| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
Tight junctions (TJs)
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|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
聚体合成肽 AT-1002 是新发现的一类物质的成员，可逆地促进分子跨上皮屏障的旁细胞转运。 AT-1002 可实现 Cys-Cys 二聚化 [1]。细胞 ATP 含量用于确定 AT-1002 处理（0 至 5 mg/mL，3 或 24 小时）对未分化 Caco-2 细胞的活力。在任何浓度下，AT-1002 处理长达三个小时，细胞活力均不受影响。例如，5 mg/mL AT-1002 对 Caco-2 细胞的活力没有影响。 24 小时后，2.5 mg/mL 及以上剂量的 AT-1002 会降低细胞活力。然而，如果细胞在接触 AT-1002 3 小时后被净化，它们在一天后仍能存活，这表明 AT-1002 不会对细胞造成不可逆转的伤害 [2]。
AT-1002是一种六聚体肽，通过荧光显微镜观察到，它导致ZO-1从细胞连接处重新分布。AT-1002还激活了src和丝裂原活化蛋白（MAP）激酶途径，增加了ZO-1酪氨酸磷酸化和肌动蛋白丝的重排。从功能上讲，AT-1002导致Caco-2细胞单层跨上皮电阻（TEER）的可逆降低和荧光黄渗透性的增加。[2] 使用CellTiter Glo®细胞活力测定法测量AT-1002对细胞活力的影响。处理3小时后，与未处理的对照细胞相比，AT-1002没有显著降低细胞存活率（图2）。这些数据表明，该化合物增强LY通透性是由于其通透性调节活性，而不是由于细胞存活率降低[1]。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
体内活性[2]
确定上述AT-1002的体外作用是否可以转化为体内作用是非常有趣的。先前已经证明AT-1002能够增加体内给药到胃肠系统的有效载荷的递送（Motlekar等人，2006，Song等人，2008a，Song等，2008b）。在这里，我们想确定AT-1002是否可以增强应用于气道上皮的有效载荷的输送。因此，我们测试了AT-1002是否可以增加鲑鱼降钙素（sCT）的全身暴露，而鲑鱼降钙钙素本身的生物利用度非常低。向大鼠气管内滴注10μg sCT和越来越多的AT-1002，导致AT-1002含量最高的治疗组肺部吸收增加，sCT全身浓度升高（图8）。当在AT-1002给药后2小时给予sCT时，没有观察到吸收增强，表明AT-1002的作用是短暂的（数据未显示）。在300μg AT-1002的给药剂量以下，药代动力学参数之间没有观察到差异（数据未显示）。300和1000μg at-1002的sCT AUC0-240min明显高于对照组（0μg剂量）（表2）。sCT与300和1000μg AT-1002的联合给药分别使AUC比对照组增加1.6倍（161.8%）和5.2倍（522.5%）。与对照组相比，当1000μg AT-1002与sCT联合给药时，Cmax（衡量达到的最高浓度）也高出2.3倍。 |
| 酶活实验 |
TEER和荧光黄渗透性测定[2]
之前已经描述了这种方法和修改的细节（Artursson，1990，Ginski和Polli，1999）。对于经上皮电阻（TEER）和荧光黄（LY）渗透性测定，将Caco-2细胞以100000个细胞/cm2的密度接种到12孔Transwells™（孔径0.4μm）上，并生长21-28天，直至完全分化。Caco-2细胞单层的顶端和基底外侧隔室在37°C下在HBSS中预孵育30分钟。将含有0.4至5 mg/ml AT-1002或HBSS中5 mg/ml打乱肽的AT-1002浓度范围的处理溶液加入到每个单层的顶端隔室中，然后在37°℃、50 rpm下孵育180分钟。使用MilliCell ERS在0、30、60、120和180分钟下测量TEER。在180分钟时，顶端隔室用7.5 mM荧光黄替换AT-1002。在37°C下孵育1小时后，从基底外侧室中取出样品，在Tecan Spectrofluor荧光板读数器中以485 nm的激发波长和535 nm的发射波长分析LY。计算每种处理的TEER降低和LY渗透性增加，并相对于未处理的荧光黄对照表示。渗透率计算如下：Papp=[（dC/dt）×Vr]/（Co×A），其中dC/dt是渗透率，Vr是接收器的体积，A是膜过滤器的表面积，Co是供体室中的初始浓度，增强比定义为Papp AT-1002/Papp HBSS。 AT-1002对Caco-2细胞影响的可逆性[2] 如上所述，将Caco-2细胞接种在transwell膜上，并在37°C、5%CO2和95%湿度的DMEM中生长21天，每隔一天更换一次培养基。在生长期结束时，从上部（顶端）和下部（基底外侧）隔室中取出培养基。细胞在预热（37°C）的HBSS（含Ca和Mg）中与10 mM HEPES pH 7.4一起孵育。在HBSS中，用或不用浓度为5mg/ml的AT-1002对转运井进行不同时间的顶部处理。15、30、45和60分钟后，AT-1002要么被HBSS替换，要么根本不移除。在不同时间点使用欧姆表监测TEER读数。 |
| 细胞实验 |
细胞活力测定[2]
细胞类型： Caco-2 细胞 测试浓度： 0 至 5 mg/mL 孵育时间：3或24小时 实验结果：处理长达3小时在任何浓度下都不会影响细胞活力。在 2.5 mg/mL 或更高的浓度下，24 小时（hours））后细胞活力下降。 体外细胞毒性试验[2] 通过使用发光ATP测定法测量细胞中ATP的量来确定细胞存活率。ATP的浓度由甲虫荧光素在Mg2+和ATP依赖的反应中被萤光素酶单氧化时发出的光量决定。在去除生长培养基后，将100μl Hank's平衡盐溶液（HBSS）中0至5mg/ml的浓度范围内的AT-1002添加到96孔组织培养板上生长的30000个Caco-2细胞中。3小时后，将等体积的细胞滴度Glo试剂加入孔中，在Tecan Spectrafluor plus平板阅读器中孵育15分钟后测量化学发光。生成ATP的标准曲线，并用于计算用AT-1002处理后的ATP浓度。 免疫荧光[2] IEC6电池以每室60000个电池的速度镀在8室载玻片上。在接种后24小时，在无血清培养基中洗涤细胞，并在37°C下用稀释于无血清培养基中的AT-1002（5mg/ml）孵育60分钟。处理后，在PBS中洗涤细胞，并在室温下在含有4%多聚甲醛的PBS中固定15分钟。在PBS中洗涤细胞，在室温下在含有0.5%Triton X-100的PBS中透化5分钟，并在室温下用含有2%山羊血清的PBS封闭30分钟。然后将细胞与稀释在阻断缓冲液（pMLC（1:50））中的一抗在37°C下孵育1-2小时。在PBS中洗涤细胞，并在室温下与FITC标记的抗兔抗体一起孵育45分钟。分别使用Alexa Fluor555鬼笔环肽和FITC标记的抗ZO-1抗体检测肌动蛋白和ZO-1。将载玻片洗涤并安装在含有DAPI的Vectashield中，并在Nikon-TE2000荧光显微镜上成像。 Caco-2 BBE细胞在37°C下用AT-1002（5 mg/ml）在顶部处理3小时。将以下处理细胞固定在甲醇：丙酮（1:1）中，并用含有2%山羊血清的PBS封闭。将过滤器与FITC标记的抗ZO-1抗体在室温下孵育1小时，洗涤并如上所述安装在载玻片上。 流式细胞术[2] Caco-2 BBE细胞在37°C下用AT-1002（5 mg/ml）在顶部处理3小时。处理后，使用胰蛋白酶将细胞从过滤器中分离出来。分离的细胞在PBS中洗涤，在室温下在含有4%多聚甲醛的PBS中固定15分钟，在含有0.5%Triton X-100的PBS中在室温下渗透5分钟，并在含有2%山羊血清的PBS中封闭30分钟。细胞在室温下与Alexa Fluor555鬼笔环肽一起孵育1小时，在PBS中洗涤，并使用FACSCAN通过流式细胞术进行分析。 |
| 动物实验 |
气管内给予鲑鱼降钙素[1]
本研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠，研究开始时大鼠年龄约为12周。所有大鼠均经气管内滴注10 μg鲑鱼降钙素（sCT），溶于200 μl生理盐水中，生理盐水中分别含有0、300或1000 μg AT-1002（每剂量组n=6）。分别于给药前及给药后2.5、5、10、15、30、60、120和240分钟采集血样（200 μl），置于EDTA抗凝管中。分离血浆，并于≤-70 °C保存，直至进行sCT测定。本研究采用略作修改的DSL 10–3600 ACTIVE®鲑鱼降钙素酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒测定大鼠血浆中sCT的浓度。该检测方法是一种酶促扩增的“两步法”夹心免疫测定，采用生物素-链霉亲和素桥联检测系统。本研究使用大鼠血清作为基质配制标准品，浓度范围为15.6至1000 pg/ml，定量下限（LLOQ）为31.3 pg/ml。样品体积为50 μl。必要时，对于预期或实测浓度高于1000 pg/ml的样品，使用大鼠血清作为基质进行稀释。使用BioTek酶标仪上的KC4软件，采用四参数拟合模型计算标准曲线。结果表明，样品（大鼠血浆）和标准品（大鼠血清）基质的差异似乎并未影响检测性能。使用 Microsoft Excel® 和线性梯形法则计算 AUC，并使用 GraphPad Prism 4.01 版绘制数据。还确定了每种条件下的 Cmax 和 Tmax。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
AT-1002 是一种六肽合成肽，属于一类新兴的新型化合物，能够可逆地增强分子跨上皮屏障的细胞旁路转运。本项目旨在阐明该肽的构效关系，并着重研究其 P2 位半胱氨酸残基的替换。本文报道了我们发现的具有可逆性通透性增强特性且稳定性更高的肽。[1]
紧密连接 (TJs) 是控制细胞旁路通透性和上皮极性的细胞间结构。目前普遍认为，TJs 是高度动态的结构，其活性受内源性和外源性刺激的调控。本文详细阐述了 AT-1002 的作用机制，AT-1002 是霍乱弧菌第二种毒素——紧密连接毒素 (ZOT) 的活性结构域。 AT-1002 是一种六肽，荧光显微镜观察显示，它能使 ZO-1 从细胞连接处重新分布。AT-1002 还能激活 Src 和丝裂原活化蛋白激酶 (MAP) 通路，增加 ZO-1 酪氨酸磷酸化水平，并导致肌动蛋白丝重排。功能上，AT-1002 可逆性地降低了 Caco-2 细胞单层的跨上皮电阻 (TEER)，并增加了荧光素黄的通透性。体内实验表明，与对照组相比，鲑鱼降钙素与 1 mg AT-1002 联合给药可使 AUC 值增加 5.2 倍。我们的研究结果为AT-1002诱导的紧密连接解体提供了机制解释，并证明AT-1002可用于体内递送其他药物。[2]药物吸收主要通过被动跨细胞和旁细胞转运机制进行（Behrens等，2001）。亲脂性药物主要通过跨细胞途径以及质膜上的通道、泵和载体等转运蛋白进行转运。然而，旁细胞途径通常是亲水性药物（蛋白质、肽等）的主要吸收途径。我们在此证实，源自ZOT的小肽AT-1002可导致Caco-2细胞单层紧密连接的开放（Motlekar等，2006；Song等，2008a），并表明这种作用是可逆的。其他实验表明，气管内联合给予AT-1002和鲑鱼降钙素可使鲑鱼降钙素的全身暴露量增加高达5.2倍，这提示我们可以使用AT-1002进行抗原和其他有效载荷的全身递送。事实上，先前的研究表明，AT-1002可以增强小分子的递送（Motlekar等，2006；Song等，2008a；Song等，2008b）。另一项研究表明，来自紧密连接蛋白occludin胞外环的肽段可用于调节紧密连接（Tavelin等，2003），其作用机制是通过增加紧密连接的通透性，且不会引起短期毒性。然而，这些肽段仅在添加到单层细胞的基底外侧时才有效。能够增强药物或抗原递送的试剂必须应用于上皮细胞表面的顶端才能发挥作用。本文表明，AT-1002 就是这样一种试剂，因此代表了一类新型紧密连接（TJ）调节剂的原型。 像 AT-1002 这样的 TJ 开放分子可以设想两种主要应用：传统的药物递送和用于疫苗接种的抗原递送。最近，研究表明轮状病毒衣壳中的一种肽能够促进大鼠对胰岛素的吸收（Nava 等，2004）。其他 TJ 调节（TJM）肽和肽 YY（PYY）也能改善药物跨上皮组织的转运（Chen 等，2006；Gonzalez-Mariscal 和 Nava，2005）。因此，能够实现高效、无毒、无创药物递送的化合物将彻底改变多种疾病的治疗方式。因此，像 AT-1002 这样的 TJ 调节肽代表了粘膜药物递送领域的一项有希望的进展。[2] |
| 分子式 |
C32H53N9O7S
|
|---|---|
| 分子量 |
707.88432
|
| 精确质量 |
707.379
|
| CAS号 |
835872-35-0
|
| 相关CAS号 |
AT-1002 TFA
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| PubChem CID |
11600115
|
| 外观&性状 |
Typically exists as solid at room temperature
|
| LogP |
5.074
|
| tPSA |
326.97
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
10
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
10
|
| 可旋转键数目(RBC) |
22
|
| 重原子数目 |
49
|
| 分子复杂度/Complexity |
1130
|
| 定义原子立体中心数目 |
6
|
| SMILES |
N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(N[C@@H](CS)C(N[C@@H]([C@H](CC)C)C(NCC(N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)=O)=O)=O)=O)=O
|
| InChi Key |
LADIUXCZKYKVRR-PSEZLDIXSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C32H53N9O7S/c1-5-19(4)26(41-29(45)24(17-49)40-27(43)21(33)15-20-10-7-6-8-11-20)30(46)37-16-25(42)38-22(12-9-13-36-32(34)35)28(44)39-23(31(47)48)14-18(2)3/h6-8,10-11,18-19,21-24,26,49H,5,9,12-17,33H2,1-4H3,(H,37,46)(H,38,42)(H,39,44)(H,40,43)(H,41,45)(H,47,48)(H4,34,35,36)/t19-,21-,22-,23-,24-,26-/m0/s1
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| 化学名 |
(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid
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| 别名 |
835872-35-0; AT-1002; L-Leucine, L-phenylalanyl-L-cysteinyl-L-isoleucylglycyl-L-arginyl-; (2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid; L-Phenylalanyl-L-cysteinyl-L-isoleucylglycyl-L-arginyl-L-leucine; CHEMBL500518;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 1.4127 mL | 7.0633 mL | 14.1267 mL | |
| 5 mM | 0.2825 mL | 1.4127 mL | 2.8253 mL | |
| 10 mM | 0.1413 mL | 0.7063 mL | 1.4127 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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