AMXI-5001

PARP1/2; tubulin/microtubule; tubulin polymerization

AMXI-5001有效且选择性地抑制PARP1和PARP2。AMXI-5001与人PARP1的催化结构域结合。AMXII-5001是一种周糖醛酸酶抑制剂。AMXI-5001是一种强效的微管蛋白聚合抑制剂。AMXI-5001没有明显的脱靶效应。AMXI-5001靶向具有或不具有同源重组缺陷的肿瘤细胞。 AMXI-5001对细胞检查点、调节蛋白和信号蛋白的影响。 AMXI-5001与体外批准的抗癌疗法的协同抗癌活性[1]。

MDA-MB-436异种移植物的初步5天研究[1]
AMXI-5001（HCl盐形式）配制于10%TPGS中，口服给药于携带已建立的MDA-MB-436异种移植物肿瘤的雌性无胸腺裸鼠，MDA-MB-434是一种具有BRCA1缺失和BRCA1缺陷的侵袭性基底乳腺癌细胞系。当肿瘤达到350mm3的平均体积时，以12.5、25或50mg/kg/剂BID的剂量口服AMXI-5001混悬液5天。与赋形剂组相比，每天两次（BID）口服AMXI-5001五天，在25和50 mg/kg/剂BID的剂量下，肿瘤生长受到快速和显著的抑制，在50 mg/kg/剂量BID时，肿瘤明显消退（图S32A）。
此外，血浆和肿瘤组织生物分析显示，AMXI-5001血浆浓度呈剂量依赖性增加，AMXI-001肿瘤浓度也呈相应的剂量依赖性增长（图S32B）。然而，在第4次和第10次重复口服剂量后收获的组织之间，血浆或肿瘤组织中的AMXI-5001浓度没有显著变化（图S32B）。这些结果表明，重复治疗后，AMXI-5001在血液或肿瘤组织中的积聚没有显著增加。
肿瘤裂解物的Western Blot分析表明，AMXI-5001以剂量依赖的方式在体内调节其靶点（图S33）。特别是，AMXI-5001对其靶点的抑制在25和50 mg/kg BID剂量下更为明显，如PARP活性的替代标记物聚合二磷酸腺苷（ADP）核糖（标准杆数）表达显著降低，以及微管聚合抑制的替代物总微管蛋白表达显著降低（图S33）。这为AMXI-5001的抗肿瘤功效可能源于抑制PARP和微管聚合的假设提供了支持。一般来说，在测试剂量下，血浆和肿瘤药物浓度的增加与AMXI-5001靶点之一或两者的抑制增加之间存在良好的相关性。

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MDA-MB-436异种移植物的31天验证性研究[1]
在为期5天的研究中观察到的AMXI-5001的疗效在随后的更长给药时间的研究中得到了证实。通过在雌性无胸腺裸鼠的第三乳脂肪中皮下接种3.5×106个MDA-MB-436细胞，建立MDA-MB-436-异种移植物肿瘤。当肿瘤达到约100mm3时，将小鼠随机分为五个治疗组（每组8只动物）：1）口服载体对照；2） 口服10mg/kg PO BID AMXI-5001，5天on/2天OFF周期；3） 口服50mg/kg PO BID AMXI-5001，5天on/2天OFF周期；4） 口服奥拉帕尼50mg/kg BID，5天on/2天OFF周期；5） 每周一次（Q1W）腹腔注射1 mg/kg长春花碱。所有动物均在31天的给药期内接受治疗。每只动物的肿瘤大小每周测量两次（图4A）。
AMXI-5001表现出显著的、剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用。除了肿瘤生长抑制外，AMXI-5001在该模型中还表现出明显的肿瘤消退。对于50 mg/kg AMXI-5001组，所有肿瘤均完全消退。到给药计划的第31天，肿瘤要么太小而无法准确测量，要么无法触及。与奥拉帕尼相比，AMXI-5001在10或50 mg/kg/剂量BID下观察到的抗肿瘤生长效果优于奥拉帕尼在50 mg/kg/剂BID下的效果。与AMXI-500l相比，奥拉帕尼在此模型中没有表现出任何肿瘤消退活性，而以1 mg/kg Q1W剂量给药的长春碱在此模型中对肿瘤生长没有显著影响（图4A）。
以10和50mg/kg/剂BID的AMXI-5001剂量在5天on/2天OFF周期内治疗31天的动物，没有表现出任何与化合物相关的毒性的身体症状，奥拉帕尼和长春花碱治疗的动物也没有。在整个治疗过程中，任何一组的体重都没有显著影响（图4B）。
为了评估治疗相关的组织学变化，在治疗结束时采集的肿瘤石蜡切片用苏木精-伊红（H&E）染色。H&E染色显示，用50 mg/kg剂量的AMXI-5001治疗的肿瘤出现了严重的出血性肿瘤坏死（图4C）。在治疗结束时，用50mg/kg的AMXI-5001治疗的小鼠收获的肿瘤是不可触及的。该组的肿瘤切片显示，少数剩余的异种移植物癌症细胞通过广泛的纤维化分散，周围是宿主动物的皮肤、骨骼肌和脂肪。在更高的放大倍数下，这些肿瘤的照片显示了显著的治疗效果，有坏死和出血的证据，有含铁血黄素填充的巨噬细胞积聚、胆固醇肉芽肿、慢性炎症和纤维化（图4C）。用10mg/kg的AMXI-5001治疗的小鼠的肿瘤也显示出异种移植物细胞密度降低，并出现坏死、炎症和纤维化区域。来自载体治疗、奥拉帕尼治疗或长春碱治疗的小鼠的肿瘤切片主要含有活的肿瘤细胞，没有任何纤维化（图4C）。
在研究结束时，切除肿瘤并进行处理，以分析微管丝的形成。石蜡包埋的肿瘤切片用α/β微管蛋白特异性抗体染色，并通过荧光显微镜观察。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。以10mg/kg或50mg/kg BID重复口服AMXI-5001剂量，对MDA-MB-436细胞衍生肿瘤中的微管丝形成产生了显著的剂量依赖性抑制作用（图S34）。长春花碱治疗还诱导MDA-MB-436肿瘤中微管丝的显著抑制。相反，以50mg/kg BID剂量重复口服奥拉帕尼对肿瘤细胞微管丝的形成没有影响。
AMXI-5001治疗的药效学参数也使用本研究中每组异种移植物肿瘤标本制备的裂解物进行测定。对于PARP抑制，评估标准杆数水平，对于微管不稳定，通过蛋白质印迹分析评估总α/β微管蛋白表达水平及其特异性对应抗体。10或50 mg/kg的AMXI-5001治疗以剂量依赖性方式显著抑制了MDA-MB-436衍生肿瘤中标准杆数的表达（图S35）。AMXI-5001治疗还导致MDA-MB-436衍生肿瘤中总α/β微管蛋白表达水平显著降低，且呈剂量依赖性（图S35）。奥拉帕尼治疗导致标准杆数表达的显著抑制，但对MDA-MB-436来源的肿瘤中的微管蛋白表达没有影响。相反，长春碱治疗对MDA-MB-436衍生肿瘤中标准杆数水平或总微管蛋白表达没有影响（图S35）。与PARP抑制作用一致，与赋形剂对照治疗相比，AMXI-5001治疗和奥拉帕尼治疗均显著抑制了细胞周期检查点蛋白（CHFR）的肿瘤蛋白表达（图S35）。
总的来说，上述结果表明，AMXI-5001以剂量依赖的方式调节其在肿瘤体内的预期靶点。这些结果还表明，AMXI-5001的抗肿瘤活性可能归因于其通过同步抑制肿瘤细胞中的PARP和微管聚合的双重作用机制。

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单药AMXI-5001治疗MDA-MB-436异种移植物中已建立的大肿瘤（600-1300mm3）完全消退[1]
基于上述研究中MDA-MB-436异种移植物在开始给药前肿瘤分期为100-150mm3时的抗肿瘤疗效，在更大、更成熟的肿瘤中测试了AMXI-5001的抗肿瘤作用（图5A）。
在上述研究的31天给药期结束时，来自肿瘤大小为554-1318mm3的对照组的8只小鼠中有5只在5天on/2天OFF周期内以50mg/kg/剂量BID的剂量接受AMXI-5001，来自长春碱组的2只小鼠和来自对照组的1只小鼠（肿瘤大小458-953mm3）按相同的时间表接受赋形剂对照。值得注意的是，从治疗开始的第一周开始，所有用AMXI-5001治疗的大肿瘤都表现出逐渐和近似完全的肿瘤消退（图5A）。值得注意的是，在AMXI-5001治疗后，小鼠停止治疗2周后没有肿瘤复发的迹象（图5A）。相反，在新的载体治疗组中，肿瘤继续快速生长，在载体治疗开始后不到三周，由于肿瘤过度生长和随之而来的动物健康状况不佳，小鼠被终止。与赋形剂对照治疗组相比，AMXI-5001以50mg/kg/剂量BID在整个治疗过程中对体重没有显著影响（图5B）。

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在MDA-MB-436异种移植物模型中，AMXI-5001的抗肿瘤效果优于单药PARP和微管抑制剂的联合治疗[1]
本研究旨在比较AMXI-5001治疗与单剂奥拉帕尼（一种临床PARP抑制剂）或单剂紫杉醇（一种强效临床微管聚合抑制剂）的体内抗肿瘤疗效，以及奥拉帕尼和紫杉醇在MDA-MB-436异种移植物模型中的联合治疗。奥拉帕尼和紫杉醇以临床相关剂量和时间表给药。
AMXI-5001在所有接受治疗的动物中诱导了完全或接近完全的肿瘤消退，这种效果优于单药奥拉帕尼或紫杉醇，或两种药物的联合治疗（图6A）。在这种肿瘤模型中，单药紫杉醇治疗显示出较弱的抗肿瘤活性，而单药奥拉帕尼治疗诱导了明显但适度的肿瘤生长抑制。奥拉帕尼和紫杉醇的联合治疗比单独使用这两种药物更能抑制肿瘤生长。然而，奥拉帕尼和紫杉醇的联合治疗未能诱导肿瘤消退，肿瘤继续生长，尽管其生长速度比载体治疗或单一药物（奥拉帕尼或紫杉醇）治疗的肿瘤慢。AMXI-5001在该模型中比单药奥拉帕尼与单药紫杉醇的组合更有效。
用AMXI-5001、单药奥拉帕尼或奥拉帕尼与紫杉醇联合治疗的动物没有显示出任何明显的治疗相关毒性（图6B）。然而，单药紫杉醇组8只小鼠中有3只在首次静脉注射紫杉醇（30mg/kg）后几分钟内出现嗜睡、对外部刺激缺乏反应、意识丧失和呼吸困难。该组3只受影响的动物被安乐死。然而，在单药紫杉醇治疗组中，其余5只动物在治疗期间均未表现出任何明显的治疗相关毒性。与赋形剂对照治疗相比，在整个治疗过程中，任何治疗方式对体重都没有明显的治疗相关影响。

体外激酶抑制试验[1]
AMXI-5001抑制脱靶激酶的潜力在156项重组人激酶活性和结合试验中进行了评估，包括细胞质和受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶和脂质激酶。激酶谱分析使用Life Technologies的SelectScreen®谱分析服务进行，广泛覆盖人类激酶。激酶活性测定测量肽磷酸化或ADP产生，而激酶结合测定监测ATP位点结合探针的位移。活性测定中使用的ATP浓度在每种激酶的实验确定的表观米氏常数（K m app）值的2倍以内，而结合测定中使用了竞争性结合示踪剂浓度在实验确定的解离常数（K d）值的3倍以内。AMXI-5001在8µM下对每种激酶进行了三次测试，并报告了平均%抑制值。对于选定的激酶，使用与单点试验中使用的激酶测定相同的激酶测定法进行10点抑制剂滴定，以确定提供50%抑制的抑制剂浓度（IC50）。

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PARP2抑制试验[1]
使用市售的微孔板测定试剂盒并按照制造商提供的说明测定测试化合物对PARP2的抑制作用。随后，使用GraphPad Prism进行非线性拟合后，确定了PARP2抑制的IC50。

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PARP酶测定[1]
使用市售的微孔板测定试剂盒并按照制造商提供的说明测定测试化合物对PARP1的抑制作用。简而言之，各种测试化合物的储备溶液是在二甲基亚砜（DMSO）中制备的。对于该测定，每个条孔填充10µL抑制剂溶液、20μL稀释的PARP1酶（提供0.5单位/孔）和25µL PARP鸡尾酒（由生物素化的NAD、pH 8.0的Tris-Cl中的活化DNA和EDTA组成）。将条孔在室温下孵育60分钟，然后用磷酸缓冲盐水（PBS:Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl）和0.1%Triton X-100洗涤4次，用PBS洗涤2次。然后，向每个孔中加入50µL稀释的Strep-HRP（阻断溶液），并在室温下进一步孵育条带60分钟。用PBS、0.1%Triton X-100和PBS洗涤孔各2次后，将其与50µL TACS Sapphire™比色底物混合，并在黑暗中静置15分钟。通过向每个孔中加入50μL 0.2 N盐酸（HCl）停止反应后在450nm处测量吸光度。通过用等体积的DMSO代替测试溶液进行平行实验，以验证载体对酶活性的影响。所有检测均在至少两个单独的场合进行，每次重复。随后，使用GraphPad Prism进行非线性拟合后，确定PARP1抑制的IC50。这些研究的结果以μM为单位报告。DMSO用作阴性对照。临床批准的PAPR抑制剂（olaparib、talazoparib、niraparib或rucaparib）用作PARP抑制的阳性对照。在某些情况下，紫杉醇也被用作阴性对照。

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体外微管蛋白聚合试验[1]
根据制造商的方案，使用基于体外荧光的微管蛋白聚合测定试剂盒来监测微管蛋白向微管的时间依赖性聚合。在存在或不存在测试化合物的情况下，制备含有猪脑微管蛋白、荧光报告蛋白和GTP的反应混合物。在微管蛋白聚合后，监测荧光增强，这是由于在聚合过程中将荧光报告子掺入微管中造成的。在Biotek Synergy平板读数器中以1分钟的间隔测量荧光发射（在360nm波长下激发和在460nm波长下消除）1小时45分钟。在上述条件下，约45%的微管蛋白聚合，为检测聚合增强剂和抑制剂留下了灵活性。DMSO用作阴性对照。紫杉醇被用作微管蛋白聚合增强的阳性对照。长春花碱被用作微管蛋白聚合抑制的阳性对照。测量了聚合过程中荧光报告子掺入微管的情况。使用GraphPad Prism 6程序绘制360nm激发和460nm消除波长下的荧光吸光度与反应时间的关系图。使用GraphPad Prism进行非线性拟合后确定Vmax。DMSO对照的Vmax设定为100%聚合。将化合物Vmax相对于DMSO对照Vmax的百分比与化合物浓度作图。随后，使用GraphPad Prism进行非线性拟合后，确定了微管蛋白聚合抑制剂的IC50。

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竞争性MS结合分析[1]
为了确定AMXI-5001在微管蛋白上的结合位点，如前所述进行了竞争性MS结合分析，但秋水仙碱、长春花碱和紫杉醇的结合条件略有不同。该测定用于评估秋水仙素、长春花碱和紫杉醇的微管蛋白结合，并鉴定AMXI-5001结合这三个结合位点中的哪一个。该方法涉及一个非常简单的步骤，即使用超滤将未结合的配体与大分子分离。使用高灵敏度和特异性的HPLC-MS/MS方法可以准确地测定流经级分中的未结合配体。简言之，将诺考达唑-秋水仙素和长春花碱与微管蛋白在37°C的孵育缓冲液中孵育1小时。将紫杉醇与已完成的微管蛋白在培养缓冲液中于37°C孵育1小时时。通过将微管蛋白与GTP在培养缓冲区中于37℃孵育1个小时来制备已完成的小管蛋白。使用不同浓度的诺考达唑、长春新碱和多西他赛分别与秋水仙素、长春花碱和紫杉醇的微管蛋白结合竞争。孵育后，将反应样品在Ultracel-30微浓缩器中离心。如下所述，收集流动（未结合的配体）并通过HPLC-MS/MS进行分析。检测了不同浓度的AMXI-5001，以分别与秋水仙碱、长春花碱和紫杉醇微管蛋白结合竞争。在没有任何竞争对手的情况下，竞争对手或AMXI-5001抑制配体结合的能力表示为未结合配体对照的百分比。

细胞标准杆数蛋白质印迹分析[1]
AMXI-5001对细胞标准杆数水平的影响也通过标准蛋白质印迹程序进行评估。简言之，将癌症细胞在6孔板中培养过夜，然后用载体对照或测试化合物孵育24小时。然后洗涤细胞，制备细胞裂解物用于蛋白质印迹，如下所述。使用BCA法定量每种细胞裂解物中的蛋白质浓度。随后使用标准程序进行免疫印迹。通过SDS-PAGE分解总共10μg的蛋白质，将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并用抗-PAR和第二抗体进行探测。临床批准的PARPi（olaparib、talazoparib或rucaparib）用作标准杆数抑制和γH2AX诱导的阳性对照。β-actin作为负载对照。

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细胞PARP-DNA捕获试验[1]
为了评估AMXI-5001的PARP捕获能力，如前所述进行了标准细胞捕获试验。简言之，将癌症细胞在6孔板中培养过夜，然后用烷基化剂甲基甲磺酸酯（MMS）和载体对照共同处理，或用烷基化试剂和不同浓度的测试PARPi共同处理1或3小时。然后洗涤细胞并通过胰蛋白酶消化收集细胞。随后，按照制造商的方案，使用Thermo Scientific亚细胞蛋白分级试剂盒制备染色质组分。对样品进行蛋白质浓度标准化，并通过抗PARP1、抗TOP1和抗H3的免疫印迹进行分析。临床批准的PARPi（olaparib、talazoparib或rucaparib）用作PARP-DNA捕获的阳性对照。为了量化PARPi诱导的人癌症细胞中PARP1-DNA捕获，对免疫印迹进行密度测定。将DNA结合的PARP1水平标准化为总细胞PARP1水平（染色质结合的PARP1+未结合的PARP 1）。每个实验至少进行三次独立的时间。代表性结果见下文结果部分。

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细胞滴度Glo测定[1]
AMXI-5001的抗增殖活性在一组110个不同来源的癌症细胞系中进行评估，这些细胞系对于BRCA-1或BRCA-2表达或表达这两个基因的突变形式是熟练的或有缺陷的。在细胞暴露于8 nM至5μM的AMXI-5001剂量3天或6天后评估增殖。简而言之，在加入AMXI-5001的系列稀释液之前，将5000或1000个细胞（分别在3天或6天的暴露中）在96孔板中培养，并在37°C和5%CO2下孵育。然后将细胞在37°C和5%CO2下孵育3-6天。通过Cell Titer-Glo试验评估细胞存活率。通过读取GloMax Luminametor上的平板来确定活细胞的数量。细胞生长以相对于载体（DMSO对照）处理的细胞的百分比生长表示。使用GraphPad Prism进行非线性拟合后，确定抑制细胞生长50%所需的浓度（IC50）。DMSO处理的细胞用作载体对照。MTA（紫杉醇和长春花碱）以及临床PARP（奥拉帕尼、塔拉佐帕尼、尼拉普里布和鲁卡帕里布）用作对照。

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克隆形成试验[1]
AMXI-5001对细胞活力的影响也使用卵巢、非小细胞肺癌和前列腺来源的细胞系中的集落形成测定进行评估。简而言之，细胞系在37°C下在0.1%（v/v）DMSO（载体对照）或0.008、0.04、0.2、1、5 mM AMXI-5001中孵育，直至形成>50个菌落（6-28天）。通过初步实验确定接种细胞密度，并将其定义为在0.1%（v/v）DMSO（载体对照）中培养细胞后产生线性细胞生长的接种密度。通过使用ImageJ软件计数结晶紫染色的集落，使用集落形成测定法测定细胞存活率。IC50值定义为与载体对照细胞（100%细胞存活率）相比，产生50%细胞存活率的AMXI-5001浓度。临床PARP（Olaparib、Talazoparib、Niraparib和Rucaparib）用作对照。

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伤口愈合试验/划痕试验[1]
AMXI-5001抑制细胞迁移的能力使用体外划痕试验来测试，该试验通过恢复生长成单层的A549肺癌细胞中的划痕伤口来评估细胞迁移。简言之，将A549肺癌细胞接种到12孔板上。当细胞融合达到约80%及以上时，使用200μl移液管尖端在每个培养板上刮擦细胞层，形成划痕。受伤后，用PBS清洗细胞以去除碎片。受伤的培养物在37°C下单独在培养基（未处理的对照）或含有0.1%（v/v）DMSO（DMSO对照）或0.04、0.2、1 mM AMXI-5001的培养基中孵育24小时。随后，从每个划痕中随机选取3个区域（40Å~），并通过显微镜观察以评估细胞迁移能力。临床PARP（奥拉帕尼和塔拉佐帕尼）和临床MTA（紫杉醇和长春花碱）用作细胞迁移抑制的阳性对照。

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细胞周期分析[1]
评估了AMXI-5001对MDA-MB-436、OVCAR8和A549细胞分裂过程中细胞周期进程的影响。简而言之，细胞在T75培养瓶中生长，用0.1%DMSO（载体对照）、长春花碱或AMXI-5001以不同浓度处理24小时。孵育后，将细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤并固定。固定后，将细胞离心，用PBS洗涤一次，并用碘化丙啶染色。最后，使用流式细胞术分析处理细胞在细胞周期不同阶段（G1、S、G2/M）的分布。测定AMXI-5001治疗24小时前后每个有丝分裂期的细胞百分比。MTA（紫杉醇和长春碱）用作细胞周期阻滞的阳性对照。

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细胞检查点和信号蛋白的蛋白质印迹分析[1]
为了更好地理解AMXI-5001调节癌症细胞中细胞周期阻滞的机制，对细胞裂解物进行了标准西方分析，以评估各种检查点相关蛋白和细胞信号蛋白的状态（图3）。简言之，癌症细胞在无血清培养基中的6孔板中培养过夜，然后与载体对照或测试化合物孵育24小时。然后洗涤细胞，制备细胞裂解物用于蛋白质印迹，如下所述。使用BCA法定量每种细胞裂解物中的蛋白质浓度。随后使用标准程序进行免疫印迹。SDS-PAGE共分离10μg蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用检查点蛋白对应抗体和二抗进行检测。临床批准的PARPi（奥拉帕尼、塔拉佐帕尼）或MTA（紫杉醇、长春碱）用作对照。β-actin和GAPDH用作负载对照。

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流式细胞术分析细胞表面标记染色[1]
A549细胞在100mm培养皿中培养过夜，然后与载体对照或AMXI-5001以1mM或5mM孵育24小时或48小时，然后通过胰蛋白酶消化收获，如下文方法部分所述。对于PDL1和死亡受体（DR4和DR5）细胞表面染色，用PBS洗涤收获的细胞，用细胞染色缓冲液中的相应抗体染色，并进行流式细胞术分析。BD CellQuest Pro软件用于流式细胞术数据分析。

AMXI-5001在小鼠体内的药代动力学评价[1]
\n本研究旨在确定BALB/c小鼠单次口服AMXI-5001游离碱或盐酸盐后，其药代动力学和生物利用度特征。本研究的体内实验由Explora Biolabs公司委托进行。血浆样本的体外生物分析由Integrated Analytical Solutions公司委托进行。简而言之，AMXI-5001游离碱和盐酸盐分别配制成NMP/CMC混悬液或10% TPGS混悬液，并口服给药于雌性BALB/c小鼠。药代动力学研究中使用的制剂方案如下所述。单次口服50或100 mg/kg剂量的AMXI-5001游离碱，评估其生物利用度。本研究评估了小鼠单次口服50 mg/kg AMXI-5001 HCL制剂后的生物利用度。分别于给药前、给药后0.5、1、2、4、8和24小时采集血样。每只小鼠设置1-2个时间点，每个时间点采集3份血样。第一次采血为存活期采血，第二次采血为终末采血。血样采集于含K2EDTA抗凝剂的试管中，置于冰水浴中保存，直至离心分离血浆。血浆于-80℃保存，直至分析。根据平均血浆浓度-时间数据计算峰浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）、半衰期和曲线下面积（AUC）。所有 AMXI-5001 的剂量和血浆浓度均以游离碱形式表示。\n

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\n\n在携带 MDA-MB-436 肿瘤的小鼠中进行 AMXI-5001 的药效学评价[1]
\n本研究的主要目的是确定 AMXI-5001 的剂量、血浆浓度、肿瘤浓度与 PARP 和微管聚合抑制之间的关系。本研究的体内实验由 Explora Biolabs 的合同研究服务完成。血浆样本的体外生物分析由 Integrated Analytical Solutions 的合同研究服务完成。简而言之，将 AMXI-5001 盐酸盐形式配制成 10% TPGS 悬浮液（如下所述），并口服给予已建立 MDA-MB-436 异种移植瘤的雌性无胸腺裸鼠（当肿瘤平均体积达到 500 mm3 时）。 AMXI-5001混悬液以6.25、12.5或25 mg/kg的剂量，每日两次口服给药，连续5天。在第4次和第10次给药后3小时，每组（或每个AMXI-5001剂量组以及载体对照组）各取3只小鼠处死，并采集血液至EDTA抗凝管中进行血浆处理。尸检时，分别收集各组小鼠的肿瘤组织，以及载体对照组和AMXI-5001（50 mg/kg，每日两次）治疗组的胃、小肠、大肠、盲肠、肾脏和肝脏组织，置于冻存管中，并用液氮速冻。冷冻的血浆和组织样本保存在-80℃，直至进行AMXI-5001浓度的生物分析。采用高效液相色谱 (HPLLC) 联用三重四极杆质谱仪（电喷雾电离串联正离子模式 (MS/MS)）分析血浆样本。定量下限 (LLOQ) 为 5 ng/ml。该检测方法的定量范围为 5 至 10000 ng/ml。\n

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\n\n体内异种移植模型[1]
\n在本研究中，我们使用 MDA-MB-436（携带 BRCA1 突变的三阴性人乳腺癌）模型来探索 AMXI-5001 在体内抑制肿瘤生长和消退方面的疗效和效力。这些研究的体内实验操作由 Explora Biolabs 的合同研究服务完成。这些研究的标准实验设计包括每日两次（BID）口服（PO）AMXI-5001，采用5天用药、2天停药的循环模式，从已建立的实体瘤分期后开始（大多数异种移植瘤体积约为100-150 mm³，异种移植瘤消退研究的体积约为700 mm³，最大可达1500 mm³）。在10-60天的给药期间，每周两次测量肿瘤大小和体重。\n
\n研究结束时，切除肿瘤并进行微管丝形成分析。将石蜡包埋的肿瘤切片用α/β-微管蛋白特异性抗体染色，并通过荧光显微镜观察。\n
\n为了评估治疗相关的组织学变化，在治疗结束时采集的肿瘤石蜡切片也用苏木精-伊红 (H&E) 染色，并由经认证的病理学家进行分析。\n
\n本研究中，还使用各组异种移植肿瘤标本制备的裂解液测定了 AMXI-5001 治疗的药效学参数。对于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (PARP) 抑制 (PARPi)，评估了聚腺苷二磷酸核糖 (PAR) 的水平；对于微管不稳定，使用特异性抗体通过蛋白质印迹分析评估了总 α/β 微管蛋白的表达水平。\n

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\n\nHT PARP 体内药效学检测[1]
\nHT PARP 体内药效学检测是一种高通量化学发光 ELISA，旨在定量细胞提取物中的聚腺苷二磷酸核糖 (PAR)。该检测采用双位点夹心技术，其中使用两种不同的抗 PAR 抗体来捕获和检测目标分析物。该检测可用于测量外周血单核细胞 (PBMC)、培养细胞和组织提取物中的 PAR。此外，该检测方法可用于监测PARPi或抗癌药物对细胞PAR生成和癌细胞毒性的影响。根据制造商提供的说明，使用HT PARP体内药效学检测方法定量分析了AMXI-5001对细胞PAR生成的抑制作用。每个ELISA板包含用于绘制PAR标准曲线的纯化PAR标准品的系列稀释液。通过从RLU值中减去背景值（不含PAR），计算PAR标准品的净平均RLU值，然后将其绘制为相应PAR值（pg/ml）的函数。使用GraphPad Prism 6软件绘制PAR标准曲线。通常，PAR标准曲线的线性动态范围为10至1000 pg/ml。通过从RLU值中减去背景值，计算每个细胞裂解液样本的净RLU值。随后，使用PAR标准曲线测定每个样本中的PAR水平。将DMSO处理的对照组的PAR水平设定为100%。将各测试化合物处理样本的PAR水平占DMSO处理对照组PAR水平的百分比与化合物浓度作图。随后，使用GraphPad Prism软件进行非线性拟合，确定细胞PAR生成抑制剂的IC50值。

AMXI-5001 的代谢和药代动力学特性 [1]
目前，尚无获批的口服生物利用度高的微管靶向药物。我们双重 PARP 和微管抑制剂研发项目的目标之一是开发一种口服生物利用度高的双重 PARP 和微管抑制剂，并使其代谢稳定性、药代动力学特性和口服生物利用度优于现有的 PARP1/2 抑制剂。体外代谢研究表明，AMXI-5001 在大鼠、犬、食蟹猴和人肝细胞中具有优异的肝脏稳定性；在与 Sprague-Dawley 大鼠、比格犬、食蟹猴或人肝细胞（500,000 个细胞/mL）孵育期间，AMXI-5001 (2 μM) 的半衰期分别估计为 217 分钟、812 分钟、185 分钟和 417 分钟。在 37°C 下以 1 μM 浓度孵育 120 分钟后，大鼠、犬、猴和人肝细胞中 AMXI-5001 的残留百分比分别为 63.6%、85.4%、64.1% 和 78.5%（数据未显示）。这些数据表明 AMXI-5001 在人体内的清除率与动物模型中的清除率大致相同。
已对大鼠和犬进行了不同剂量水平的口服 AMXI-5001 试验（论文撰写中）。AMXI-5001 在所有受试物种中均被吸收并具有生物利用度。在大鼠和犬中，暴露量随剂量水平的增加而增加，这支持了在 AMXI-5001 毒性研究中使用这些物种。我们测试了多种配方，最终选择了 10% TPGS（D-α-生育酚聚乙二醇-1000-琥珀酸酯；维生素 E）溶于 0.01 N HCl（pH 2.1-2.3）的溶液，因为该配方具有合适的毒性特征，并且能够提供足够的 AMXI-5001 全身暴露量。使用该配方，AMXI-5001 在大鼠和犬中的绝对生物利用度分别为 31% 和 64%，其药代动力学特性预测其在人体内的半衰期足以支持每日两次给药方案（论文撰写中）。
体外研究评估了 AMXI-5001 对人细胞色素 P450 酶 (CYP450) 的抑制潜力，结果表明 AMXI-5001 不抑制任何主要的人类肝脏 CYP450 酶，包括 CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6 和 CYP3A4/5。 CYP2C9 和 CYP2C19 的抑制作用较弱（且不具有时间依赖性）（数据未显示）。
总体而言，AMXI-5001 表现出优异的代谢稳定性、口服生物利用度和药代动力学特性。

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AMXI-5001 药代动力学评估[1]
为了支持异种移植模型中的体内主要药效学研究，我们测定了 AMXI-5001 在雌性 BALB/c 小鼠中的药代动力学参数。AMXI-5001 游离碱或盐酸盐形式分别配制成 N-甲基吡咯烷/羧甲基纤维素 (NMP/CMC) 混悬液或 10% D-α-生育酚聚乙二醇-1000-琥珀酸酯；维生素 E (TPGS) 混悬液，并进行口服给药。AMXI-5001 在该品系小鼠中吸收良好且具有生物利用度，因此可用于小鼠异种移植模型的口服给药试验（表 S18）。

[1]. AMXI-5001, a novel dual parp1/2 and microtubule polymerization inhibitor for the treatment of human cancers. Am J Cancer Res. 2020;10(8):2649-2676.

聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）近期被发现是多种抗癌药物（包括微管靶向药物和DNA损伤药物等化疗药物）耐药的关键介质。本文介绍了一种新型高效的双重PARP1/2和微管聚合抑制剂AMXI-5001，该抑制剂具有良好的代谢稳定性、口服生物利用度和药代动力学特性。通过生化分析确定了AMXI-5001的效力和选择性。体外评估了其作为单药或与其他抗肿瘤药物联合用药的抗癌活性。在三阴性乳腺癌（TNBC）模型中评估了其作为单药的体内抗肿瘤活性。AMXI-5001对PARP和微管聚合的IC50抑制率分别与临床PARP抑制剂（奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕尼和他拉唑帕尼）和强效聚合抑制剂（长春碱）相当。体外实验表明，AMXI-5001 对多种人类癌细胞具有选择性抗肿瘤细胞毒性，其 IC50 值远低于现有临床 PARP1/2 抑制剂。AMXI-5001 对 BRCA 突变型和野生型癌症均具有高度活性。AMXI-5001 具有口服生物利用度。在 BRCA 突变型三阴性乳腺癌 (TNBC) 模型中，AMXI-5001 展现出显著的体内临床前抗肿瘤活性。口服 AMXI-5001 可使已形成的肿瘤（包括体积极大的肿瘤）完全消退。与单一 PARP 或微管抑制剂或两者联合用药相比，AMXI-5001 的抗肿瘤效果更佳。 AMXI-5001即将进入临床试验阶段，它是一种极具前景的新型双重PARP1/2和微管聚合抑制剂，能够以单一分子实现持续同步的双重抗癌治疗。[1]

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AMXI-5001在BRCA突变的三阴性乳腺癌（TNBC）模型中展现出显著的体内临床前抗肿瘤活性，而TNBC目前尚无有效的治疗方法。单药口服AMXI-5001可使已形成的肿瘤完全消退，包括体积巨大的肿瘤（图4、5和6）。更重要的是，在研究结束前，即停药两周后，所有接受AMXI-5001治疗的小鼠均未出现肿瘤复发。此外，与单药治疗（PARP抑制剂（奥拉帕尼）或微管靶向药物（紫杉醇或长春碱））或两种药物联合治疗（均采用临床相关剂量）相比，AMXI-5001展现出更优的抗肿瘤效果（图4A、6A）。重要的是，AMXI-5001的抗肿瘤作用是在耐受性良好的毒性下实现的，体内肿瘤中PARP和微管的抑制作用得到证实，且其良好的药代动力学特性使其能够实现每日两次口服给药。AMXI-5001是迄今为止报道的首个能够持续且同步抑制PARP和微管聚合的小分子抑制剂，从而产生合成致死效应，尤其对易受DNA损伤的癌细胞有效。 AMXI-5001 是一种口服生物利用度高的双重 PARP 和微管聚合抑制剂，其发现和表征为肿瘤学领域带来了可喜的补充。我们相信 AMXI-5001 的药理学特性值得进一步研究，并应推进其在癌症患者中的临床研究。[1]

C25H20FN5O3

457.46

457.155

C, 65.64; H, 4.41; F, 4.15; N, 15.31; O, 10.49

2170491-77-5

AMXI-5001 hydrochloride

145426155

Off-white to light yellow solid powder

4.2

109

3

6

6

34

795

0

C1C=CC2C(CC3=CC(C4C=CC5NC(NC(=O)OCC)=NC=5C=4)=C(C=C3)F)=NNC(=O)C=2C=1

DCSUGHIXMFUMOQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H20FN5O3/c1-2-34-25(33)29-24-27-20-10-8-15(13-22(20)28-24)18-11-14(7-9-19(18)26)12-21-16-5-3-4-6-17(16)23(32)31-30-21/h3-11,13H,2,12H2,1H3,(H,31,32)(H2,27,28,29,33)

ethyl N-[6-[2-fluoro-5-[(4-oxo-3H-phthalazin-1-yl)methyl]phenyl]-1H-benzimidazol-2-yl]carbamate

2170491-77-5; AMXI 5001; AMXI-5001; AMXI5001; ethyl N-[6-[2-fluoro-5-[(4-oxo-3H-phthalazin-1-yl)methyl]phenyl]-1H-benzimidazol-2-yl]carbamate; CHEMBL5222013; SCHEMBL21575709; Z5889958807

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~109.30 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。