VSV and EMCV). Comparison of the PB2 subunits of influenza virus and THOV shows that the primary structure of the cap RNA binding region (e.g., N1-2′-O-Me interacting amino acids) of IAV PB2 is conserved in IBV PB2, but not in ICV, IDV, or THOV PB2 (Figure S14B). Furthermore, IAV requires 10 to 13 nucleotides to capture the cap structure, while THOV is reported to capture the 5′-terminal m7G cap residue. The difference in the mechanism of cap-capping by viral polymerases may explain the specificity of TFMT restriction to IAV and IBV. [1]

C12H13F3N4O4

334.251232862473

334.088

1854086-05-7

118636125

White to off-white solid powder

-0.5

127

4

10

2

23

443

4

C1=C(C2=C(N=CN=C2N1[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)CO)O)O)N)C(F)(F)F

RSOXZOFDCJMRMK-IOSLPCCCSA-N

InChI=1S/C12H13F3N4O4/c13-12(14,15)4-1-19(10-6(4)9(16)17-3-18-10)11-8(22)7(21)5(2-20)23-11/h1,3,5,7-8,11,20-22H,2H2,(H2,16,17,18)/t5-,7-,8-,11-/m1/s1

(2R,3R,4S,5R)-2-[4-amino-5-(trifluoromethyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol

Trifluoromethyl-tubercidin; 1854086-05-7; (2R,3R,4S,5R)-2-[4-amino-5-(trifluoromethyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol; TFMT?; SCHEMBL17406905; RSOXZOFDCJMRMK-IOSLPCCCSA-N; NSC793694; NSC-793694;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。