Adaptaquin

Adaptaquin (2 μM) 完全抑制了谷氨酸诱导的 HT-22 海马神经元细胞死亡的形态学特征（细胞收缩、变圆、脱落）。[2]

Adaptaquin 以剂量依赖的方式保护细胞活力（测试范围未明确为 IC₅₀；参见 xCELLigence 实时阻抗测量），抵抗 5 mM 谷氨酸诱导的细胞凋亡。[2]

在谷氨酸 (5 mM) 处理后 4 小时内给予 Adaptaquin 治疗可提供完全保护，即使在谷氨酸处理后 10 小时仍观察到显著的保护作用 (p<0.05)。[2]

在细胞外钙耗竭条件下，Adaptaquin (2 μM) 仍然能够抑制谷氨酸诱导的细胞死亡，表明其作用机制并非钙螯合。 [2]

Adaptaquin (2 μM) 可恢复谷氨酸（4 mM，15 小时）处理 HT-22 细胞的基础和最大线粒体呼吸（耗氧率，OCR），该结果通过 Seahorse XF96 检测得出。[2]

Adaptaquin 可阻止谷氨酸诱导的线粒体 ATP 生成减少（根据 OCR 计算）。[2]

Adaptaquin (2 μM) 不能挽救 5 mM 谷氨酸引起的谷胱甘肽 (GSH) 水平的快速且持续下降（GSH 在 10 小时时降至检测限以下）。[2]

Adaptaquin (2 μM) 可降低谷氨酸 (4 mM) 处理 6 小时后可溶性活性氧 (ROS) 的生成，该结果通过 CM-H₂DCFDA 染色检测得出，但不能完全消除。 [2]

Adaptaquin 以剂量依赖的方式保护 HT-22 细胞免受 H₂O₂ 诱导的细胞死亡（H₂O₂ 600-800 μM，16 小时）。[2]

Adaptaquin 不增加 MnSOD（超氧化物歧化酶 2）的表达；谷氨酸单独使用可显著上调 MnSOD，但与 Adaptaquin 联合处理可使 MnSOD 水平维持在基线水平附近。[2]

Adaptaquin (2 μM) 在谷氨酸暴露 14 小时后恢复了 ATF4 蛋白的表达（此前 ATF4 蛋白表达下调），但并未显著改变 eIF2α 的磷酸化水平。[2]

Adaptaquin 在谷氨酸暴露 14 小时后恢复了 xCT 蛋白的表达。 [2]

在siRNA介导的ATF4沉默后，Adaptaquin仍能保护HT-22细胞免受谷氨酸诱导的细胞死亡，并能阻止ATF4敲低引起的活性氧（ROS）的生成。[2]

在没有谷氨酸的情况下，Adaptaquin（2 μM）不影响基础细胞活力（由xCELLigence和MTT对照实验得出）。[2]

细胞培养——HT-22细胞培养于添加了10%热灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2 mM谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基中。为诱导细胞死亡，分别加入3-7 mM谷氨酸或600-800 μM H₂O₂，并处理指定时间。Adaptaquin溶于DMSO。[2]

细胞活力（MTT法）——谷氨酸处理后，加入MTT至终浓度为0.5 mg/ml，并在37℃孵育1小时。将生成的甲臜产物溶于DMSO，并在570 nm处测定吸光度（参考波长为630 nm）。对于H₂O₂处理，将培养基替换为含有0.5 mg/ml MTT的PBS缓冲液。 [2]

实时细胞活力检测 (xCELLigence) – 连续测量细胞阻抗以监测细胞死亡和保护情况。[2]

Annexin V/PI 染色 – ATF4 siRNA 转染和谷氨酸处理（6 mM，25 小时）后，用 Annexin V-FITC 和碘化丙啶对细胞进行染色，然后通过流式细胞术 (FACS) 分析（每组 10,000 个细胞）。[2]

线粒体 ROS (MitoSOX) – 将细胞用 2.5 μM MitoSOX 红色染料在 37 °C 下染色 30 分钟，然后通过流式细胞术 (FACS) 分析（激发波长 488 nm，发射波长 690/50 带通）。 [2]

线粒体膜电位 (TMRE) – 将细胞用 200 nM TMRE 在 37 °C 下染色 20 分钟，然后用流式细胞仪 (FACS) 分析（激发波长 488 nm，发射波长 690/50 带通）。[2]

脂质过氧化 (BODIPY 581/591 C₁₁) – 将细胞用 2 μM BODIPY 在 37 °C 下染色 1 小时，然后用流式细胞仪 (FACS) 分析荧光从绿色 (525/30) 到红色 (690/50) 的转变。 [2]

细胞内可溶性活性氧 (CM-H₂DCFDA) – 将细胞在无血清培养基中用 2.5 μM CM-H₂DCFDA 于 37 °C 孵育 30 分钟，然后在含血清培养基中孵育 30 分钟，随后进行流式细胞术分析（激发波长 488 nm，发射波长 525/30 带通）。[2]

ATP 测定 – 使用 ViaLight plus 试剂盒，按照制造商的说明，通过发光法测定总 ATP 水平。[2]

耗氧率 (Seahorse XF96) – 将细胞接种于 XF96 微孔板（8,000 个细胞/孔），并用 adaptaquin 和谷氨酸处理。测定培养基包含 4.5 g/L 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸（pH 7.35）。在进行基线测量后，依次注射寡霉素 (3 μM)、FCCP (0.4 μM) 和鱼藤酮/抗霉素 A (1 μM)。[2]

GSH 测定 – 将细胞收集于 MES 缓冲液（0.4 M MES、0.1 M 磷酸盐、2 mM EDTA，pH 6.0）中，超声破碎，并用偏磷酸脱蛋白。用三乙醇胺中和后，使用 Ellman 试剂在 405 nm 处测定 GSH。[2]

Western blot – 将细胞裂解于含有甘露醇、Tris、EDTA、EGTA、DTT、Triton-X、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的缓冲液中。将 40-60 μg 蛋白样品在 12.5% SDS-PAGE 凝胶上进行分离，然后转移至 PVDF 膜，并与针对 PHD1、ATF4、xCT、eIF2α、磷酸化 eIF2α、MnSOD、15-LOX 和肌动蛋白的一抗孵育。使用 HRP 标记的二抗，并通过化学发光法检测信号。[2]

siRNA 转染 – 使用 Lipofectamine RNAiMax 转染试剂，将针对 ATF4、PHD1（两种序列）或对照序列的 siRNA 转染至细胞中。转染 48 小时后对细胞进行处理。[2]

CRISPR/Cas9 构建 PHD1 敲低克隆 – 将 PHD1 CRISPR 质粒（U6gRNA-Cas9-2A-GFP）转染至 HT-22 细胞中。经FACS分选后，将单个或多个细胞接种到96孔板中，建立克隆2.17和5.18。[2]

[1]. Utilization of an in vivo reporter for high throughput identification of branched small molecule regulators of hypoxic adaptation. Chem Biol. 2010 Apr 23;17(4):380-91.

[2]. Inhibition of HIF-prolyl-4-hydroxylases prevents mitochondrial impairment and cell death in a model of neuronal oxytosis. Cell Death Dis. 2016 May 5;7(5):e2214.

Adaptaquin 是一种支链氧喹啉分子，它通过与活性位点的铁配位来抑制 HIF-PHD，但其铁螯合能力低于环吡咯烷酮。Adaptaquin 的设计目的是激活适应性缺氧反应。在谷氨酸诱导的氧化应激模型中，Adaptaquin 作用于线粒体上游，在不恢复 GSH 水平的情况下，防止脂质过氧化和线粒体功能障碍。其保护作用不依赖于 HIF-1α 的调控，也不需要 ATF4 的表达。结构分析（本文未进行，但引用自先前的研究）表明，Adaptaquin 不与 12-脂氧合酶的活性中心结合。Adaptaquin 可能通过修饰 RNA 聚合酶 II 并下调 12/15-脂氧合酶的表达来发挥作用。[2]

C21H16CLN3O2

377.823643684387

377.093

385786-48-1

3740671

White to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

650.9±55.0 °C at 760 mmHg

347.4±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.753

4.63

78.3

3

5

4

27

474

0

C1=CC2=C(C(=C(C=C2)C(C3=CC=C(C=C3)Cl)NC4=C(C=CC=N4)O)O)N=C1

KKYHNYRUBSYTCZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H16ClN3O2/c22-15-8-5-14(6-9-15)18(25-21-17(26)4-2-12-24-21)16-10-7-13-3-1-11-23-19(13)20(16)27/h1-12,18,26-27H,(H,24,25)

7-[(4-chlorophenyl)-[(3-hydroxypyridin-2-yl)amino]methyl]quinolin-8-ol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~264.68 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。