WM382

Plasmepsin IX/X (PMIX/X); Plasmodium

WM382 抑制恶性疟原虫和间日疟原虫，对恶性疟原虫的 IC50 值为 0.6 nM，并对 HepG2 细胞表现出相当大的细胞毒性 (IC50=24.8 μM)[2][3]。 WM382 的 Ki 值分别为 13.4 μM 和 0.035 nM，选择性结合 PMV 和 PMX[3]。在伯氏疟原虫感染的 HepG2 体外培养物中，WM382（1 nM 和 100 nM）提醒注射后达到血液感染的时间[3]。

在伯氏疟原虫和恶性疟原虫寄生虫小鼠模型中，WM382（20 mg/kg，每日两次或 1-30 mg/kg，每日一次；口服；持续 4 天）可有效消除感染。 WM382 可以有效治疗人源化小鼠的无性恶性疟原虫感染，同时还能阻止蚊子传播[3]。

恶性疟原虫白酶加工抑制试验[2]
蛋 加工抑制试验基本上按照之前的描述进行（Favuzza等人，2020）。将蛋白酶抑制剂添加到同步的后期滋养体/早期分裂体培养物中，然后通过LD或LS磁柱去除未感染的红细胞。WM4和WM382分别以40 nM和2.5 nM的终浓度加入。不含蛋白酶抑制剂的对照盘。用含有相同浓度抑制剂的完整RPMI 1640培养基洗脱柱上的寄生虫。将洗脱的寄生虫调整为5 × 106个/mL，每孔添加150 mL， 96孔平底培养皿。寄生虫培养16小时，并涂片代表性孔进行吉氏染色，以确保破裂正常发生（对照孔）或破裂被阻断（WM4, WM382>条件）。寄生虫以10000 g/10 min离心，收集分殖子和上清。将两个部分的蛋白质加入还原样品缓冲液中，用4-12%或3-8%的丙烯酰胺凝胶分离，用于后续的免疫印迹。

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表面等离子体共振[2]
PvPMX或PfPMX蛋白酶通过胺偶联固定在CM5传感器芯片上，在10 mM激活的pH 5.5中，以10 mL min - 1的流速注射420 s，通常固定约4000 RU的蛋白质。所有实验均在HBS-EP缓冲液（10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl， 3 mM EDTA和0.05%吐温20）中进行，温度为18°C，流速为30 mL min - 1。将化合物WM4和WM382在HBS-EP +缓冲液中稀释至0.031 nM - 16 nM范围内的适当浓度。接触时间为90 s，分离时间为1500 s，然后用50 mM甘氨酸pH 9.5进行30 s再生。使用新固定的传感器表面独立进行了三次实验。PvPMX数据采集于BIAcore S200仪器，数据分析软件版本为BIAcore S200 1.1； PfPMX数据采集于BIAcore 8K+仪器，数据分析软件版本为BIAcore Insight 3.0.12.15655。所有传感器图均采用活化的乙醇胺阻断传感器表面和HBS-EP +缓冲空白进行双重参考。使用1:1的结合模型拟合WM4的打开和关闭率来确定亲和力，由于关闭率太慢，无法报告WM382的亲和力。

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CETSA热稳定性测定[3]
Lysate CETSA实验基本上按照描述进行（Dziekan et al., 2019）。CETSA研究样品采用高度同步分裂期恶性疟原虫3D7-PMIX_HA和3D7-PMX_HA寄生虫制备。后期寄生虫（入侵后40-44小时）通过Percoll密度梯度纯化，并与1 μM化合物1 （C1）抑制剂（内部合成）孵育（Hale等，2017）。孵育2-4 h后，成熟分裂体用PBS洗涤1次，感染的红细胞在20体积0.15% （w/v）皂苷的PBS中裂解，冰孵育20分钟。寄生虫在冰冷的PBS中洗涤3次，最终的球在10体积裂解缓冲液（0.4% NP-40 (Roche) / PBS）中重悬，通过3次冷冻（干冰/乙醇浴）-解冻循环裂解。裂解物在16000 g离心30分钟后清除，含有可溶性寄生虫蛋白的上清液在−80℃保存至使用。将化合物601 （5 μM）、WM4 （2 μM）和WM382 (1 μM)加入到8 × 50 μg蛋白裂解液等分液中（蛋白质浓度通过BCA蛋白测定法测定），室温（RT）孵育3min，在Biorad T100热循环器中分别在65-40℃温度梯度下加热3min，然后在4℃孵育3min。加热后的裂解物在4℃下13000 g离心30分钟。根据制造商的说明，在预制的4%-12%梯度凝胶上用MES运行缓冲液溶解可溶性蛋白质。

敲除疟原虫的EC50测定[3]
培养环期恶性疟原虫3D7、3D7- pmix - ha和3D7- pmix - ha，同时增加GlcN （Sigma）浓度。37℃孵育72 h后，用0.06%皂苷溶解滋养体感染的红细胞，用2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液溶解微球，进行抗ha免疫检测。如前面所述，在2.5 nM GlcN（分别是ha标记蛋白的正常表达和减少表达）缺失和存在的情况下，通过FACS和SYBR Green测定WM4和WM382对恶性疟原虫3D7、3D7- pmix - ha和3D7- pmx - ha寄生虫的抑制EC50。

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药物杀伤时间[3]
用5%山梨醇（Sigma）同步3D7寄生虫培养，每隔46 h同步两次，然后当培养中混合了晚分裂体和早分裂体时再次同步。在3%环数和4%红细胞压积的条件下，分别建立3份10ml的培养液，分别含有80nM WM4、40nM WM5、5nM WM382或DMSO （Sigma）载体对照。每个培养物每8 h定量一次，共48 h，采集50 μL样品，流式细胞术计数（如前所述）。用吉姆萨染色血膜显微镜检查各时间点寄生虫的发育阶段。在32 h时间点更换培养基和化合物。

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入侵检测[3]
山梨醇处理与环期添加WM4 （40 nM）、WM382 (2.5 nM)或DMSO对照同步培养3D7寄生虫。后期寄生体（入侵后40 h）通过磁分离富集，发育为完全节段的分裂体寄生体。为了防止分裂体破裂和分裂子释放，对照寄生虫用1 μM化合物1 （C1）孵育。孵育5-6小时后，将寄生液泡膜封闭的分生子（PEMS）制成颗粒，在小体积完整培养基（含WM4， WM382或C1）中重悬，并通过1.2 μm注射器过滤器(Acrodisc；32毫米;棺罩)。将含有纯化的分裂子的滤液立即加入新鲜红细胞（70%-80%的红细胞比容）中，在摇床（1100转/分）中37℃孵育20分钟，使宿主细胞浸润，然后稀释至2%的红细胞比容。37℃孵育24小时后，通过显微镜（giemsa染色薄涂片）和流式细胞术测量寄生虫率来评估侵袭情况

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电阻时间的测定[3]
实验1将105、106、107、108和109株Dd2寄生虫分别暴露于10 nM的atovaquone或1.5 nM WM382环境中，监测90 d。实验2将106、107和108 Dd2寄生虫的三次培养分别暴露于5 nM的atovaquone、80 nM的WM5或1.5 nM WM382中，监测62天。每个实验都通过每周一次的血膜显微镜检查来监测。每周更换三次培养基和化合物。

动物/疾病模型：感染伯氏疟原虫的小鼠[3]
剂量：20 mg/kg
给药途径：灌胃（po）；每日两次，持续4天；监测30天
实验结果：治愈了伯氏疟原虫感染的小鼠，并预防了肝脏引起的血液感染。

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动物/疾病模型：人源化非肥胖糖尿病-重症联合免疫缺陷（NOD-scid）IL2Rgnull小鼠模型（NSG）[3]
剂量：1、3、10、30 mg/kg
给药途径：灌胃（po）；每日一次，持续4天；监测7天
实验结果： 30 mg/kg剂量组在第6天或3 mg/kg和10 mg/kg剂量组在第7天清除寄生虫血症。\n

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\n\n伯氏疟原虫感染小鼠剂量范围试验[3]
\n在剂量范围研究中，小鼠分别以每日两次（bid）给药方案（剂量分别为30、10、3或1 mg/kg/天，图4B）或每日一次（qd）给药方案（剂量分别为60、30或10 mg/kg/天，图4C）口服WM382，连续4天，首次给药时间为感染后2小时。对照组小鼠以每日一次（qd）给药方案（剂量为10 mg/kg/天）口服氯喹，连续4天。感染后第2天至第30天，每日采用流式细胞术和显微镜检查法检测寄生虫血症，如上所述。感染后第30天存活且外周血中未检测到寄生虫的动物被认为已治愈（即100%疗效）。\n

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\n\n恶性疟原虫人源化NOD-scid IL2R_null小鼠模型[3]
\n在小鼠恶性疟原虫SCID模型中测试化合物（Angulo-Barturen等人，2008）。简而言之，将WM382配制于20% DMSO、60%丙二醇和20%水中，并给予一组年龄匹配的、先前已移植人红细胞的免疫缺陷NOD-scid IL-2Rγnull雌性小鼠。小鼠经静脉注射感染2 × 10⁷个恶性疟原虫Pf3D7感染的红细胞（第0天）（Angulo-Barturen等，2008）。感染后第3天，将小鼠随机分配至不同治疗组，连续4天每天一次，通过灌胃给予10 mL/kg的药物（每组n = 3只小鼠）。采用显微镜检查法测定寄生虫血症。使用抗鼠红细胞 TER119 单克隆抗体和 SYTO-16 通过流式细胞术监测嵌合体，然后对每 24 小时采集的 2 μL 连续血样进行流式细胞术分析，直至实验完成。\n

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\n伯氏疟原虫肝脏寄生虫生长及向血液感染转变的体内分析 [3]
\n雌性 BALB/c 小鼠通过静脉注射或感染性蚊虫叮咬感染 PbmCherryLuci 子孢子。小鼠（通过任一途径感染）未接受任何治疗或接受 WM382（制备方法如前所述）口服治疗，剂量和感染后时间 (hpi) 见图示。对于静脉注射，将新鲜分离的唾液腺子孢子用玻璃棉过滤以去除杂质，然后在注射前将40,000个子孢子重悬于200 μL施耐德昆虫培养基中。对于蚊虫叮咬感染，根据蚊子携带卵囊的百分比，将5只感染的蚊子放入单独的喂食杯中（例如，如果该批次蚊子中有83%携带卵囊，则每个喂食杯中放入6只蚊子）。用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，然后将其放置在单独的喂食杯中开始感染。允许蚊子叮咬小鼠15分钟，每分钟将小鼠在不同的喂食杯之间轮换，以促进蚊子探查并确保所有小鼠均等地暴露于感染性蚊虫叮咬。从感染后第3天到第30天，每天监测小鼠吉姆萨染色血涂片中是否存在寄生虫，如果在此期间血涂片检测结果始终为阴性，则认为小鼠已免受血液感染。\n\n

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\nPeters 小鼠伯氏疟原虫感染4天抑制试验[3]
\n对于图1所示的结果，将1 × 10⁶个从先前感染的供体小鼠体内抽取的、被伯氏疟原虫ANKA株寄生的红细胞腹腔注射(IP)给雄性瑞士小鼠。测试化合物配制于由10% DMSO/90% Solutol（5% Solutol® HS-15溶于0.9%生理盐水）组成的溶剂中。感染后2小时，小鼠连续4天（每日一次，qd方案）接受腹腔注射试验化合物（WM4、WM5：20 mg/kg）或氯喹（10 mg/kg），或接受腹腔注射溶剂作为对照。末次给药后24小时采集外周血样本，并通过吉姆萨染色血涂片的显微镜分析检测寄生虫血症。寄生虫血症数值为每组6只小鼠的平均值，并以寄生虫血症百分比表示。如图 4A 所示，将表达 GFP 的血期伯氏疟原虫（P. berghei ANKA GFPcon 259cl2 (Franke-Fayard et al., 2004)）腹腔注射（IP）给“供体”雌性瑞士小鼠。三天后，将 4 只一组的“受体”瑞士小鼠静脉注射（IV）来自“供体”小鼠的 1 × 10⁷ 个感染红细胞。感染两小时后，实验小鼠（每组 4 只）不进行任何处理（对照组），或连续 4 天口服测试药物（溶于 20% DMSO/60% PG/20% 水 (v/v/v) 溶液）或氯喹（溶于水）。小鼠以每日两次（bid）给药方案接受 WM382 治疗，持续 4 天。每日给予小鼠 mpk，首次给药时间为感染后 2 小时。末次给药后 12 小时采集外周血样本，采用流式细胞术（使用 BD 公司的 FACSCalibur 流式细胞仪，检测 100,000 个记录事件中 GFP 阳性细胞的比例）和吉姆萨染色血涂片显微镜分析法测定寄生虫血症。每组 4 只小鼠的寄生虫血症数值为平均值，以寄生虫血症百分比表示。

口服生物利用度（大鼠为 8%，小鼠为 38%）

血浆蛋白结合率 = 95%

[1]. Manuel de LR, et al. The Invention of WM382, a Highly Potent PMIX/X Dual Inhibitor toward the Treatment of Malaria. ACS Med Chem Lett. 2022 Oct 12.
[2]. Hodder AN, et al. Basis for drug selectivity of plasmepsin IX and X inhibition in Plasmodium falciparum and vivax. Structure. 2022 Jul 7;30(7):947-961.e6.
[3]. Favuzza P, et al. Dual Plasmepsin-Targeting Antimalarial Agents Disrupt Multiple Stages of the Malaria Parasite Life Cycle. Cell Host Microbe. 2020 Apr 8;27(4):642-658.e12.

对包括青蒿素在内的一线抗疟药物的耐药性日益增强，因此迫切需要发现具有全新作用机制的新药。在沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所的合作以及惠康基金会的资助下，默克公司利用其天冬氨酸蛋白酶抑制剂库进行表型筛选，发现了一系列比氯喹更有效的疟原虫蛋白酶X (PMX) 抑制剂。受PMX同源模型的启发，研究人员致力于优化这些抑制剂的效力，最终发现了一些先导化合物，这些化合物不仅能有效抑制PMX，还能抑制另一种重要的天冬氨酸蛋白酶——疟原虫蛋白酶IX (PMIX)。进一步的效力和药代动力学优化工作最终发现了WM382，这是一种非常有效的PMIX/X双重抑制剂，在疟原虫生命周期的多个阶段均具有强大的体内疗效，且耐药性极佳。[1]

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疟原虫蛋白酶IX (PMIX) 和X (PMX) 是疟原虫属寄生虫出胞、入侵和发育所必需的天冬氨酸蛋白酶。WM4和WM382均能抑制恶性疟原虫和间日疟原虫中的PMIX和PMX。WM4抑制PMX，而WM382是PMIX和PMX的双重抑制剂。为了解它们的功能，我们鉴定了它们的蛋白质底物。酶动力学和结构分析揭示了决定药物特异性的相互作用。PMIX和PMX具有相似的底物特异性；然而，它们对肽类和蛋白质底物的特异性存在显著差异。 WM4 和 WM382 与 PMIX 和 PMX 结合的差异主要体现在 S' 区的结构变异以及活性位点 S3 口袋的参与情况上。PMX 的结构揭示了药物结合的相互作用和机制细节，这对于开发针对这些靶点的临床候选药物至关重要。[2]

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青蒿素联合疗法 (ACT) 是治疗疟疾的主要方案，疟疾是由胞内寄生虫疟原虫引起的。然而，ACT 耐药性的增加凸显了寻找新药的重要性。最近，天冬氨酸蛋白酶疟原虫蛋白酶 IX 和 X (PMIX 和 PMX) 被认为是很有前景的药物靶点。在本研究中，我们描述了 PMIX 和 PMX 的双重抑制剂，包括 WM382，它们可以阻断疟原虫生命周期的多个阶段。我们证明 PMX 是裂殖子入侵的关键调节因子，并直接调控入侵、寄生虫发育和释放所需的蛋白质的成熟。口服 WM382 可以治愈小鼠的伯氏疟原虫感染，并预防肝脏引起的血液感染。此外，WM382 对人源化小鼠体内的恶性疟原虫无性感染有效，并能阻止其传播给蚊子。体外培养无法筛选出耐药的恶性疟原虫。综上所述，这些结果表明，PMIX 和 PMX 双重抑制剂是治疗和预防疟疾的有希望的候选药物。[3]

C29H36N4O4

504.620547294617

504.273

C, 69.02; H, 7.19; N, 11.10; O, 12.68

2606990-92-3

154699453

White to off-white solid powder

3.4

106

2

5

5

37

900

2

CCC1(CC(=O)N(C(=N1)N)[C@@H]2CCOC3=C2C=C(C=C3)C(=O)N[C@H]4CC(OC5=CC=CC=C45)(C)C)CC

ZSZSSSHEMYULPX-FCHUYYIVSA-N

InChI=1S/C29H36N4O4/c1-5-29(6-2)17-25(34)33(27(30)32-29)22-13-14-36-23-12-11-18(15-20(22)23)26(35)31-21-16-28(3,4)37-24-10-8-7-9-19(21)24/h7-12,15,21-22H,5-6,13-14,16-17H2,1-4H3,(H2,30,32)(H,31,35)/t21-,22+/m0/s1

(4R)-4-(2-amino-4,4-diethyl-6-oxo-5H-pyrimidin-1-yl)-N-[(4S)-2,2-dimethyl-3,4-dihydrochromen-4-yl]-3,4-dihydro-2H-chromene-6-carboxamide

WM-382; WM382; 2606990-92-3; CHEMBL5171401; (4R)-4-(2-amino-4,4-diethyl-6-oxo-5H-pyrimidin-1-yl)-N-[(4S)-2,2-dimethyl-3,4-dihydrochromen-4-yl]-3,4-dihydro-2H-chromene-6-carboxamide; (4R)-4-[(2E)-4,4-diethyl-2-imino-6-oxo-1,3-diazinan-1-yl]-N-[(4S)-2,2-dimethyl-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-4-yl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-6-carboxamide; I0L; SCHEMBL22997111; GTPL11162; WM 382

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 5 mg/mL (9.91 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。