Fluo-3AM   中文名称: 钙荧光探针 Fluo 3-AM

Fluorecent dye/Ca2+ chelator

1. Fluo-3 AM工作液配制方法
1.1 储存液制备
使用无水DMSO溶解Fluo-3 AM粉末，配制浓度为10 mM的母液。
注意：配制好的储存液需分装后置于-20℃或-80℃环境避光保存。
1.2 工作液配制
将预热的HBSS缓冲液与储存液混合稀释，最终获得1-10 μM浓度的工作液。
注意：工作液浓度需根据实验需求调整，且需在使用前新鲜配制。

2. 悬浮细胞染色步骤
2.1 离心收集细胞，用PBS缓冲液清洗两次（每次5分钟），调整细胞密度至1×10⁶/mL
2.2 加入1 mL工作液，室温避光孵育5-30分钟
2.3 400 g离心3-4分钟去除上清液
2.4 再次用PBS清洗细胞两次（每次5分钟）
2.5 使用1 mL HBSS重悬细胞后，立即进行荧光显微镜或流式细胞检测

3. 贴壁细胞染色流程
3.1 预先将细胞培养在无菌盖玻片上
3.2 取出盖玻片，吸除表面残留培养基
3.3 加入100 μL工作液（确保完全覆盖细胞层），孵育5-30分钟
3.4 移除染液后，用新鲜培养基洗涤2-3次（每次5分钟），随后进行荧光显微镜观察

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在两种不同的情况下，使用共聚焦荧光显微镜测定Fluo-3的Ca（2+）解离常数（K（d））：（i）在透性心肌细胞的细胞质内；以及（ii）在与乙酰氧基甲酯形式的Fluo-3 (AM)孵育后，在完整的心肌细胞中。在用β-七叶皂苷（0.1mg/ml）短暂处理并用10μM Fluo-3平衡后，对分离的兔心室心肌细胞进行了透性测量。Fluo-3在细胞质中的K（d）与在游离溶液中的没有显著差异（558+/-15nM，n=6）。在细胞质[Ca（2+）]的范围内，尽管波频率发生了变化，但Ca（2+）波之间的最小[Ca（2+）]值相对恒定。通过与-AM一起孵育，用Fluo-3加载完整的心肌细胞后，用strophathidin（10微摩）孵育产生自发的Ca（2+）波。通过假设透性和完整细胞中的共同最小[Ca（2+）]，完整肌细胞中Fluo-3的细胞内K（d）估计为898+/-64nM（n=6）。将K（d）应用于荧光记录表明，完整细胞中的Ca（2+）波的振幅与渗透细胞中的振幅相似。在没有毒毛汉苷（室温）的情况下，以0.5 Hz的频率刺激心肌细胞，导致Ca（2+）瞬变，最大和最小[Ca（2+）]分别为1190+/-200和158+/-30 nM（n=11）[1]。

在透性细胞内产生自发Ca2+波的解决方案[1]
用以下成分（mM）的模拟细胞内溶液灌注可渗透细胞：100 KCl、5 Na2ATP、10 Na2CrP、5.5 MgCl2、25 HEPES、0.05 K2EGTA，pH 7.0（20-21°C）。通过添加已知量的1M CaCl2储备溶液（BDH）来改变灌注溶液中的[Ca2+]。使用计算机程序（React，GLSmith）计算这些溶液中[Ca2+]的估计值。例如，在没有添加Ca2+的情况下，假设有约5μM的污染，50μM EGTA中的游离Ca2+约为40 nM。添加Ca2+以达到约15μM的总[Ca2+]会产生约150 nM的游离[Ca2+]。进一步添加Ca2+以达到总共25μM，会产生约300 nM的游离[Ca2+]。向溶液中加入荧光Ca2+指示剂Fluo-3 (AM)或Fluo-5F，使其标称终浓度为10μM。

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2.3.完整细胞内自发Ca2+波产生的解决方案[1]
用改良的克雷布斯溶液灌注完整的细胞，其成分（mM）如下：140 NaCl、4 KCl、1 MgCl2、5 HEPES、11.1葡萄糖、0.3 NaH2PO4·2H2O、0.01 Strophantidin，pH 7.4（20-21°C）。通过加入已知量的1M CaCl2储备溶液（BDH），灌注溶液中的[Ca2+]发生了变化（0.1-1mM）。用于获得最大荧光读数的溶液，其中指示染料被Ca2+（Fmax）饱和，含有上述溶液，其中添加了0.02mM离子霉素和20mM的增加[Ca2+]。 为了用Fluo-3 (AM)（乙酰氧基甲酯形式）装载细胞，将心肌细胞在37°C下在20μMFluo-3（AM）中孵育10分钟。将细胞离心（5×g，15 s），以所需的细胞浓度重新悬浮在改良的Krebs溶液中，并在使用前静置20分钟。在电刺激实验中使用的灌注溶液是之前描述的添加了1.8 mM CaCl2（不含毒毛旋花子苷）的改良Krebs。

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游离溶液和透性心肌细胞中的激光扫描共聚焦Fluo-3荧光测量[1]
基于前面描述的模拟细胞内溶液，使用一系列Ca2+缓冲溶液（10mM EGTA）测量Fluo-3和Fluo-5在游离溶液中的Ca2+敏感性。使用计算机程序计算校准溶液中金属离子的平衡浓度，该程序具有EGTA和ATP和CrP对H+、Ca2+和Mg2+的已知亲和力常数。离子强度的校正、pH值测量的细节、EGTA纯度的容差和计算原理在其他地方有详细说明。

Fluo-3在透性心肌细胞中的行为是通过在心肌细胞内和邻近心肌细胞的灌注溶液中从6μm（x）乘0.5μm（y）乘0.9μm（z）体积（20像素）同时进行荧光测量来建立的。在这些校准实验中，预先用thapsigargin（Calbiochem，10μM，20分钟）处理可抑制SR Ca2+摄取。这些同步测量也用于检查细胞内与细胞外[Ca2+]相关的Ca2+波，但这些细胞中没有添加thapsigargin。使用BioRad Radiance 2000共聚焦系统记录共聚焦线扫描图像。灌注溶液中的Fluo-3（或Fluo-5F）在488nm处激发，并在500nm以上（HQ500LP发射滤光片）使用尼康Eclipse倒置显微镜的落射荧光光学元件和Fluor 60×水物镜（Plan Apochromat NA 1.2）进行测量。3 mW Kr激光器的功率设置为12%，光电倍增管（PMT）的增益设置为25%。虹膜直径设置为1.9，基于0.1μm荧光珠图像的全宽半最大振幅测量，提供约0.9μm的轴向（z）分辨率和约0.5μm的x-y分辨率。数据以2ms/行的行扫描模式采集；像素尺寸为0.3μm（512像素/扫描；变焦=1.4）。扫描激光线与细胞长轴平行，放置在细胞外边缘和细胞核之间大致等距的位置，以确保核区域不包括在扫描线中。LaserScan软件将数据保存为一系列图像文件，每个文件包含30000行扫描（即1分钟的连续记录）。实验记录通常包括4-5行扫描图像文件；离线审查这些，并根据大多数Ca2+波中的最早事件选择单个细胞内区域（20像素宽）。这确保了[Ca2+]增加后的任何运动伪影都不会影响峰值[Ca2+].的估计。使用相同的方法记录和分析完整细胞内Ca2+波和刺激瞬变的数据。细胞自发荧光值（Fca）是通过测量未负载Fluo-3或浸泡在荧光溶液中的心肌细胞的固有荧光获得的。将心肌细胞（无论是完整的还是透性的）浸泡在低（<50 nM）Ca2+溶液中，并使用与进行实验测量相同的激光功率和PMT增益设置进行成像。从荧光测量值中减去平均自发荧光值，以获得Fluo-3/Fluo-5F相关荧光的准确值（完整细胞平均Fca=9.8±0.49（n=4），透化细胞平均Fca=5.29±0.43（n=6），细胞外Fca=3.56±0.21（n=6)。

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说明：Fluo-3AM是一种具有绿色荧光的钙指示剂，可用于钙通量分析。
方法：用于钙通量分析。
1.用Fluo-3AM（4µM；37°C；黑暗）孵育培养的细胞。
2.洗涤细胞3次，重新悬浮在不含Ca2+和Mg2+的Hank's平衡盐溶液中。
3.使用异硫氰酸荧光素（FITC）通道评估Fluo-3AM荧光，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察荧光图像。

[1]. Measurement of the dissociation constant of Fluo-3 for Ca2+ in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca2+ wave characteristics. Cell Calcium. 2003 Jul;34(1):1-9.

The purpose of this study was to establish the intracellular Kd of the commonly used Ca2+ indicator Fluo-3 (AM) in cardiomyocytes and compare the Ca2+ wave characteristics in permeabilised and intact cells. This paper shows that the permeabilised cardiomyocyte can be used as a simplified system allowing accurate indicator calibration and therefore measurement of cytosolic [Ca2+] during Ca2+ wave activity and stimulated Ca2+ transients.
This study emphasises the need to establish the behaviour of the indicator within the cytosol of the cell under study, before attributing values to the [Ca2+] from Fluo-3 fluorescence. Based on the measurements in this study, the Kd for Fluo-3 in free solution is appropriate for measurements on permeabilised cells and perhaps for Fluo-3 (AM) acid loaded into cardiomyocytes via a patch pipette. However, this Kd is not necessarily appropriate for cardiomyocytes loaded with Fluo-3 by incubation in the −AM form. [1]

C51H50CL2N2O23

1129.85

1128.218

121714-22-5

5086914

Brown to reddish brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1075.8±65.0 °C at 760 mmHg

604.4±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.631

5.4

285.78

0

25

36

78

2220

0

CC1=CC(=C(C=C1)N(CC(=O)OCOC(=O)C)CC(=O)OCOC(=O)C)OCCOC2=C(C=CC(=C2)C3=C4C=C(C(=O)C=C4OC5=CC(=C(C=C53)Cl)OCOC(=O)C)Cl)N(CC(=O)OCOC(=O)C)CC(=O)OCOC(=O)C

PTPUOMXKXCCSEN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C51H50Cl2N2O23/c1-28-7-9-39(54(19-47(62)74-24-69-30(3)57)20-48(63)75-25-70-31(4)58)45(13-28)66-11-12-67-46-14-34(8-10-40(46)55(21-49(64)76-26-71-32(5)59)22-50(65)77-27-72-33(6)60)51-35-15-37(52)41(61)17-42(35)78-43-18-44(38(53)16-36(43)51)73-23-68-29(2)56/h7-10,13-18H,11-12,19-27H2,1-6H3

acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-dichloro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-N-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate

Fluo-3AM; 121714-22-5; FLUO 3/AM; Glycine, N-[4-[6-[(acetyloxy)methoxy]-2,7-dichloro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl]-2-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]-, (acetyloxy)methyl ester; Fluo-3, AM; Fluo-3-(acetoxymethyl) ester; CHEMBL2074907; SCHEMBL16364726;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~12.5 mg/mL (~11.06 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。