AMYR/amylin receptors; CTR/calcitonin G protein-coupled receptor

通过体外受体结合和效力筛选来确定脂肪酸酰化的最佳附着点，从而对SAR进行了研究，得出了cagrilintide (23)（AM833或NN0174-0833；拟议的国际非专有名称：cagrilinide）。可以推测脂肪酸的定位会影响类似物与胰淀素受体相互作用的能力，并增加或减少与受体和大脑的接触。选择的共同骨架类似于普兰林肽（见表1），而不是h-amylin，以减少纤维形成的问题。[2]
我们发现，骨架中的某些位置可以突变为赖氨酸，随后在赖氨酸侧链上用弱白蛋白结合脂肪酸酰化，类似于利拉鲁肽中使用的脂肪酸，效力没有或略有损失（例如，N末端部分的位置1和3，螺旋部分的位置11和18，以及C末端部分的21、28和31），而在功能测定中，其他位置的修饰结果显示效力降低（例如，位置2、10、14-17和29）（数据未显示）。N-末端部分被确定为脂肪酸最有希望附着的位置。当用C20二酸（强白蛋白结合）对N-末端脂化的类似物与参考品普兰林肽和s-降钙素进行比较时，观察到效力明显下降。效力的丧失是由测定中白蛋白的存在引起的，通常在更强的白蛋白结合物中出现，例如在塞马谷肽的情况下。脂肪酸与白蛋白结合，干扰受体相互作用，导致效力明显丧失。相比之下，结合测定是在卵清蛋白存在的情况下进行的，卵清蛋白减少了非特异性结合，但不与脂肪酸结合或影响受体相互作用。还证实了酰胺化的C末端对生物活性至关重要，几乎没有修饰的空间，对修饰的低灵敏度和易于合成的最佳结合位置似乎是N末端。这是一个惊喜，因为胰淀素和GLP-1受体都属于GPCR受体的B1亚家族，但GLP-1不能在N端脂质化而不丧失效力。[2]
这些观察结果可以通过与AMY3R结合的cagrilintide (23)同源模型（图1）以及GLP-1受体最近的冷冻EM结构来解释。这些结构预测CTR/RAMP复合物具有比GLP-1受体更开放的结构。此外，虽然GLP-1的N端以α-螺旋的形式渗透到跨膜（TM）结构域中（参见支持信息中的图S-5），但胰淀素肽的N端预计会形成一个由二硫键稳定的环，该环指向TM区域，从而耐受N端脂质化。AMY3R的同源模型，加上没有脂质化的cagrilintide (23)的apo晶体结构，也预测在cagrilintide (23)的N端部分存在一个螺旋片段（残基5-18），该片段由14和17位之间的盐桥稳定，并且C端总体上采用扩展的构象，与CTR的细胞外N端结构域结合，其中残基20-24形成一个非结构化的环。[2]

卡格林肽（化合物 23）可减少大鼠的食物摄入量（0.1、1、3、10、30 nmol/kg；皮下注射）[2]。静脉内或皮下注射（10 nmol/kg）时，卡格列肽表现出良好的药代动力学参数[2]。

SAR中使用的体外检测：[2]
筛选计划包括对人CTRa和AMY3受体的体外筛选，以及对强效化合物的类似大鼠筛选。因此，Cagrilintide的选择是通过8种不同的体外试验（两种化合物的功能效力和结合亲和力）完成的。模拟开发已经进行了一段时间。为了确保在此期间测定的质量和稳定性，我们在每个实验中都加入了普兰林肽作为参考化合物，这使得随着时间的推移进行比较成为可能和有意义的。此外，普兰林肽的转换（效力或亲和力）分别用作AMY3R和CTR表达的验证。

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人降钙素受体萤光素酶测定[2]
测量cAMP反应元件介导的活性的功能报告分析在该功能分析中使用了稳定转染有人降钙素受体和cAMP反应元件萤光素酶报告基因的幼仓鼠肾（BHK）570细胞系。在该细胞系中，当按照本节所述进行测量时，人降钙素受体活性反映在对胰淀素类似物产生反应的萤光素酶强度上。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、1%Pen/Strep和1 mM丙酮酸钠的生长培养基（Dulbecco改良的Eagle培养基[DMEM]）中培养。甲氨蝶呤（250 nM）和新霉素（500µg/ml）分别用作萤光素酶和降钙素受体的选择标记。用PBS洗涤约80-90%融合的细胞，并用Versene将其从板上提起。离心（2分钟，1300 rpm）后，将细胞沉淀溶解在10%DMSO、30%FBS和60%生长培养基中（见上文），并冷冻（-80°C）直至使用。实验前一天，将细胞解冻、洗涤并接种在白色96孔培养板上的100μl生长培养基（如上所述）中（20000个细胞/孔）。在37°C和5%CO2下孵育过夜后，用50μl/孔的测定培养基（DMEM[不含酚红]、谷氨酸、10%FBS和10 mM HEPES（[4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸]，pH 7.4）代替生长培养基。此外，加入在测定缓冲液中稀释的50μl/孔样品。在37°C和5%CO2下孵育3小时后，取出培养基，用100μl/孔PBS和100μl/min孔SteadyLite代替。将板密封并在室温下孵育30米。最后，在TopCounter上以单光子计数（SPC）模式测量发光。EC50值在GraphPad Prism中使用非线性回归计算，pEC50值计算为-LogEC50。

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人胰淀素3受体萤光素酶测定[2]
测量cAMP反应元件介导的活性的功能报告分析为了产生表达AMY3R的稳定克隆，Hollex-1细胞进一步用受体活性修饰蛋白3（RAMP3）和pcDNA3.1/潮霉素转染，后者用作选择标记。简而言之，转染是在转染前一天在接种了1250000的T75烧瓶中进行的。用9μg RAMP3 cDNA、1μg pcDNA3.1/潮霉素和25μl FuGENE 6转染细胞。此后，选择表达RAMP3的稳定克隆。稳定的克隆在含有10%FBS、1%Pen/Strep和1 mM丙酮酸钠、甲氨蝶呤（250 nM）、新霉素（500µg/ml）和潮霉素（400µg/ml）的DMEM中培养。甲氨蝶呤（250 nM）、新霉素（500µg/ml）和潮霉素（400µg/ml）分别用作萤光素酶、降钙素受体和RAMP3的选择标记。用PBS洗涤约80-90%融合的细胞，并用Versene将其从板上提起。离心（2分钟，1300 rpm）后，S8将细胞沉淀溶解在10%DMSO、30%FBS和60%生长培养基中（见上文），并冷冻（-80°C）直至使用。实验前一天，将细胞解冻、洗涤并接种在白色96孔培养板上的100μl生长培养基（如上所述）中（20000个细胞/孔）。在37°C和5%CO2下孵育过夜后，用50μl/孔的测定培养基（DMEM[不含酚红]、Glutamax、10%FBS和10 mM HEPES，pH 7.4）代替生长培养基。此外，加入在测定缓冲液中稀释的50μl/孔样品。在37°C和5%CO2下孵育3小时后，取出培养基，用100μl/孔PBS和100μl/min孔SteadyLite代替。将板密封并在室温下孵育30米。最后，在SPC模式下在TopCounter 上测量发光。EC50值在GraphPad Prism中使用非线性回归计算，pEC50值计算为-LogEC50。

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大鼠降钙素受体[2]
根据制造商的建议（BHK-tk-ts 13是BHK细胞系的温度敏感克隆，如Talavera和Basilico，1977年所述），使用FuGENE 6以1µg cDNA:1.5µl FuGENE 6的比例用大鼠降钙素受体瞬时转染cAMP测定BHK 13细胞。1细胞在含有10%FBS和1%Pen/Strep的DMEM中生长。转染后约24小时，收集细胞并冷冻（-80°C）直至使用。在实验当天，将细胞解冻，洗涤两次，然后在PBS缓冲液（2%人血清白蛋白[HSA]，0.5%吐温20）中洗涤。将细胞（100000个细胞/孔）接种到带有样品或标准品的96孔FlashPlate中。在此，将50µl悬浮液加入到含有50µl测试化合物或参考化合物（2%HSA，0.5%吐温20）的FlashPlate中。将混合物摇动5分钟，并在室温下静置25分钟。用100µl检测混合物pro-well（检测混合物；11ml检测缓冲液和100µl[~2µCi]cAMP[125I]示踪剂）停止反应。然后用塑料密封板，摇动30分钟，静置过夜（或至少2小时），并在Topcounter中测量闪烁（2分钟/孔）。一般来说，遵循FlashPlate试剂盒方案中描述的检测程序（FlashPlate cAMP检测[NEN生命科学产品目录号SMP004]）。使用标准曲线测定cAMP量，曲线显示在GraphPad PRISM中。EC50值在GraphPad Prism中使用非线性回归计算，pEC50值计算为‑LogEC50。

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大鼠胰淀素受体3[2]
cAMP测定BHK-tk-ts13细胞（Talavera和Basilico，1977）用2.5µl FuGENE 6prµg cNDA瞬时转染大鼠降钙素受体（150µg大鼠CTR cDNA pr 10000000细胞）和大鼠RAMP 3（cDNA比率为1µg CTR cDNA pr 1.5µg大白鼠RAMP3）。细胞在含有10%FBS和1%Pen/Strep的DMEM中生长。转染后约24小时，收集细胞并冷冻（-80°C）直至使用。在实验当天，将细胞解冻，洗涤两次，然后在PBS缓冲液（2%HSA，0.5%吐温20）中洗涤。将细胞（100000个细胞/孔）接种到带有样品或标准品的96孔FlashPlates（Perkin-Elmer）中。在此，将50µl悬浮液加入到含有50µl测试化合物或参考化合物（2%HSA，0.5%吐温20）的FlashPlate中。将混合物摇动5分钟，并在室温下静置25分钟。用100µl检测混合物pro-well（检测混合物；11 mL检测缓冲液和100µl[~2µCi]cAMP[125I]示踪剂）停止反应。然后用塑料密封板，摇动30分钟，静置过夜（或至少2小时），并在Topcounter中测量闪烁（2分钟/孔）。一般来说，遵循FlashPlate试剂盒方案中描述的测定程序（Plate cAMP测定。使用标准曲线在S9中测定cAMP量，曲线显示在GraphPad PRISM中。使用非线性回归在GraphPad PRISM中计算EC50值，将pEC50值计算为-LogEC50。

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降钙素受体结合试验（人和大鼠）[2]
使用来自PerkinElmer的闪烁邻近试验（SPA）珠（RPNQ0001）和含有人或大鼠降钙素受体的细胞膜进行结合试验。用人或大鼠降钙素受体瞬时转染BHK-tk-ts13细胞，并如上所述进行培养。膜的制备方法如下：用PBS冲洗细胞，在收获前用Versene孵育约5分钟。用PBS冲洗细胞，将细胞悬浮液以1000rpm离心5分钟。将细胞在含有20 mM Na HEPES和10 mM EDTA（pH 7.4）的缓冲液中均质化，并在20000 rpm下离心15分钟。将所得沉淀重新悬浮、均质化并离心（20000 rpm，15分钟）于含有20 mM Na-HPES和0.1 mM EDTA的缓冲液（pH 7.4，缓冲液2）中。将所得沉淀重新悬浮在缓冲液2中，并测量蛋白质浓度。在整个过程中，匀浆保持低温。膜在使用前保持在-80°C。在384孔Optiplate中进行测定，总体积为40µl。膜与SPA珠以1:1的比例混合。SPA珠的最终浓度为0.05mg/孔。将测试化合物溶解在DMSO中，并在测定缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，1 mM CaCl2，5 mM MgCl2，0.1%卵清蛋白和0.02%吐温20）中进一步稀释。将放射性配体125I-降钙素溶解在测定缓冲液中，并以75 pM/孔（30000 cpm/10µl）的终浓度加入Optiplate中。在离心（1500 rpm，10分钟）之前，将最终混合物在25°C下孵育120分钟。样品在TopCounter上进行分析。使用GraphPad Prism5（单位点结合竞争分析）计算IC50，pIC50值计算为-LogIC50。

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胰淀素3受体结合试验（人和大鼠）[2]
使用来自PerkinElmer的SPA珠（RPNQ0001）和含有人或大鼠胰淀素3受体的细胞膜进行结合测定。以等摩尔比（1:3µg）用人或大鼠降钙素受体和人或大白鼠RAMP 3瞬时转染BHK13细胞，并如上所述进行培养。膜的制备方法如下：用PBS冲洗细胞，在收获前用Versene孵育约5分钟。用PBS冲洗细胞，将细胞悬浮液以1000rpm离心5分钟。将细胞在含有20 mM Na HEPES和10 mM EDTA（pH 7.4）的缓冲液中均质化（超高压），并在20000 rpm下离心15分钟。将所得沉淀重新悬浮、均质化并离心（20000 rpm，15分钟）于含有20 mM Na-HEPES和0.1 mM EDTA的缓冲液（pH 7.4，缓冲液2）中。将所得沉淀重新悬浮在缓冲液2中，并测量蛋白质浓度（BCA蛋白质测定，Pierce）。在整个过程中，匀浆保持低温。膜在使用前保持在-80°C。在384孔Optiplate中进行测定，总体积为40µl。膜与SPA珠以1:1的比例混合。SPA珠的最终浓度为0.05mg/孔。将测试化合物溶解在DMSO中，并在测定缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，1 mM CaCl2，5 mM MgCl2，0.1%卵清蛋白和0.02%吐温20）中进一步稀释。将放射性配体125I大鼠胰淀素溶解在测定缓冲液中，并以50 pM/孔（20000 cpm/10µl）的最终S10浓度加入Optiplate。在离心（1500 rpm，10分钟）之前，将最终混合物在25°C下孵育120分钟。样品在TopCounter上进行分析。使用GraphPad Prism5（单位点结合竞争分析）计算IC50，pIC50值计算为-LogIC50。

纤维蛋白形成倾向测试（ThT检测）[2]
根据纤维形成的倾向评估单个胰淀素类似物的稳定性，以纤维形成前的时间（滞后时间）和溶解肽的损失（肽恢复）表示。评估了暴露于机械应力时形成原纤维的倾向，如之前使用噻唑染料ThT的胰岛素制剂所述，该染料在淀粉样原纤维存在的情况下表现出特定的荧光特性。通过将每种化合物溶解在10 mM甘氨酰甘氨酸缓冲液（pH 4.0）或10 mM HEPES缓冲液（pH7.5）中至标称浓度为250μM，然后加入ThT储备溶液（0.1 mM）至最终ThT浓度为1μM来制备样品。将每种溶液等分（200μL/孔；n=4）到用透明箔密封的微量滴定板上。使用Fluoroskan Ascent FL荧光板读数器在37°C温育、960 rpm、1 mm振幅下施加机械应力，荧光读取间隔为20分钟，持续45小时（滤光片：激发444 nm；发射485 nm）。通过目视检查每个样品的荧光与时间图来评估荧光增加的滞后时间。如果没有检测到原纤维形成，则将滞后时间设置为等于测试长度（45小时）。分析后，将代表单个复制品的孔合并，使用离心（20000g，室温下30分钟）分离残留的可溶性肽，然后过滤0.22μm。使用配备XBridge柱（桥接乙基硅氧烷/二氧化硅杂化物130 C18 3.5μm至4.6×50 mm）的Waters Alliance 2695系统测定残留溶解肽的量，流速为2 mL/min，温度为30°C，检测波长为215/276 nm。施加结合洗脱剂A（7.7%w/w乙腈、200 mM Na2SO4、20 mM NaH2PO4、20 mmol Na2HPO4，pH 7.2）和洗脱剂B（65.5%w/w乙腈）的梯度（%A/%B:0-11/2分钟：80/20；11/2-2分钟：与50/50呈线性关系；2-51/2分钟：50/50；51/2-6分钟：与80/20呈线性关系）。以相对于暴露于机械应力之前的溶解肽量的相对比例（肽回收率）报告残留溶解肽的量。

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SAR分析的体外表征[2]
在稳定表达报告基因和指定受体的幼仓鼠肾（BHK）细胞上进行的cAMP反应元件萤光素酶报告基因测定中获得了对人AMY3R和CTR的效力。通过对瞬时表达受体的BHK细胞进行cAMP测定，确定了对大鼠AMY3R和CTR的效力。萤光素酶测定细胞在实验前一天解冻并孵育过夜。在实验当天，洗涤细胞并用激动剂孵育3小时。移除培养基，用1:1比例的磷酸盐缓冲盐水和稳定石代替，在室温下孵育30分钟，然后测量发光。在cAMP测定中，在实验当天将转染的细胞解冻并接种到FlashPlates中，并与激动剂一起孵育30分钟。用检测混合物停止反应。然后用塑料密封板，摇动，然后静置至少2小时，然后测量闪烁。EC50值在GraphPad Prism中计算。 使用PerkinElmer的珠子和含有AMY3R或CTR的细胞膜通过闪烁邻近试验测定表观结合亲和力。用人或大鼠受体瞬时转染BHK细胞并培养24小时。收集、制备膜，并将其保持在-80°C下直至使用。该测定在384孔Optiplate中进行。将膜与闪烁邻近测定珠以1:1的比例混合。将测试化合物溶解在DMSO中，在测定缓冲液中进一步稀释，并与溶解的放射性配体一起加入Optiplate中。在CTR结合试验中，125I降钙素用作放射性配体，125I大鼠胰淀素用作AMY3R试验的放射性配体。在离心之前，将最终混合物在25°C下孵育120分钟。样品在TopCounter（Packard）上进行分析。使用GraphPad Prism5计算IC50值。为了确保测定的质量和稳定性，我们在SAR中使用的所有测定中的每个实验中都将普兰林肽作为参考化合物。观察到的普兰林肽效力或结合亲和力的变化分别用作AMY3R和CTR（a）的验证。当用胰淀素或降钙素肽类似物刺激时，未转染细胞中没有观察到反应，当暴露于胰淀素和降钙素多肽家族的放射性配体时，未感染细胞中也没有观察到信号。

动物/疾病模型： 12周龄，400克Sprague Dawley雄性大鼠[2] 剂量：0.1、1、3、10、30 nmol/kg
给药途径： 皮下注射；一次，持续80小时
实验结果： 在1-10 nmol/kg剂量下，大鼠的食物摄入量减少，持续数日。

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动物/疾病模型： 12周龄，400克Sprague Dawley雄性大鼠[2]
剂量： 10 nmol/kg
给药途径： 静脉注射； sc
实验结果： 显示出良好的药代动力学/PK/PK 参数，静脉注射 (iv) 和皮下注射的 T1/2 分别为 20±2 小时和 27±3 小时。\n

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\n\n体内实验 [2]
\n体内实验已获得丹麦动物实验监察局的批准。所有动物均可获得遮蔽物、筑巢材料和咀嚼棒，并在任何实验前至少 1 周进行适应性训练并习惯于被操作。除监测食物摄入量前一周及监测期间外，大鼠均群养。\n

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\n\n大鼠急性食物摄入量[2]
\n使用自动化食物摄入量监测系统分析了单次给予选定的胰淀素类似物后60小时内瘦鼠的食欲变化。该系统最多可容纳32只雄性Sprague Dawley大鼠（Taconic Europe，体重：200-250克），大鼠可自由摄取标准饲料和自来水（通过水瓶提供），并单独饲养以记录每只大鼠的食物消耗量。大鼠在受控温度条件（20℃±1℃）下，于测试前至少5天适应反转光照周期（12小时光照/12小时黑暗）和单独饲养。胰淀素类似物在关灯前立即皮下注射。记录给药后48或60小时的食物摄入量。筛选剂量水平为 3 和 30 nmol/kg，n = 5–7。对照组大鼠给予赋形剂。测试物质配制于 2 mM 乙酸盐、250 mM 甘油、0.025% Tween-20 和 pH 4 的溶液中。分别计算 0–24 小时、24–48 小时和 48–60 小时的累积食物摄入量。将各剂量组的平均累积食物摄入量与赋形剂组进行比较，并以赋形剂组平均食物摄入量的百分比表示，赋形剂组的平均食物摄入量定义为 100%。\n

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\n\n卡格里林肽的药代动力学评价 [2]
\n在药代动力学实验前 2 周，对 Sprague Dawley 雄性大鼠（约 400 g，12 周龄）进行操作程序适应性训练。在暂时固定大鼠后，通过尾静脉置入的Venflon导管进行静脉推注，并在颈部进行皮下注射。给药剂量为2 mL/kg，浓度为10 nmol/kg。分别于5、15和30分钟以及1、1.5、2、4、6、12、24、48、72和96小时从舌静脉采集血样（200 μL）。所有血样均收集于含EDTA的试管中以稳定血液，并置于冰上直至离心。通过离心分离血浆，并将血浆储存于-20 °C或更低温度直至分析。血浆样品采用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）进行分析，仪器为Applied Biosystems公司的三重四极杆质谱仪或Orbitrap质谱仪。在三重四极杆质谱仪上进行分析时，采用 m/z 1103 → 1075 的多反应监测 (MRM) 模式；而在 Orbitrap 质谱仪上，则采用 m/z 1102–1107 的扫描范围（选择离子监测）。血浆样品用三倍体积的含 1% 甲酸的乙醇稀释，所得上清液在进行 LC-MS 分析前，使用 Thermo Fisher 公司的 Cyclone (50 × 0.5 mm) 色谱柱进行湍流色谱在线净化。LC-MS 分析采用 Phenomenex 公司的 Onyx Monolithic C18 色谱柱 (50 × 2.0 mm ID)。梯度 HPLC 的流动相由 5% 和 95% 的有机溶剂（乙腈和甲醇的 50:50 混合物）组成，并在两种洗脱液中均添加了浓度为 0.1% 的甲酸。定量下限为 2 nM。\n采用 Phoenix WinNonlin Professional 6.2（Pharsight，美国加利福尼亚州山景城）进行非房室模型分析，分析血浆浓度-时间曲线。计算基于动物个体的浓度-时间值。除非另有说明，AUC 的计算和给出形式为 AUCinf_pred。所有研究中，外推 AUC 的百分比均小于 25%。皮下生物利用度计算公式为 (AUC/剂量) sc/(AUC/剂量) iv。除 T1/2 和 Tmax 分别以调和平均值和几何平均值表示外，所有给出的平均值均为算术平均值。

化合物 23 的作用持续时间体现在其在食物摄入筛选模型中表现出的持久食欲抑制作用（图 3），并在大鼠药代动力学研究中得到进一步证实（图 4 和表 7）。此外，在 pH 7.5 的 ThT 检测中，化合物 22 的滞后时间短于化合物 23。因此，化合物 23 被选为临床开发药物，并于 2020 年完成了 II 期临床试验。研究重点是索玛鲁肽和卡格瑞肽的联合用药，因为有研究表明胰淀素和 GLP-1 疗法的联合作用机制部分互补。已发表的卡格瑞肽和索玛鲁肽联合用药的临床数据显示，在一项为期 20 周的 IB 期研究中，卡格瑞肽能够在索玛鲁肽的基础上额外诱导 7.4% 的体重减轻，总减重达到 17.1%，因此值得在肥胖症领域进行进一步研究。半衰期为 159–195 小时。这证实了用脂肪酸二酸进行脂化可延长肽类激素的半衰期，尽管卡格瑞林肽的白蛋白结合率并未直接测定。大量证据表明，与带负电荷的脂肪酸衍生物结合的长效肽和蛋白质表现出强效且可逆的白蛋白结合。此外，我们还研究了与本文报道类似的体外受体测定，但使用了不同量的白蛋白，数据（此处未显示）支持卡格瑞林肽与 GLP-1 类似物索玛鲁肽一样，是一种可逆的白蛋白结合剂。[2]

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物种；n；给药途径；剂量（nmol/kg）；AUC/D（h·kg/L）；Vz（L/kg）；Cl（L/h/kg）；T1/2（h） Sprague Dawley 大鼠；5；静脉注射；10；266；0.109； 0.00377；20 ± 2
Sprague Dawley 大鼠；5；sc；10；87；N/A；N/A；27 ± 3

[1]. AM833 Is a Novel Agonist of Calcitonin Family G Protein-Coupled Receptors: Pharmacological Comparison with Six Selective and Nonselective Agonists. J Pharmacol Exp Ther. 2021 Jun;377(3):417-440.

[2]. Development of Cagrilintide, a Long-Acting Amylin Analogue. J Med Chem. 2021 Aug 12;64(15):11183-11194.

[3]. Amylin as a Future Obesity Treatment. J Obes Metab Syndr. 2021 Dec 30;30(4):320-325.

肥胖及其相关并发症是严重的健康负担，亟需新的治疗方法来帮助治疗肥胖。越来越多的证据表明，靶向胰淀素受体（AMYR，降钙素G蛋白偶联受体（CTR）和受体活性调节蛋白的异二聚体）可以改善体重控制，并有可能与其他疗法（例如胰高血糖素样肽-1受体激动剂）产生协同作用。近期数据显示，AMYR激动剂（也能独立激活CTR）可能具有更高的肥胖治疗疗效，即使选择性激活CTR无效。AM833（卡格瑞肽）是一种新型脂化胰淀素类似物，目前正在进行临床试验，作为一种非选择性AMYR和CTR激动剂。在本研究中，我们考察了AM833在25个终点指标上的药理学特性，并将其与选择性和非选择性AMYR脂化类似物（AM1213和AM1784）以及临床常用的肽类激动剂普兰林肽（选择性AMYR激动剂）和鲑鱼CT（非选择性激动剂）进行了比较。我们还分析了人CT和鼠胰淀素，它们分别作为CTR和AMYR的典型选择性激动剂。结果表明，AM833在受体结合、激活和调节等多个方面均表现出独特的药理学特性。重要性声明：AM833是一种新型的非选择性降钙素家族受体激动剂，已在II期临床试验中证实其对肥胖症的治疗有效。本研究表明，与其他选择性和非选择性降钙素受体和胰淀素受体激动剂相比，AM833在受体结合、激活和调节等多个方面均表现出独特的药理学特性。目前的数据提供了对AM833作用机制的深入理解。[1]

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胰淀素是一种胰腺激素，其显著特征是极易形成淀粉样原纤维，这使得针对该激素的药物设计极具挑战性。胰淀素类似物普兰林肽已上市，可作为胰岛素治疗的辅助药物用于糖尿病治疗，但由于其半衰期短，需要每日注射三次。本文报道了稳定的脂化长效胰淀素类似物卡格林肽(23)的研发，以及一些促成该类似物被选用于以肥胖症为适应症的临床开发的构效关系研究。卡格林肽目前正在进行临床试验，单独使用或与GLP-1类似物索玛鲁肽联合使用均能显著减轻体重。[2]

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肥胖症的定义是异常或过度的脂肪堆积，会对健康造成不利影响。三分之一的人口患有肥胖症，因此必须将肥胖症视为一种需要长期治疗的慢性疾病。胰淀素与胰岛素在营养物质输送至小肠时由胰岛β细胞共同分泌，作为一种饱腹信号，作用于皮层下稳态和享乐脑区，延缓胃排空，并抑制餐后胰高血糖素反应。因此，新型胰淀素类似物可作为潜在的抗肥胖药物用于超重或肥胖人群。在本综述中，我们分析了胰淀素类似物的疗效、效力和安全性。合成胰淀素类似物普兰林肽是一种获批用于治疗糖尿病的药物，可促进更好的血糖控制并带来虽小但显著的体重减轻。AM833（卡格瑞肽）是一种在研的新型长效酰化胰淀素类似物，其作用机制为非选择性胰淀素受体拮抗剂。这种降钙素 G 蛋白偶联受体激动剂可以作为一种有吸引力的新方法来治疗肥胖症，从而以剂量依赖的方式减少食物摄入量并显著减轻体重。[3]

C194H312N54O59S2

4409.00952243805

4408.258

1415456-99-3

Cagrilintide acetate

171397054

{Eicosanedioic acid-γ-Glu}-Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Glu-Phe-Leu-Arg-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Pro-NH2 (Disulfide bridge:Cys3-Cys8)

XKCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP; {Eicosanedioic acid-γ-Glu}-KCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP-NH2 (Disulfide bridge:Cys3-Cys8)

White to off-white solid powder

-12.5

1880

60

65

137

309

10800

42

S1C[C@@H](C(N[C@H](C(N[C@H](C(N[C@@H](C)C(N[C@@H]([C@@H](C)O)C(N[C@@H](CS1)C(N[C@@H](C)C(N[C@@H]([C@@H](C)O)C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(N[C@H](C(N[C@H](C(N[C@@H](C)C(N[C@@H](CCC(=O)O)C(N[C@@H](CC1C=CC=CC=1)C(N[C@@H](CC(C)C)C(N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(N[C@@H](CO)C(N[C@@H](CO)C(N[C@@H](CC(N)=O)C(N[C@H](CC(N)=O)C(N[C@@H](CC1C=CC=CC=1)C(NCC(N1CCC[C@H]1C(N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N[C@@H](CC(C)C)C(N1CCC[C@H]1C(N1CCC[C@H]1C(N[C@H](C(N[C@H](C(N[C@H](C(NCC(N[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(N[C@@H]([C@@H](C)O)C(N1CCC[C@H]1C(N)=O)=O)=O)=O)CO)=O)=O)C(C)C)=O)CC(N)=O)=O)[C@@H](C)O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)CC(C)C)=O)CCCNC(=N)N)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)[C@@H](C)O)=O)CC(N)=O)=O)NC([C@H](CCCCN)NC(CC[C@@H](C(=O)O)NC(CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O)=O)=O)=O

LDERDVMBIYGIOI-IZVMHKDJSA-N

InChI=1S/C194H312N54O59S2/c1-19-100(10)151(184(298)233-128(78-98(6)7)189(303)248-75-49-60-137(248)190(304)247-74-48-59-136(247)182(296)243-155(107(17)255)187(301)232-127(86-143(201)262)173(287)238-150(99(8)9)183(297)210-88-146(265)218-129(90-249)176(290)230-126(85-142(200)261)175(289)244-156(108(18)256)191(305)246-73-46-57-134(246)157(202)271)239-181(295)135-58-47-72-245(135)147(266)89-211-161(275)120(79-109-50-36-34-37-51-109)225-171(285)123(82-139(197)258)228-172(286)124(83-140(198)259)229-177(291)130(91-250)235-178(292)131(92-251)234-170(284)122(81-111-87-207-95-212-111)227-164(278)114(56-45-71-209-194(205)206)221-168(282)119(77-97(4)5)224-169(283)121(80-110-52-38-35-39-53-110)226-166(280)116(65-68-149(269)270)219-158(272)101(11)213-167(281)118(76-96(2)3)223-163(277)113(55-44-70-208-193(203)204)220-165(279)115(63-66-138(196)257)222-186(300)153(105(15)253)240-159(273)102(12)214-179(293)132-93-308-309-94-133(180(294)231-125(84-141(199)260)174(288)242-152(104(14)252)185(299)215-103(13)160(274)241-154(106(16)254)188(302)237-132)236-162(276)112(54-42-43-69-195)216-145(264)67-64-117(192(306)307)217-144(263)61-40-32-30-28-26-24-22-20-21-23-25-27-29-31-33-41-62-148(267)268/h34-39,50-53,87,95-108,112-137,150-156,249-256H,19-33,40-49,54-86,88-94,195H2,1-18H3,(H2,196,257)(H2,197,258)(H2,198,259)(H2,199,260)(H2,200,261)(H2,201,262)(H2,202,271)(H,207,212)(H,210,297)(H,211,275)(H,213,281)(H,214,293)(H,215,299)(H,216,264)(H,217,263)(H,218,265)(H,219,272)(H,220,279)(H,221,282)(H,222,300)(H,223,277)(H,224,283)(H,225,285)(H,226,280)(H,227,278)(H,228,286)(H,229,291)(H,230,290)(H,231,294)(H,232,301)(H,233,298)(H,234,284)(H,235,292)(H,236,276)(H,237,302)(H,238,287)(H,239,295)(H,240,273)(H,241,274)(H,242,288)(H,243,296)(H,244,289)(H,267,268)(H,269,270)(H,306,307)(H4,203,204,208)(H4,205,206,209)/t100-,101+,102-,103-,104+,105+,106+,107-,108-,112-,113-,114-,115-,116-,117-,118+,119-,120-,121-,122-,123-,124-,125-,126+,127+,128+,129+,130-,131-,132-,133-,134+,135-,136+,137+,150+,151-,152-,153-,154-,155+,156+/m0/s1

20-[[(1S)-4-[[(2S)-6-amino-1-[[(4R,7S,10S,13S,16S,19R)-4-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S,3S)-1-[[(2R)-1-[(2R)-2-[(2R)-2-[[(2R,3S)-1-[[(2R)-4-amino-1-[[(2R)-1-[[2-[[(2R)-1-[[(2R)-4-amino-1-[[(2R,3S)-1-[(2R)-2-carbamoylpyrrolidin-1-yl]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidine-1-carbonyl]pyrrolidin-1-yl]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]carbamoyl]-16-(2-amino-2-oxoethyl)-7,13-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-10-methyl-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicos-19-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-carboxy-4-oxobutyl]amino]-20-oxoicosanoic acid

AM-833; AM833; Cagrilintide; 1415456-99-3; NN-0174-0833; NN-01740833; NN0174-0833; LDERDVMBIYGIOI-IZVMHKDJSA-N;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

Note: 如何溶解多肽产品？请参考本产品网页右上角“产品说明书“文件，第4页。

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注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。