SETD2 (IC50=18 nM)

EZM0414 抑制一组 MM 和 DLBCL 细胞系，t(4;14) 细胞的 IC50 为 0.24 μM，DLBCL 细胞系的 IC50 为 0.023 μM->10 μM [2]。
EZM0414对SETD2的抑制在MM和DLBCL细胞系中产生了有效的抗增殖作用。EZM0414对t（4;14）和非t(4;14) MM细胞系的增殖均有抑制作用，在MM细胞系的t（4;14）亚群中普遍观察到较高的抑制增殖活性。EZM0414在t（4;14）细胞系中的IC 50中值为0.24 μM，而在非t（4;14）细胞系中为1.2 μM。此外，对DLBCL细胞株的生长抑制作用表现出广泛的敏感性，ic50值从0.023 μM到bbb10 μM。[2]

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在由47个靶点和72个激酶组成的安全面板中，EZM0414的体外测试显示，除D2 （IC50 = 13.0 μM，拮抗剂）和5-HT1B （IC50 = 3.2 μM，激动剂）外，所有靶点的IC50都在25 μM左右。［3］

在植入人 KMS-11 细胞的 NOD SCID 小鼠异种移植模型中，EZM0414（15 和 30 mg/kg，口服，BID，每日）可抑制肿瘤生长，且耐受性良好 [3]。在大鼠和小鼠中，EZM0414（50 mg/kg，口服）的口服生物利用度接近 100%，小鼠的 t1/2 值为 1.8 小时，大鼠为 3.8 小时 [3]。

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在3个MM和4个DLBCL细胞系来源的异种移植模型中，与对照相比，EZM0414具有统计学上显著的抗肿瘤活性。在t(4;14) MM细胞系衍生的异种移植物模型KMS-11中，在前两个剂量下观察到强劲的肿瘤生长回归，最大TGI为95%。此外，两个非t(4;14) MM （RPMI-8226， MM. 1s）和两个DLBCL异种移植模型（TMD8, KARPAS422）显示> 75% TGI；另外两种DLBCL模型（WSU-DLCL2, SU-DHL-10）对EZM0414的反应显示出50%的TGI。在所有测试的模型中，观察到的抗肿瘤作用与肿瘤内H3K36me3水平的降低相关，表明体内SETD2甲基转移酶活性的靶向抑制。[2]

SETD2（1434-1711）测定[3]
生化试验监测了s -腺苷-蛋氨酸（SAM）的氚化甲基与残基26-40对应的生物素化组蛋白3肽的结合。底物肽的序列为biotin- ahx - rksapatggvkkkphr - nh2和3H-SAM，购自American radiollabelled Chemicals， Inc.。在384孔分析板上，将40L酶与1L化合物或DMSO孵育30分钟，然后与10L底物溶液开始反应。实验在室温下进行，实验缓冲液由25 mM比辛，pH 8.0, 7.5 mM-巯基乙醇，0.002%吐温-20和0.01%牛皮肤明胶（BSG）组成。在产物形成的线性部分，用10L的1 mM s -腺苷-同型半胱氨酸（SAH）和1 mM SAM来淬灭反应。从淬火反应中，将50L转移到链霉亲和素涂覆的闪光板 上，孵育至少2h，然后用0.1% Tween-20洗涤一次。链霉亲和素包被板捕获的3h标记肽的信号通过Topcount板读取器计数。抑制百分比（%I）和IC50值分别由式1和式2计算。%𝐼=(1−(𝑆−𝑚𝑖𝑛𝑚𝑎𝑥−𝑚𝑖𝑛))(eq - 1) %𝐼=(100−𝑏𝑜𝑡𝑡𝑜𝑚)(1 +(𝐼𝐶50𝐼)𝑛)+𝑏𝑜𝑡𝑡𝑜𝑚(eq 2)分钟的信号完全抑制SETD2从井20嗯SAH的最终浓度和最大的信号从井DMSO而不是化合物。计算IC50时，bottom为理论最小%I， I为缓蚀剂浓度，n为Hill斜率。化合物IC50的测定是通过测试10个浓度的化合物，将其稀释3倍，最终浓度为4 nM酶和底物浓度等于0.7M肽和2M SAM的KM值。

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筛选方法：[3]
384孔源板中的EZM0414 （10 nL）直接加入到包被聚d -赖氨酸（PDL）的384孔培养板中。将A549细胞接种于浓度为80000细胞/ mL的实验培养基中，并添加到PDL包被板上，每孔体积为50µL。将培养皿放在实验台上约20分钟，使细胞在孔底沉淀。37℃，5% CO2孵育3天。三天后，将培养皿从培养箱中取出，让培养皿达到室温。将培养基从板中吸出，每孔加50µL的100%甲醇，孵育30分钟。用抽吸法去除甲醇，每孔115µL洗涤缓冲液（1X PBS加0.05%吐温-20 (v/v)）洗涤3次。接下来，每孔加入50µL奥德赛阻断缓冲液+ 0.1%吐温-20，在室温下孵育1小时。去除阻断缓冲液，洗涤3次，每孔加入20µL一抗（抗组蛋白H3三甲基K36在奥德赛缓冲液中以0.1%吐温-20 （v/v）稀释1:1000），在4°C下孵育过夜（16小时）。每孔115µL洗涤缓冲液（1X PBS加0.05% Tween-20 (v/v)）洗涤5次。每孔加入20µL二抗（1:500 800CW山羊抗兔IgG （H+L）抗体，1:1000 DRAQ5在含0.1%吐温-20 （v/v）的Odyssey缓冲液中），室温孵育1小时。用每孔115µL的缓冲液（1X PBS，含0.05%吐温-20 (v/v)）洗涤5次，然后用每孔115µL的水洗涤3次。冲洗后，将平板倒置在薄的纸巾床上离心1分钟，转速高达1000 rpm，以去除多余的试剂，然后在室温下干燥，避免直接暴露在光线下。在Licor Odyssey系统上对底片成像，该系统测量700 nm和800 nm波长的综合强度。

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为了抑制CYP1A2，在上述溶液中加入1 μL终浓度为40 μM的特异性药物底物（非那西丁：8 mM）。为了抑制CYP2B6，在上述溶液中加入1 μL的特异性药物底物（安非他酮：10 mM），终浓度为50 μM。为了抑制CYP2C8，在上述溶液中加入1 μL的特异性药物底物（紫杉醇：1 mM），终浓度为5 μM。为了抑制CYP2C9，在上述溶液中加入1 μL终浓度为200 μM的特异性药物底物（Tolbutamide: 40 mM）。为了抑制CYP2C19，在上述溶液中加入1 μL的特异性药物底物（(s)-甲苯妥英：10 mM），终浓度为50 μM。为了抑制CYP2D6，在上述溶液中加入1 μL的特异性药物底物（右美沙芬：2 mM），终浓度为10 μM。为了抑制CYP3A4，在上述溶液中加入1 μL的特异性药物底物（咪达唑仑：1 mM），最终浓度为5 μM。37℃预热5 min，加入终浓度为1 mM的10 mM NADPH溶液20 μL， 37℃开始反应。在指定时间点加入400 μL冷淬溶液（甲醇含内标物[IS: 100 nM阿普唑仑，500 nM拉贝他洛尔，2 μM酮洛芬]）停止反应(非那西丁：20 min；安非他酮：20分钟；紫杉醇：10分钟；甲苯磺丁胺：20分钟；(s)-甲苯妥英：20分钟；右美沙芬：20分钟；咪达唑仑：5分钟)。样品涡旋5分钟，4℃下3220 g离心40分钟。然后将100 μL上清液转移到加100 μL水的96孔板上（取决于LC-MS信号响应和峰形），进行LC-MS/MS分析。所有的实验都是重复进行的。［3］

细胞增殖试验测定EZM0414在MM和DLBCL细胞系组中的ic50值。研究人员对EZM0414的肿瘤生长抑制（TGI）作用进行了评估。western blot检测H3K36me3水平，评价靶接合性。在7天的体外细胞实验中，评估了MM和DLBCL标准护理（SOC）药物联合抑制SETD2的潜力。[2]

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以0.5 × 10-3 ~ 10 μmol/L的浓度依赖性处理对数生长期细胞系，最终DMSO浓度为0.2%体积/体积（v/v）。细胞以确定的（1.25 × 105个细胞/mL）电镀密度，一式三份，在96孔板上镀。实验板在37°C 5% CO2的湿化气氛中孵育。每隔3-4天，用钙素AM测定活细胞数，并在Acumen高含量成像仪上进行分析。细胞计数后，将细胞分裂回原电镀密度，更换生长培养基和化合物。用第14天的最终分裂调整活细胞数/mL计算抑制率。技术重复的抑制百分比平均值用于绘制浓度响应曲线，并计算每个时间点的绝对半最大抑制浓度（IC50）值。计算第4、7、11和14天的生长情况：1。计算第4 - 7天、第7 - 11天和第11-14天的分裂因子。分裂因子是第X天（4、7或11天）的活细胞/mL除以细胞被分裂回2的密度。对于第4天至第7天的细胞生长，将第7天的活细胞/mL密度乘以第4天的分裂因子。2. 对于第7天至第11天的细胞生长，将第11天的活细胞/mL密度乘以第4天和7个分裂因子。3. 对于第11天至第14天的细胞生长，将第14天的活细胞/mL密度乘以第4,7和11天的分裂因子。5. 在半对数图上绘制生长（Y轴为活细胞/mL，对数，X轴为天数）。［3］

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以浓度依赖性浓度0.5 × 10-3 ~ 10 μmol/L的EZM0414处理对数相细胞系，最终DMSO浓度为0.2% v/v。将细胞以确定的镀密度在96孔板（1.25 × 105细胞/mL）中镀三次（用于第0 - 7天的疗程）或在6孔板（3.75 × 105细胞/mL）中镀（用于第7天的剩余时间的疗程）。实验板在37°C 5% CO2的湿化气氛中孵育。在第0、4、7天读取培养皿，在第4天补充化合物/培养基。第7天，将6孔板胰蛋白酶化，离心，重新悬浮在新鲜培养基中进行Vi-CELL计数。每个处理的细胞以原始密度重新镀于96孔板，一式三份，并以相同的化合物浓度重新处理。在第7天（播种第7天的另一个基线读数）、第11天和第14天读取培养皿，在第11天补充化合物/培养基。通过使用CellTiter-Glo®进行发光细胞活力测定，通过测量细胞腺苷-5 ' -三磷酸（ATP）来定量增殖，使用EnSpire多模微孔板阅读器检测发光。第14天的最终原始发光值用于计算抑制率。用技术重复的抑制百分比平均值绘制浓度响应曲线，并计算每个时间点的绝对IC50值。[3]

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从培养箱中取出Caco-2板，用预温HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）洗涤2次，然后在37°C下孵育30分钟。对照化合物原液用DMSO稀释得到1 mM溶液，再用HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）稀释得到5 μM工作溶液。实验化合物的原液在DMSO中稀释得到1 mM溶液，然后用辅助信息稀释得到5 μM工作溶液。构像设计驱动发现EZM0414：一种选择性的、有效的SETD2抑制剂，用于临床研究SI-47 HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）。培养体系中DMSO的终浓度为0.5%。测定药物在根尖向基底外侧方向的转运速率。在Transwell插入物（顶端室）中加入75 μL的受试化合物和对照化合物的工作溶液，在接收板（基底外侧室）孔中填充235 μL的HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）。为测定药物在基底外侧至根尖方向的转运速率，将受试化合物和对照化合物的工作溶液分别取235 μL滴入受检板孔（基底外侧室），然后在Transwell插入物（根尖室）中填充75 μL HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）。在新的96孔板上，将10 μL工作溶液转移到40 μL HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）上，然后加入200 μL含有适当内标（IS）的冷乙腈或甲醇，制备Time 0样品。37℃孵育2小时。孵育结束时，将10 μL供体侧（A→B通量的根尖室，B→A的基底侧室）至40 μL HBSS （10 mM HEPES, pH 7.4）和50 μL受体侧（A→B通量的根尖室，B→A的根尖室）的样品转移到新的96孔板的孔中，然后加入4体积含有适当内标（IS）的冷乙腈或甲醇。样品涡旋5分钟，然后3220 g离心40分钟。在LC-MS/MS分析前，取上清液100µL与适当体积的超纯水混合。[3]

药代动力学[3]
研究设计：对动物进行单次静脉注射（IV）给药。同时，对禁食动物进行口服（PO）给药。在指定时间点，通过小鼠背侧跖静脉采集血液。将血液转移至含有K2-EDTA的采血管中。用于血浆分析的血液立即经离心处理以分离血浆，并储存在设定温度约为-80℃的冰箱中，直至分析。

样品制备：通过将待测物的储备液（1 mg/mL，溶于DMSO）用50%乙腈水溶液稀释，制备所需浓度范围的工作溶液。取10 μL工作溶液加入10 μL空白动物血浆中，配制浓度为0.5-1000 ng/mL的校准标准溶液，总体积为20 μL。将所得 20 µL 标准样品加入 200 μL 乙腈中进行蛋白质沉淀。所有样品均涡旋振荡 30 秒。在 4°C 和 4000 rpm（约 3740 xg）下离心 15 分钟后，取上清液并用水稀释。

分析方法：采用反相液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 测定提取样品中的浓度。使用电喷雾电离 (ESI) 正离子模式下的多反应监测 (MRM) 监测分析物。峰面积由 Analyst® 软件积分，浓度通过峰面积比值（分析物峰面积/内标峰面积）与血浆校准标准品的理论浓度进行加权 (1/x2) 线性或二次回归确定。

药代动力学分析：采用非房室模型方法，使用线性/对数梯形法（静脉给药）或线性上升/对数下降梯形法（口服给药）（Phoenix WinNonlin 6.1，Certara，Princeton，NJ）分析小鼠的个体血浆浓度-时间数据。静脉给药后，计算清除率（CL）、稳态分布容积（Vss）、末端消除半衰期（t½）、曲线下面积（AUCINF）、平均共振时间（MRTINF）和末端分布容积（Vz）。口服给药后，计算最大观测浓度（Cmax）、达峰时间（tmax）、末端消除半衰期（t½）、曲线下面积（AUCINF）、平均共振时间（MRTINF）、表观总清除率（CL/F）、生物利用度（%F）和估计吸收分数（Fa）。 [3]

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小鼠体内疗效分析 在研究开始前，动物被隔离7天。当平均肿瘤体积达到约119 mm³时，开始进行疗效研究的治疗。根据肿瘤体积，将小鼠随机分组，使各组的平均初始肿瘤体积相同。将溶于甲基纤维素/吐温-80水溶液（0.5% CMC/0.1% Tween-80 (Sigma-Aldrich)）的EZM0414或仅含溶剂的EZM0414灌胃给NOD SCID小鼠（每剂量组n = 10）。[3]
对所有研究动物进行监测，不仅观察肿瘤生长情况，还观察其行为，例如活动能力、食物和水的消耗量、体重、眼/毛缠结情况以及任何其他异常反应。在整个疗效研究期间，每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积，并使用公式“肿瘤体积 = ax² + b²/2”估算肿瘤体积（mm³），其中“a”和“b”分别为肿瘤的长径和短径。肿瘤体积用于计算肿瘤生长抑制率（TGI，一种抗肿瘤疗效指标），计算公式为：TGI = (1-T/C) × 100%，其中“T”和“C”分别为肿瘤接种后某一天治疗组（T）和对照组（C）肿瘤的平均相对体积（肿瘤生长）。

在小鼠中，EZM0414 和类似物 7 在 50 mg/kg 口服给药后均表现出良好的药代动力学特征，但 EZM0414 的暴露量（AUC）约为 7 的 2 倍，且口服生物利用度 (F) 也更高，这一趋势在大鼠中也观察到。表 3 列出了 EZM0414、7 和起始母体化合物 3 的药代动力学参数比较。早期系列化合物亲脂性的提高显著改善了整体药代动力学特征，在 CD-1 小鼠中，EZM0414 口服 50 mg/kg 后，其总体暴露量 (AUC0–∞) 提高了 17 倍。就药物相互作用作为CYP酶抑制剂的可能性而言，EZM0414仅对CYP同工酶2C8表现出较弱的抑制作用（4.8 μM），而对其他受试同工酶则未观察到抑制作用（同工酶1A2、2B6、2C9、2C19、2D6和3A4的IC50均>30 μM）。类似物7对同工酶2B6（3.2 μM）和2D6（10.8 μM）表现出中等程度的抑制作用，而对其余受试同工酶的IC50均>25 μM。对EZM0414的进一步表征表明其具有良好的安全性药理学特征。在由 47 个靶点组成的安全性小组和由 72 个激酶组成的多样性小组中对 EZM0414 进行体外测试，结果显示，除 D2（IC50 = 13.0 μM，拮抗剂）和 5-HT1B（IC50 = 3.2 μM，激动剂）外，所有靶点的 IC50 > 25 μM。[3]

[1]. Pharmacologic Inhibition of the Histone Methyltransferase SETD2 with EZM0414 As a Novel Therapeutic Strategy in Relapsed or Refractory Multiple Myeloma and Diffuse Large B-cell Lymphoma.

[2]. Pharmacologic Inhibition of the Histone Methyltransferase SETD2 with EZM0414 As a Novel Therapeutic Strategy in Relapsed or Refractory Multiple Myeloma and Diffuse Large B-Cell Lymphoma. Blood. Volume 138, Supplement 1, 23 November 2021, Page 1142.

[3]. Conformational-Design-Driven Discovery of EZM0414: A Selective, Potent SETD2 Inhibitor for Clinical Studies. ACS Med Chem Lett. 2022 Jun 7;13(7):1137-1143.

SETD2抑制剂EZM0414是一种口服生物利用度高的选择性组蛋白甲基转移酶（HMT）SETD2（SET结构域蛋白2，组蛋白赖氨酸甲基转移酶）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，SETD2抑制剂EZM0414与SETD2结合并抑制其活性。这会阻止SETD2介导的多个关键生物学过程，包括组蛋白和非组蛋白的甲基化、转录调控、RNA剪接、DNA损伤修复以及B细胞的发育和成熟。EZM0414对SETD2的抑制可能抑制肿瘤细胞增殖。SETD2在肿瘤发生中发挥着多种重要作用。

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引言：SETD2是目前已知唯一能够在体内催化H3K36三甲基化（H3K36me3）的组蛋白甲基转移酶（HMT）。 SETD2在多种生物学过程中发挥重要作用，包括B细胞的发育和成熟，由此推测，在这些过程中抑制SETD2可能具有抗肿瘤作用。B细胞的正常发育/成熟过程使其易受遗传脆弱性的影响，从而导致表观基因组失调和肿瘤发生，例如多发性骨髓瘤（MM）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。例如，15%-20%的MM携带高风险的t(4;14)染色体易位，导致多发性骨髓瘤SET结构域（MMSET）基因高表达。MMSET是一种组蛋白甲基转移酶（HMT），可催化H3K36me1和H3K36me2的形成，大量科学研究已证实MMSET过表达是t(4;14)骨髓瘤发病机制的关键因素。据我们所知，MMSET 一直是药物研发的靶点。然而，由于 t(4;14) 易位导致 SETD2 底物 H3K36me2 水平升高，抑制 SETD2 有望成为靶向 t(4;14) 多发性骨髓瘤 (MM) 患者中由 MMSET 过表达驱动的潜在致癌机制的有效手段。此外，迄今为止在白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 中发现的 SETD2 功能缺失突变均为杂合突变，提示 SETD2 可能具有单倍体不足的抑癌作用。这一观察结果表明 SETD2 在白血病和淋巴瘤的生物学特性中发挥着关键作用，并提示 SETD2 抑制剂在这些或类似疾病中也可能具有治疗潜力。EZM0414 是一种首创的、高效、选择性强、口服生物利用度高的 SETD2 小分子酶抑制剂。我们利用 EZM0414 在多发性骨髓瘤 (MM) 和弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 的临床前研究中探索了 SETD2 抑制剂的抗肿瘤作用，以验证其作为这些肿瘤类型治疗药物的潜力。[2]

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在体外和体内临床前研究中，使用小分子抑制剂靶向 SETD2 可显著抑制 t(4;14) MM 以及非 t(4;14) MM 和 DLBCL 细胞系的生长。此外，体外实验观察到 EZM0414 与某些 MM 和 DLBCL 常用的标准治疗药物 (SOC) 具有协同作用，这支持将 SETD2 抑制剂与目前的 MM 和 DLBCL 疗法联合使用。这项工作为靶向治疗 B 细胞恶性肿瘤（如 MM，特别是 t(4;14) MM）以及 DLBCL 中的 SETD2 提供了理论依据，并为开展 1/1b 期临床研究以评估 EZM0414 在 R/R MM 和 DLBCL 患者中的安全性和活性奠定了基础。[2]

C22H29FN4O2

400.49

428.26

C, 67.26; H, 7.76; F, 4.43; N, 13.07; O, 7.47

2411748-50-8

EZM0414 TFA;2411759-92-5

146395245

Off-white to light yellow solid powder

2.8

68.4 Ų

2

4

3

29

610

2

C1C=C(C2NC(=CC=2C=1F)C(N[C@@H]1CCC[C@H](N2CCN(CC2)C(=O)C)C1)=O)C

PGNLXEBQMQHFNK-SJORKVTESA-N

InChI=1S/C22H29FN4O2/c1-14-6-7-19(23)18-13-20(25-21(14)18)22(29)24-16-4-3-5-17(12-16)27-10-8-26(9-11-27)15(2)28/h6-7,13,16-17,25H,3-5,8-12H2,1-2H3,(H,24,29)/t16-,17+/m1/s1

N-[(1R,3S)-3-(4-acetylpiperazin-1-yl)cyclohexyl]-4-fluoro-7-methyl-1H-indole-2-carboxamide

EZM0414 HCl; EZM-0414 HCl 2411748-50-8; KCY37T9RXU; EZM-0414; UNII-KCY37T9RXU; N-[(1R,3S)-3-(4-acetylpiperazin-1-yl)cyclohexyl]-4-fluoro-7-methyl-1H-indole-2-carboxamide; N-((1R,3S)-3-(4-Acetylpiperazin-1-yl)cyclohexyl)-4-fluoro-7-methyl-1H-indole-2-carboxamide; 1H-Indole-2-carboxamide, N-((1R,3S)-3-(4-acetyl-1-piperazinyl)cyclohexyl)-4-fluoro-7-methyl-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。