AL082D06

Glucocorticoid receptor (GR) (Ki = 210 nM)

GR 以纳摩尔亲和力选择性地与 AL 082D06 (D06) 结合。当使用最大 DEX 浓度的一半来刺激 MMTV:Luc 报告基因时，添加 AL 082D06 后转录激活会以剂量依赖性方式降低。 AL 082D06 使用了几种糖皮质激素响应启动子-报告基因系统，包括一种不太复杂的系统，由分离的糖皮质激素响应元件 (GRE) 序列和 3-kb 酪氨酸转氨酶 (TAT) 启动子组成。发起人破坏记者的工作。 AL 082D06 具有纳摩尔亲和力，可与 3H-Dex 对抗杆状病毒表达的 GR。使用适当的受体和氚化配体 (>2500 nM)，类似的结构结合测定显示 AL 082D06 对其他细胞内受体（AR、ER、PR 和 MR）没有亲和力。 AL 082D06 不会激活黄体酮、雄激素、盐皮质激素、视黄酸、糖皮质激素和雌激素受体。当针对其他类固醇受体进行测试时，尽管 AL 082D06 具有非常强的对抗 GR 活性的能力，但其效果远低于用作对照的参考拮抗剂 [1]。

竞争结合试验[1]
重组hGR杆状病毒的生长和纯化遵循Summers和Smith概述的方案。提取液和结合实验缓冲液在室温下由25 mM磷酸钠、10 mM氟化钾、10 mM钼酸钠、10%甘油、1.5 mM EDTA、2 mM二硫苏糖醇、2 mM 3-[（3-cholamidopropyl）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）和1 mM苯基甲基磺酰氟（pH 7.4）组成。以这种方式产生的细胞内受体与已知的配体在已发表的亲和力上表现出可重复的相互作用。这些制剂在检测前进行了广泛的质量控制实验，包括受体反应、特异性、大小和参考配体亲和力。受体测定的最终体积为250 μl，其中含有50-75 μg的提取物蛋白，加上1-2 nM [3H]Dex （84 Ci/mmol）和不同浓度的竞争配体（0至10−5M）。使用96孔微管系统进行检测，在4℃下孵育18小时。在这些缓冲液和温度条件下，6-8小时达到平衡。非特异性结合定义为在1000 nM未标记的Dex存在下仍然存在的结合。孵育结束时，在洗涤缓冲液中加入200 μl 6.25%的羟基磷灰石（不含二硫苏糖和苯基甲基磺酰氟的结合缓冲液）。根据Wecksler和Norman的协议，用羟基磷灰石结合法测定配体与受体的特异性结合。羟基磷灰石吸收受体-配体复合物，使结合体与游离放射性标记配体分离。将混合物在4℃下涡流孵育10分钟，离心，去除上清。羟基磷灰石颗粒在洗涤缓冲液中洗涤两次。受体-配体复合物的数量通过加入0.5 mM国家诊断公司的EcoScint A闪烁鸡尾酒后羟基磷灰石颗粒的液体闪烁计数来测定。[1]
校正非特异性结合后，确定IC50值。IC50值定义为使特异性结合降低50%所需的竞争配体浓度；IC50值由数据的对数对数图以图形方式确定。应用Cheng-Prussof方程计算了相似物的Kd值。每个分析中都包含类固醇标准物，所得Kd值通过使用改进的Cheng-Prussoff方程确定。[1]
MR、AR、PR和ERα在杆状病毒系统中的表达和结合实验的方法相似，只是标记的配体分别是醛固酮[来自Amersham Pharmacia Biotech （TRK 434）的1-2 nM3H-醛固酮，比活性60 Ci/mmol]、DHT （1-2 nM3H-DHT, 130 Ci/mmol）、黄体酮[2-3 nM3H-黄体酮（93 Ci/mmol）]和雌二醇[2-3 nM3H-雌二醇，114 Ci/mmol]。每个结合分析点重复进行，每个完整的实验重复三次或更多次。

TAT Assay.[1]
如前所述，测量H4IIE细胞中的TAT活性（60）。96孔板中预融合的H4IIE细胞用化合物孵育24小时，PBS洗涤，裂解。提取液按所述进行酶分析。[1]
在诱导培养基（1.75% BSA/抗生素/DMEM）中培养4-6小时后，在融合的人皮肤成纤维细胞中检测IL-6。更换培养基，在诱导培养基中再培养1小时；化合物。然后在诱导培养基中加入IL-1β至终浓度为1 ng/ml，细胞培养24 h。取出培养基，加入带有捕获抗体（IL-6单克隆小鼠抗人IL-6）包被孔的Maxisorp Plate (Nunc)，室温（RT）孵育过夜。PBS洗涤2次，4% BSA/PBS阻断，RT孵育1 h。加入二抗生物素化单克隆抗人IL-6, 500 μg/ml, 4% BSA/PBS， RT孵育2 h， PBS洗涤3次。加入1:5000稀释的外渗素-辣根过氧化物酶溶液（4% BSA/PBS），在室温下孵育30 min， PBS中洗涤3次，加入底物溶液（100微升3,3 ‘,5,5 ’四甲基联苯胺-过氧化氢），在室温下孵育15 min，以每孔50 μl的2n H2SO4停止反应，在450 nm/540 nm处读取OD值。用1.75% BSA-DMEM复合物诱导成纤维细胞1 h，测定胶原酶水平，在诱导培养基中加入终值为1 ng/ml的IL-1β，培养24 h。

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胶原酶测定。[1]
培养上清加入0.1% BSA/PBS， RT孵育2 h；洗涤后,兔多克隆反人类的金属蛋白酶- 1在分析缓冲区添加和孵化2 h RT,洗后,辣根peroxidase-donkey antirabbit Ig 0.1% BSA / 0.1%渐变20 / PBS添加和孵化1 h RT,一百毫升水中3,3’,5、5 '四甲基benzidine-hydrogen过氧化被添加在RT和孵化大约30分钟,之后100μl /停止的解决方案(1 N硫酸)被添加和OD读450/540 nm。

[1]. A nonsteroidal glucocorticoid receptor antagonist. Mol Endocrinol. 2003 Jan;17(1):117-27.

Selective intracellular receptor antagonists are used clinically to ameliorate hormone-dependent disease states. Patients with Cushing's syndrome have high levels of the glucocorticoid, cortisol, and suffer significant consequences from this overexposure. High levels of this hormone are also implicated in exacerbating diabetes and the stress response. Selectively inhibiting this hormone may have clinical benefit in these disease states. To this end, we have identified the first selective, nonsteroidal glucocorticoid receptor (GR) antagonist. This compound is characterized by a tri-aryl methane core chemical structure. This GR-specific antagonist binds with nanomolar affinity to the GR and has no detectable binding affinity for the highly related receptors for mineralocorticoids, androgens, estrogens, and progestins. We demonstrate that this antagonist inhibits glucocorticoid-mediated transcriptional regulation. This compound binds competitively with steroids, likely occupying a similar site within the ligand-binding domain. Once bound, however, the compound fails to induce critical conformational changes in the receptor necessary for agonist activity.[1]

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During the course of screening compound libraries for GR modulators, we discovered an antagonist, designated “AL082D06” (D06) that bound specifically to GR with nanomolar affinity. This antagonist is unlike the other frequently used steroidal antagonists for GR, RU-38486 (RU-486) and ZK-98299 (ZK-299), in that it has no measurable binding affinity for the progesterone receptor. As has been described previously, the three-dimensional structure of the ligand defines not only its affinity for the receptor, but also the conformation of that receptor once it has associated with ligand. This new compound appears to bind directly to receptor without inducing the same conformational changes associated with steroidal ligands. These ligands prevent the occurrence of some of the earliest steps in receptor activation. We report here the molecular and cellular characterization of this antagonist.

C23H24CLN3O2

409.91

409.156

C, 67.39; H, 5.90; Cl, 8.65; N, 10.25; O, 7.81

256925-03-8

9822799

Light yellow to yellow solid powder

6.083

52.3

0

4

5

29

495

0

IPICUXHYPAMJNC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H24ClN3O2/c1-25(2)18-9-5-16(6-10-18)23(17-7-11-19(12-8-17)26(3)4)21-15-20(27(28)29)13-14-22(21)24/h5-15,23H,1-4H3

4,4'-((2-chloro-5-nitrophenyl)methylene)bis(N,N-dimethylaniline)

AL-082D06; AL082D06; AL 082D06; 256925-03-8; AL 082D06; AL082D06; 4,4'-((2-chloro-5-nitrophenyl)methylene)bis(N,N-dimethylaniline); TCMDC-124088; 4-[(2-chloro-5-nitrophenyl)-[4-(dimethylamino)phenyl]methyl]-N,N-dimethylaniline; D-06; AL-082D06; D-06; D06; D 06

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。