| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
CCW-16 targets the E3 ubiquitin ligase RNF4, which is a member of the RING (Really Interesting New Gene) family of E3 ligases. RNF4 is unique in that it recognizes sumoylated proteins (SUMO chains) and facilitates their ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. This process is known as SUMO-targeted ubiquitination (STUbL). By covalently binding to RNF4, CCW-16 acts as a ligand that can be used to recruit RNF4 to a target protein of interest via the PROTAC approach. Specifically, CCW-16 can be linked to a ligand that binds a target protein (e.g., a protein of interest) to form a PROTAC molecule. The PROTAC brings the target protein into close proximity with RNF4, resulting in ubiquitination and degradation of the target protein. CCW-16 itself may also have intrinsic cellular activity: it has been reported to induce ferroptosis in acute myeloid leukemia cells by activating ROS signaling. This cell death pathway is triggered by the accumulation of lipid peroxides and is dependent on iron. The compound contains an alpha-chloroacetamide group, which is a cysteine-reactive electrophile that can form a covalent adduct with cysteine residues in RNF4 (specifically, a known reactive cysteine in the RNF4 protein). The covalent binding is required for its activity as a ligand and for the PROTAC activity. The mechanism of ferroptosis induction by CCW-16 is not fully understood but likely involves the activation of ROS pathways, possibly through the modulation of redox-sensitive proteins.
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外研究表明，CCW-16 可作为 RNF4 的共价配体，诱导癌细胞死亡。在利用 AML 细胞系（例如 MV4-11、MOLM-13）进行的细胞实验中，用浓度为 1 至 10 uM 的 CCW-16 处理 48 至 72 小时，可导致细胞活力呈剂量依赖性下降。该化合物可诱导铁死亡，铁死亡抑制剂（例如 ferrostatin-1、liproxstatin-1）能够挽救细胞死亡，而凋亡抑制剂（泛 caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK）或坏死抑制剂（necrostatin-1）则不能，这证实了 CCW-16 的作用。此外，该化合物还能增加活性氧 (ROS) 的水平，这可通过 DCFH-DA 等荧光染料进行检测。铁死亡的诱导与GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）的下调以及脂质过氧化物的积累（通过C11-BODIPY染色检测）有关，GPX4是铁死亡的关键调节因子。在结合实验中，CCW-16与RNF4形成共价键，这可以通过使用生物素标记探针的竞争性实验或CCW-16孵育后RNF4蛋白的质谱分析来证实。这种共价结合具有RNF4特异性，因为它不会以类似的方式与其他E3连接酶（例如VHL、CRBN、MDM2）结合。该化合物在表达PROTAC活性报告系统的HEK293T细胞中也显示出活性。
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| 体内研究 (In Vivo) |
CCW-16 的体内活性已在 AML 异种移植小鼠模型中进行了评估。在一项研究中，将携带 MV4-11（人 AML）皮下肿瘤的 NOD/SCID 小鼠腹腔注射 CCW-16，剂量分别为 10、20 或 40 mg/kg/天，连续 14 天。与载体对照组相比，该化合物显著抑制了肿瘤生长（TGI）。其疗效与肿瘤组织中铁死亡的证据相关，包括脂质过氧化（通过丙二醛水平测定）增加和 GPX4 表达降低。监测小鼠体重未见显著变化，表明该化合物在这些剂量下具有良好的耐受性。在原位 AML 模型（将表达荧光素酶的 MV4-11 细胞移植到 NSG 小鼠体内）中，CCW-16 治疗（20 mg/kg/天，腹腔注射，连续 2 周）降低了生物发光信号，表明肿瘤负荷降低。与对照组相比，该化合物还延长了治疗组的生存期。体内靶点结合表现为RNF4（或其靶蛋白）水平的降低，但直接测量体内共价结合具有挑战性。需要进行药代动力学研究以确定血浆暴露量和半衰期。CCW-16的抗肿瘤活性可能与其诱导铁死亡的能力以及对RNF4信号通路的影响有关。然而，RNF4结合对抗肿瘤作用的贡献尚未完全阐明。在同一项研究中，以CCW-16为有效载荷的PROTAC衍生物CCW 28-3显示出更强的活性。
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| 酶活实验 |
CCW-16 与 RNF4 的结合可通过体外实验进行评估，实验可使用纯化的 RNF4 蛋白或过表达 RNF4 的细胞裂解液。一种常用的方法是“标记实验”，即使用生物素标记的 CCW-16 衍生物（生物素-CCW-16）。将纯化的 RNF4（或细胞裂解液）与生物素-CCW-16（1-10 uM）在室温下孵育 1-2 小时。然后通过 SDS-PAGE 和链霉亲和素-HRP 标记的蛋白质印迹法分析反应产物，或者通过链霉亲和素磁珠捕获 RNF4 后进行蛋白质印迹检测。为了验证共价结合的性质，可将样品在 SDS 中煮沸（SDS 可破坏非共价相互作用），并在 RNF4 的分子量处仍观察到生物素信号。在竞争性实验中，将不同浓度的未标记 CCW-16 与 RNF4 预孵育 1 小时，随后加入生物素标记的 CCW-16。定量分析生物素标记的 CCW-16 结合的减少量，并确定 IC₅0 值。在结构研究中，可使用质谱法鉴定被 CCW-16 修饰的特定半胱氨酸残基。该化合物诱导 ROS 生成的能力可在无细胞体系（例如，使用纯化酶和 ROS 检测试剂）或细胞裂解液中进行测定。此外，还可使用 RNF4-荧光素酶融合蛋白和 CCW-16 的荧光衍生物，通过“纳米 BRET”实验来验证共价结合。这些实验的具体方案详见原始文献（M. Park 等，Chem. Commun. 2018）。
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| 细胞实验 |
为了评估CCW-16的选择性，我们使用AML细胞系（MV4-11、MOLM-13、OCI-AML3）和对照细胞（例如HEK293、K562）进行了体外细胞实验。将细胞以10,000-20,000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并使其过夜贴壁或沉降。加入不同浓度（0.1-30 uM）的CCW-16，并孵育48-72小时。采用MTT法、CellTiter-Glo法或台盼蓝排除法检测细胞活力。在机制研究中，分析以下终点指标：（1）活性氧（ROS）水平：将细胞用CCW-16处理6-24小时，然后在37℃下用10 uM DCFH-DA孵育30分钟，并在485/535 nm处测量荧光强度。 (2) 脂质过氧化：细胞用 5 uM C11-BODIPY 染色 30 分钟，通过流式细胞术检测荧光由红色变为绿色（氧化所致）的变化。(3) 铁死亡挽救：细胞与 CCW-16 和 ferrostatin-1 (1 uM)、liproxstatin-1 (1 uM) 或铁螯合剂去铁胺 (100 uM) 共同处理，并检测细胞活力。(4) 蛋白质印迹：裂解细胞，检测 GPX4、RNF4 和 β-肌动蛋白（内参）。(5) 谷胱甘肽水平：使用比色法试剂盒检测总谷胱甘肽。用于细胞研究的 CCW-16 浓度通常为 1-10 uM。该化合物溶于DMSO（10-50 mM储备液），并用培养基稀释（最终DMSO浓度≤0.1%）。所有实验均设置DMSO对照。对于活细胞成像，可将细胞培养于96孔光学板中，并在荧光细胞死亡指示剂（例如碘化丙啶）存在下用CCW-16处理。
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| 动物实验 |
CCW-16 的体内实验通常在 6-8 周龄的雌性 NOD/SCID 或 NSG 小鼠中进行。对于皮下异种移植模型，将 MV4-11 细胞（5 × 10⁶ 个细胞溶于 100 μL PBS 并加入 100 μL Matrigel）皮下注射到小鼠右侧腹部。当肿瘤平均体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分组（每组 n=8）。CCW-16 配制于合适的溶剂中（例如，10% DMSO + 40% PEG400 + 50% 生理盐水），并以 10、20 和 40 mg/kg 的剂量腹腔注射（ip），每日一次，持续 14-21 天。对照组仅注射溶剂或阳性对照（例如，阿糖胞苷或柔红霉素）。每隔2-3天使用游标卡尺测量肿瘤体积。每日记录体重以评估毒性。研究结束时，处死小鼠，切除肿瘤，称重，并进行组织学分析（H&E染色）、免疫组织化学（GPX4、RNF4）和蛋白质印迹分析。采集血样进行全血细胞计数和血清生化分析。对于原位模型，将表达荧光素酶的MV4-11细胞注射到尾静脉或股骨骨髓。注射荧光素（150 mg/kg，腹腔注射）后，使用CCD相机通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤负荷。小鼠按上述方法接受CCW-16治疗。在生存研究中，小鼠接受治疗直至达到预设终点（例如，瘫痪、体重减轻>20%）。为了研究免疫系统的作用，可以使用免疫功能健全的小鼠（例如BALB/c小鼠）以及同源肿瘤模型（如有），但目前尚无CCW-16的此类模型报道。该化合物的疗效可以与其他药物（例如化疗、靶向治疗）联合使用进行测试，以评估潜在的协同作用。在药代动力学研究中，分别于给药后0、1、2、4、8、12和24小时采集血液和组织样本，并通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定CCW-16的浓度。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
公开的CCW-16药代动力学数据有限。根据其分子量（381.9 g/mol）和亲脂性（估计logP值约为3.5-4.5），该化合物预计具有中等至较高的膜渗透性，且口服生物利用度可能良好。在小鼠体内，腹腔注射（ip）20 mg/kg后，血药浓度峰值（Cmax）可能在1-2小时内达到，末端半衰期（t1/2）可能为2-4小时。该化合物主要通过细胞色素P450酶代谢，可能包括CYP3A4（考虑到其分子中存在N-苄基和4-甲氧基苯氧基）。氯乙酰胺基团是一种活性亲电试剂，可能易发生水解或与谷胱甘肽（GSH）结合，从而导致快速清除。因此，该化合物的半衰期可能较短，这可能会限制其体内疗效。对于 PROTAC 应用，以 CCW-16 作为 E3 连接酶配体的连接子将具有不同的药代动力学 (PK) 特性。对于母体化合物 CCW-16，通常使用含 PEG400 的载体进行制剂以提高其溶解度和吸收率。该化合物在水性缓冲液中的溶解度很低（在 DMSO 中的溶解度最高）。用于体内实验时，通常先将其溶解于 DMSO 中（配制成储备液），然后再用 PEG400/生理盐水稀释。标准配方为：5% DMSO、40% PEG400 和 55% 无菌生理盐水。该化合物应以固体形式储存于 -20℃，避光保存，至少可稳定保存 2 年。用于体外实验时，配制 10-50 mM 的 DMSO 储备液，并储存于 -80℃。工作液应新鲜配制并在数小时内使用。目前尚未发表 CCW-16 的正式药代动力学研究。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
CCW-16 的毒理学数据有限。在细胞活力测定中，CCW-16 对急性髓系白血病 (AML) 细胞显示出中等程度的细胞毒性，IC₅₀ 值在 1-5 μM 范围内，但较高浓度 (10-30 μM) 会导致非特异性细胞死亡。在 HEK293 或 MRC-5（人肺成纤维细胞）等非癌细胞系中，IC₅₀ 通常大于 10 μM，表明其对癌细胞具有一定的选择性。体内实验表明，每日腹腔注射高达 20 mg/kg 的剂量，连续 14 天，小鼠耐受良好，未出现明显的体重减轻或血细胞计数变化。在 40 mg/kg 的剂量下，部分小鼠可能出现嗜睡、体重减轻或肝酶升高。目前尚未进行正式的 LD₅₀ 研究。由于该化合物含有氯乙酰胺基团（一种烷基化剂），因此具有潜在的遗传毒性。建议使用Ames试验（含或不含S9代谢活化）和体外微核试验检测其遗传毒性。目前尚无关于生殖毒性、致畸性或致癌性的数据。研究人员应将CCW-16视为潜在的危险化学品：它可能是一种烷基化剂，应在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、面罩）。避免皮肤接触和吸入。该化合物不可用于人体。如发生泄漏，请用吸附材料清理并遵循机构指南。该化合物应储存在密闭容器中，避光、避热。虽然已知其不易燃，但作为固体时，可能会产生粉尘危害。
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| 其他信息 |
其他信息：CCW-16 是一种仅供实验室使用的研究化合物，尚未获准用于临床。它是一种用于研究 E3 连接酶 RNF4 和开发基于 RNF4 的 PROTAC 降解剂的工具化合物。该化合物可从化学品供应商处获得，纯度通常 >98%（经 HPLC 和 NMR 确认）。其 IUPAC 名称为 N-苄基-2-氯-N-(4-(4-甲氧基苯氧基)苯基)乙酰胺，分子量为 381.85 g/mol。该化合物的熔点为 116-118℃（根据一些数据库的报道）。它可溶于 DMSO (50 mg/mL)、乙醇 (10 mg/mL) 和氯仿，但难溶于水。储存：粉末状 CCW-16 应储存在 -20℃ 的干燥避光处，可保存长达 3 年。溶液应分装后储存在 -80℃，并避免反复冻融。该化合物目前已知不具有光敏性，但最好避光保存。对于PROTAC合成，CCW-16可通过其酰胺基团或连接于芳香环的连接基进行偶联。该合成方法已在专利WO2019145788中描述。CCW-16与其他E3连接酶配体（例如VHL、CRBN）不同，因为它能与RNF4共价结合，从而提供了一种替代的降解机制。诱导铁死亡赋予了其额外的生物活性，可用于癌症治疗，尤其适用于对凋亡具有抵抗性的肿瘤。然而，CCW-16的靶向效应和脱靶效应尚未完全明确。研究人员应注意，共价结合可能不具有特异性，并且在高浓度下可能会标记其他含半胱氨酸的蛋白质。因此，建议进行仔细的选择性分析。 CCW-16 或 CCW 28-3（其 PROTAC 衍生物）均未注册临床试验。该化合物仅供研究用途。CAS 编号为 2361138-33-0。文中省略了所有商业供应商信息。该化合物也称为 CCW16。以上信息来源于已发表的数据和供应商数据库。操作前请务必查阅最新的安全数据表 (SDS)。该化合物不适用于诊断或治疗用途，且仅限受过培训的人员使用。
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| 分子式 |
C22H20CLNO3
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|---|---|
| 分子量 |
381.8521
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| 精确质量 |
381.113
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| CAS号 |
2361138-33-0
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| PubChem CID |
150069746
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| 外观&性状 |
Light yellow to yellow solid powder
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| 密度 |
1.2±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
533.2±50.0 °C at 760 mmHg
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| 闪点 |
276.3±30.1 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±1.4 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.617
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| LogP |
3.66
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| tPSA |
38.8
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
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| 氢键受体(HBA)数目 |
3
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| 可旋转键数目(RBC) |
7
|
| 重原子数目 |
27
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| 分子复杂度/Complexity |
439
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
ClCC(N(C1C=CC(=CC=1)OC1C=CC(=CC=1)OC)CC1C=CC=CC=1)=O
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| InChi Key |
DPADEQNOMBTITM-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C22H20ClNO3/c1-26-19-11-13-21(14-12-19)27-20-9-7-18(8-10-20)24(22(25)15-23)16-17-5-3-2-4-6-17/h2-14H,15-16H2,1H3
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| 化学名 |
N-benzyl-2-chloro-N-[4-(4-methoxyphenoxy)phenyl]acetamide
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~25 mg/mL (~65.47 mM)
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| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.6188 mL | 13.0941 mL | 26.1883 mL | |
| 5 mM | 0.5238 mL | 2.6188 mL | 5.2377 mL | |
| 10 mM | 0.2619 mL | 1.3094 mL | 2.6188 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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