GC376 sodium   中文名称: GC376钠盐

PEDV 3CLpro (IC50 = 1.11 μM); TGEV (IC50 = 0.15 μM); FIPV (IC50 = 0.2 μM); PTV (IC50 = 0.15 μM); MNV-1 (IC50 = 5.3 μM); 229E (IC50 = 0.15 μM); MHV (IC50 = 1.1 μM); BCV (IC50 = 0.6 μM)

GC376和Molnupiravir在72小时时对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2表现出相加活性，在48小时时表现出协同活性。引言：有效疫苗的开发在一定程度上缓解了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型疫情的趋势；然而，对口服抗病毒药物的需求依然存在。本研究旨在研究莫奈韦与奈马替韦或GC376联合治疗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的活性，以验证其协同作用。方法：对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型20A。EU、BA.1和BA.2用于在单独或组合存在抗病毒化合物的情况下感染Vero E6，使用五倍连续稀释的化合物浓度≤EC90。感染后48和72小时，使用MTT还原法检测存活率。收集上清液进行菌斑测定滴定。所有实验均进行三次，每次重复至少三次。协同得分是使用Synergy Finder版本2计算的。结果：所有化合物均达到微摩尔EC90。Molnupiravir和GC376在48小时显示出协同活性，HSA评分为19.33（p<0.0001），在72小时显示出相加活性，HSB评分为8.61（p<0.00001）。Molnupiravir和nirmatrevir在48小时和72小时均显示出协同活性，HSA评分分别为14.2（p=0.01）和13.08（p<0.0001）。结论：Molnupivir与两种蛋白酶抑制剂nirmatrevir和GC376中的一种联合使用在体外显示出良好的加性协同活性[2]。

GC376是一种亚硫酸氢二肽加合物盐，它是3CLpro（3C样蛋白酶）的抑制剂，具有强效的抗病毒和冠状病毒活性，特别是对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的前所未有的2019冠状病毒病（新冠肺炎）大流行对全球公共卫生构成严重威胁。迫切需要开发针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的有效疗法。在这里，我们使用小鼠适应的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染小鼠模型，评估了瑞德西韦母体核苷酸类似物GS441524（靶向冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶）和猫冠状病毒前药GC376（靶向其主要蛋白酶）的抗病毒活性。我们的结果表明，GS441524通过鼻内（i.n.）和肌肉内（i.m.）联合治疗有效地阻断了小鼠上呼吸道和下呼吸道中严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的增殖。然而，高剂量GC376（i.m.或i.n.和i.m.）的能力弱于GS441524。值得注意的是，低剂量联合应用GS441524和GC376可以通过静脉注射或静脉注射和肌肉注射治疗有效保护小鼠免受严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染。此外，我们发现GS441524的药代动力学特性优于GC376，GC376和GS441522的联合应用具有协同作用。我们的研究结果支持在未来的临床研究中进一步评估GC376和GS441524的联合应用[3]。

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口服GS441524和GC376在FIPV模型中有效[4]
根据GS441524和GC376 PK分析数据，我们选择了各种口服给药方案。在此阶段我们评估了不同口服剂量GS441524（5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg）和GC376（15mg/kg，100mg/kg和150mg/kg）在体内对抗FIPV-rQS79。猫被随机分为八组（n=3），口服FIPV-rQS79疫苗。我们以105 TCID50的剂量给猫接种了FIPV-rQS79。 所有接种病毒的猫在GS441524治疗时都出现了发烧和体重急剧下降等症状。接种病毒后，动物体重逐渐下降，治疗后体重逐渐增加，如图3A所示。经过治疗干预后，猫的发烧症状明显减轻，体温逐渐恢复到正常范围，如图3B所示。接种后患者的临床评分显著升高，经GS441524治疗后，临床评分逐渐降低；具体来说，GS441524治疗组的患者症状比阳性对照组的患者轻（图3C）。在观察期间，所有接受GS441524（5mg/kg，与未经治疗的对照组中的感染猫相比，10 mg/kg和20 mg/kg）的存活率显著提高（P<0.05）。20 mg/kg和10 mg/kg的GS441524剂量提供了最大的保护，保护率为100%。5 mg/kg/天的GS441524剂量提供了66%的保护（图3D）。结果表明，口服5mg/kg GS441524是有效的，尽管它不能完全保护FIPV感染的患者。

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在FIPV-rQS79感染动物模型中，GS441524以三种剂量治疗30天，GC376以150mg/kg PO剂量治疗24小时，可预防FIP相关死亡率[4]
20只猫暴露于FIPV-rQS79，在出现疾病症状后监测它们对GS441524和GC376治疗的反应（图9）。接种病毒约一周后，大多数猫都出现了临床症状。GS441524和GC376经不同剂量治疗30天后，一些猫恢复健康，但其中4只经口服治疗的猫在治疗后5至6周出现疾病复发，其中2只出现严重的神经症状，表现为瞳孔大小不均和无法控制后腿。除复发性疾病的猫外，其余接受过一次治疗的猫在两个月后保持正常。

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与口服或皮下GC376相比，GS441524在药代动力学参数方面表现出更多优势[4]
为了说明口服GC376或GS441524治疗效果的差异，本研究中GS441522的药代动力学参数如表1和表2所示。与GC376相比，GS441524的清除时间更长。当皮下注射后的GC376血浆浓度达到Cmax（18000ηg/mL）时，大约需要8小时才能降至有效浓度以下。但皮下注射后GS441524为2000ηg/mL，给药后约12小时，浓度降至有效浓度以下。尽管GC376的AUC（0-∞）比GS441524高，但其平均停留时间（MRT）也相对较短，表明它比GS441520更容易代谢。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）在仔猪中具有高毒力和传染性，对全球许多国家的猪肉产业造成了重大损害。目前还没有针对冠状病毒（CoV）的商业药物，对抗PEDV抑制剂的研究也很少。冠状病毒3C样蛋白酶（3CLpro）具有保守的结构和催化机制，在病毒多蛋白加工过程中起着关键作用，因此是一种有吸引力的抗病毒药物靶点。在这里，我们报告了广谱抑制剂GC376的抗PEDV作用（靶向小核糖核酸病毒样超群中病毒的3Cpro或3CLpro）。GC376对PEDV 3CLpro非常有效，对两株PEDV毒株的抑制作用相似。此外，PEDV 3CLpro与GC376复合物的结构被确定为1.65Å。我们阐明了结构细节，并分析了GC376与PEDV 3CLpro结合和GC376与传染性胃肠炎病毒（TGEV）3CLpro结合之间的差异。最后，我们探索了PEDV 3CLpro在P2位点的底物特异性，并分析了GC376中Leu基团修饰对抑制PEDV感染的影响。这项研究有助于我们更好地了解PEDV 3CLpro底物特异性，为优化GC376作为冠状病毒抗病毒治疗药物的开发提供了信息[1]。

Vero e6细胞抗病毒活性的评价[3]
按照制造商的说明，使用Cell Titer Glo试剂盒测定细胞存活率。简而言之，将Vero E6细胞接种在具有不透明壁的96孔板中。12-16小时后，加入指示浓度的GC376（0、1、5、10、50、100、500µM）、GS441524（0、1,5、10、50100500µM）和GC376+GS441524（0、0.5、2.5、5、25、50、250µM）24小时。向每个孔中加入Cell Titer-Glo试剂，并使用GloMax 96微孔板光度计测量发光。

抗病毒活性实验按照之前的方法进行测定。简而言之，Vero E6细胞用指定浓度的GC376（0,0.5,1,2,4,6,8,10µM）、GS441524（0,0.5,1,2,4,6,8-10µM）和GC376+GS441524（0,0.25,0.5,1,2,3,4,5µM）或单独用载体溶液（12%磺丁基醚-β-环糊精，pH 3.5）预处理1小时。然后用MOI为0.005的HRB26或HRB26M感染细胞，并在37°C下孵育1小时。用PBS洗涤细胞，加入含有指定量的GC376、GS441524和GC376+GS441524的病毒生长培养基或单独的载体溶液。在腹膜后24小时收集上清液，用于在Vero E6细胞中通过PFU测定进行病毒滴定。根据与模拟处理对应物中病毒滴度的比率计算相对病毒滴度。使用GraphPad Prism 7.0对数据进行分析。结果显示为三个独立实验的平均值和标准偏差。

在96孔透明平底板中，接种Vero E6细胞（3000个细胞/孔），在37°C下用5%的CO2孵育24小时。孵育后，使用0.1的多重感染（MOI）感染细胞。允许严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型在37°C下吸附1小时。在去除病毒接种物后，用含有三倍稀释的莫奈韦（0.62-50μM）、奈马替韦（0.62-50μM）和GC376（0.21-16.7μM）的培养基覆盖细胞。每个平板都含有模拟感染细胞、感染阳性对照（仅限严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型）和阴性对照（仅含化合物）。在37°C和5%CO2下孵育48和72小时后，使用MTT还原法评估细胞的存活率。

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GS441524和GC376在CRFK细胞中的细胞毒性[4]
将CRFK细胞接种到96孔板中，并在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM（Gibco，USA）中生长。当细胞形成单层时，用2%FBS和不同浓度的GC376（0.3125µM、0.625µM、1.25µM和2.5µM）或GS441524（0.3125μM、0.625M、1.25μM和2.5μM）代替培养基。使用含有0.4%DMSO的DMEM作为空白对照。在含有5%CO2的气氛下，将细胞在37°C下孵育48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。然后加入不含FBS的MEM（100µL）和CCK-8（10µL），将细胞在37°C下孵育1-4小时。使用FLUOstar Omega读取450 nm处的光密度（OD）。使用以下方程式计算细胞存活率：

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细胞存活率=[OD（化合物）-OD（空白）]/[OD（对照）-OD-（空白）]×100%·

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EC50值是使用GraphPad Prism软件版本8.0.2计算的。

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评估GC376和GS441524对FIPV-rQS79和FIPV-II的体外抗病毒作用（0.01 MOI）；将不同浓度的GC376或GS441524加入含有CRFK细胞单层的96孔板中，在37°C和5%CO2的气氛下孵育细胞28小时。在五个重复孔中测试每种药物浓度，并使用0.4%DMSO作为空白对照。EC50值通过CCK-8测定法测定。

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间接免疫荧光法（IFA）[4]
通过将细胞接种在玻璃盖玻片上并允许其生长直至达到50%的膜融合，对FIPV感染期间以及GS441524和GC376处理的CRFK细胞中的FIPV N蛋白表达进行免疫荧光分析。简而言之，将盖玻片上的CRFK细胞单层在37°C下接种FIPV II或FIPV-rQS79（MOI=0.01）24小时。用PBS洗涤后，我们将CRFK细胞在4%多聚甲醛中固定20分钟，然后在室温下在0.3%Triton-X-100中透化30分钟，并在37°C下用5%BSA封闭30分钟。用PBS洗涤后，我们在4°C下用抗FIPV N单克隆抗体孵育细胞过夜。用PBS吐温-20（PBST）洗涤3次后，我们将细胞与山羊抗兔488（1:1000）在37°C下孵育1.5小时。我们在室温下用DAPI（1:1000）再次孵育15分钟。然后用PBST洗涤三重染色的细胞三次，我们在高倍镜下捕获图像进行分析。

雌性BALB/c小鼠
111或55.5 mg/kg
i.m.

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GC376和GS441524的体内毒性研究[3]
毒性研究在4至6周龄的雌性BALB/c小鼠中进行。BALB/c小鼠被随机分为四组（每组五只），一组为假处理组（肌注溶剂），三组为肌注给药组：GC376（40 mM/l，100 µl）、GS441524（40 mM/l，100 µl）和GC376 + GS441524（20 mM/l，100 µl）。假处理组和实验组的小鼠每天称重，持续15天。此外，分别于给药后第0、5、10和15天采集血样。在武汉赛维生物科技有限公司进行各种血液生化指标或血细胞计数检测。数据采用GraphPad Prism 7.0进行分析。

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GC376和GS441524的体内抗病毒研究[3]
首先，将6只4至6周龄的雌性BALB/c小鼠分为一组，分别肌注GC376（40或8 mM/l，100 µl）、GS441524（40或8 mM/l，100 µl）和GC376 + GS441524（20或4 mM/l，100 µl）的负荷剂量，随后每日维持给药。或者，对小鼠进行鼻内单次给药（GC376，20 mM/l，50 µl；GS441524，20 mM/l，50 µl；GC376 + GS441524，10 mM/l，50 µl）或以下组合给药：GC376（20 mM/l，50 µl，鼻内给药；40 mM/l，100 µl，肌肉注射）、GS441524（20 mM/l，50 µl，鼻内给药；40 mM/l，100 µl，肌肉注射）和 GC376 + GS441524（10 mM/l，50 µl，鼻内给药；20 mM/l，100 µl，肌肉注射），随后每日给予维持剂量。作为对照，小鼠每日接受载体溶液（12%磺丁基醚-β-环糊精，pH 3.5）灌胃。在给予GC376、GS441524、GC376 + GS441524或载体溶液负荷剂量1小时后，每只小鼠经鼻内接种50 μl含10³.⁶ PFU HRB26M的病毒。每组各取3只小鼠于接种后第3天和第5天处死。收集鼻甲和肺组织，按照先前描述的方法进行qPCR和PFU检测。以含有SARS-CoV-2 N基因全长cDNA的质粒标准曲线对靶向SARS-CoV-2 N基因的vRNA量进行标准化。检测灵敏度为1000拷贝/ml。使用 Microsoft Excel 2016 和 GraphPad Prism 7.0 对数据进行分析。

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BALB/c 小鼠和 SD 大鼠中 GC376 和 GS441524 的药代动力学研究[3]
本研究采用健康 SPF 级 BALB/c 小鼠（7-8 周龄）和 SD 大鼠（4-6 周龄）进行单剂量药代动力学研究。在零时点，A、B 和 C 组（每组包含 20 只 BALB/c 小鼠或 5 只 SD 大鼠）的 BALB/c 小鼠和 SD 大鼠分别接受 GC376（111 mg/kg）、GS441524（67 mg/kg）和 GC376 + GS441524（55.5 + 33.5 mg/kg）的肌注，这些剂量与体内抗病毒研究中的剂量相同。分别于0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时采集血液样本，置于预冷的聚丙烯离心管中，该离心管内含有3.0 µl 40% EDTAK2溶液。然后，将全血在4°C下以7800 g/min的转速离心10分钟。收集血浆并储存于-80°C冰箱中。采用LC-MS/MS分析血浆药物浓度。使用WinNonlin软件（6.4版）计算药代动力学参数，并采用非房室模型进行数据拟合。使用 Microsoft Excel 2016 和 GraphPad Prism 7.0 对数据进行分析。

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猫体内 GC376 和 GS441524 的药代动力学研究 [4]本研究在实验猫中开展，旨在确定口服 GS441524 和 GC376 的疗效。将 GS441524 溶解于 5% 乙醇、30% 丙二醇、45% PEG 和 20% 水中，浓度为 12 mg/mL，并用浓盐酸调节 pH 至 1.9。所有动物随机分为以下三组：A 组（n ≥ 3；静脉注射），B 组（n ≥ 3；皮下注射），C 组（n ≥ 3；口服）。在零时点，A组猫静脉注射5 mg/kg体重的化合物，B组猫皮下注射5 mg/kg体重的化合物。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时，从每只猫的前肢桡静脉采集0.5 mL EDTA抗凝全血样本。采集后，立即将血样置于冰上，并以5000 rpm离心5分钟。将分离的血浆转移至1.5 mL微量离心管中，并于-80 °C冷冻保存，用于后续游离GS441524的分析。所有样品均采用液相色谱-单键串联质谱法（LC-MS/MS）检测浓度。

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经中和抗体检测确认无病毒后，将健康猫（1-3岁，2.0-4.5 kg）随机分为8组（每组4只）。同时，我们还检测了它们的肝肾功能，结果均正常，确保试验猫能够正常吸收和代谢药物。首先在猫传染性腹膜炎（FIP）模型中研究了口服GC376或GS441524的效果。病毒感染后，治疗组中感染FIPV-rQS79的动物分别口服GS441524（20 mg/kg、10 mg/kg或5 mg/kg）或GC376（150 mg/kg、100 mg/kg或15 mg/kg），溶于500 µL PBS缓冲液中。对照组给予相同体积的PBS缓冲液。在第0天，通过口服接种FIPV-rQS79（105 × TCID50，溶于DMEM培养基，1000 µL）感染猫。随后检测了GC376和GS441524在感染发生后的治疗效果。按照先前描述的方法监测动物的临床症状和存活率，并每日评估猫的健康状况[4]。

GS441524 和 GC376 不同给药途径和剂量下的药代动力学研究[4]
为了确定 GC376 和 GS441524 的口服剂量，我们测试了健康成年猫经不同给药途径（包括皮下、口服和静脉注射）给药后的药代动力学。图 2A 和 2C 分别显示了 GS441524 和 GC376 在不同给药途径后的浓度-时间曲线。采用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS-MS) 检测药代动力学样品中的药物浓度。结果表明，口服 GS441524 的曲线下面积与皮下给药相同，表明改变给药途径不影响药物吸收；因此，GS441524 可以按照文献报道的剂量进行口服给药。相比之下，口服GC376的吸收率显著低于皮下给药；因此，口服GC376可能需要更高的剂量。
由于GS441524的溶解度较低，我们假设药物溶解度的降低会影响药物吸收。为了验证这一假设，我们评估了口服GS441524和以粉末或溶液形式给药的GC376的药代动力学差异。结果表明，与液体GS441524相比，GS441524粉末的药物吸收率显著降低；然而，比较口服和皮下给药GS441524的药物AUC，药物AUC没有显著差异（图2 G和H）。相反，与液体GC376相比，GC376粉末的药物吸收率没有变化；然而，比较口服和皮下注射GC376的药物吸收情况，发现二者存在显著差异（图2E和F）。本研究中，溶液剂型被用作后续动物试验的主要剂型。

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GC376和GS441524单独或联合用药的药代动力学研究[3]
为了进一步研究GC376和GS441524的潜力，我们评估了它们在SPF BALB/c小鼠和SD大鼠体内肌注GC376（111 mg/kg）、GS441524（67 mg/kg）以及GC376 + GS441524（55.5 + 33.5 mg/kg）后的药代动力学(PK)特性，这些剂量与体内抗病毒研究中的剂量相同。在小鼠中，药代动力学结果显示，肌注GC376和GS441524后均被迅速吸收，血浆峰浓度分别在注射后0.22 ± 0.07 h和0.80 ± 0.24 h达到（图5A、B和表1）。由于GC376的肌注剂量约为GS441524的1.7倍，我们发现GC376的最大血浆药物浓度（Cmax）（46.70 ± 10.69 μg/ml）约为GS441524（39.64 ± 2.93 μg/ml）的1.2倍（表1）。然而，GS441524 的曲线下面积 (AUC0−t) 值 (AUC0−t = 106.82 ± 16.79) 约为 GC376 (AUC0−t = 55.29 ± 11.26) 的 1.9 倍。同时，我们观察到 GC376 的血浆清除率 (CL/F，1985 ± 485 ml/h/kg) 约为 GS441524 (CL/F，639 ± 119 ml/h/kg) 的 3.1 倍（表 1）。此外，SD 大鼠的药代动力学结果显示，GC376 和 GS441524 的达峰时间 (Tmax) 分别为 1.30 ± 0.60 小时和 2.00 ± 1.10 小时（图 5D、E 和表 2）。与小鼠相比，GS441524在SD大鼠体内的利用效率显著高于GC376。我们发现，GC376的血浆药物最大浓度（Cmax）（12.56 ± 1.90 μg/ml）约为GS441524（30.96 ± 8.40 μg/ml）的2.5倍（表2）。GS441524的曲线下面积（AUC0−t）（AUC0−t = 183.33 ± 64.36）约为GC376（AUC0−t = 92.14 ± 9.99）的2.0倍。我们还观察到，血浆中 GC376 (CL/F, 1208 ± 122 ml/h/kg) 的清除率约为 GS441524 (CL/F, 423 ± 186 ml/h/kg) 的 2.9 倍。

[1]. Viruses. 2020 Feb 21;12(2):240.

[2]. Microorganisms. 2022 Jul 21;10(7):1475.

[3]. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):481-492.

[4]. Vet Microbiol. 2023 Aug:283:109781.

GC-376 是一种 3C 样蛋白酶（3CLpro 或 Mpro）抑制剂，可阻止宿主细胞中病毒复制和转录所需的功能性病毒蛋白的切割和激活。该化合物是一种已知的冠状病毒直接抗病毒药物 (DAA)，最初是利用结构导向设计开发用于对抗中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV) 感染的。此外，GC-376 对多种冠状病毒，例如猫冠状病毒、雪貂冠状病毒和水貂冠状病毒的 Mpro 也显示出强效活性。作为 [GC-373] 的前药，GC-376 近期已被用于体外测试其对 SARS-CoV-2 Mpro 的抑制作用，结果显示其对该靶点具有强效抑制作用。这些结果表明，GC-376 及其代谢物可能具有治疗新冠肺炎 (COVID-19) 的潜力。

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猫传染性腹膜炎 (FIP) 是由猫传染性腹膜炎病毒 (FIPV) 引起的致命性猫科疾病。两种药物（GS441524 和 GC376）靶向猫泛白细胞减少症病毒（FIPV），皮下注射给药时具有良好的治疗效果。然而，与口服给药相比，皮下注射存在局限性。此外，这两种药物的口服疗效尚未确定。本研究表明，GS441524 和 GC376 在 CRFK 细胞中以非细胞毒性浓度有效抑制 FIPV-rQS79（一种重组病毒，其刺突蛋白基因由全长 I 型 FIPV 病毒株组成，刺突蛋白基因被 II 型 FIPV 病毒株替换）和 FIPV II（市售 II 型 FIPV 病毒株 79-1146）。此外，通过体内药代动力学研究确定了 GS441524 和 GC376 的有效口服剂量。我们进行了三组剂量动物试验，发现GS441524在一定剂量范围内均能有效降低FIP模型的死亡率，而GC376仅在高剂量下才能降低死亡率。此外，与GC376相比，口服GS441524吸收更好、清除更慢、代谢更慢。而且，口服和皮下给药的药代动力学参数无显著差异。总而言之，我们的研究首次利用相关动物模型评估了口服GS441524和GC376的疗效。我们还验证了口服GS441524的可靠性，以及口服GC376作为合理临床用药参考的潜力。此外，药代动力学数据为这些药物的优化提供了见解和潜在方向。[4]

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由FIPV引起的FIP威胁猫科动物的健康。 GS441524 和 GC376 通过抑制病毒复制对猫传染性腹膜炎病毒 (FIPV) 有效，但皮下注射给药方式存在局限性，口服给药则具有患者依从性好、方便、成本低、易于储存等优势（Shriya S. Srinivasan，2022）。口服给药有望成为猫传染性腹膜炎 (FIP) 治疗的新方法。因此，本研究在体内外验证了口服 GS441524 和 GC376 对致死性重组 FIPV-rQS79 的疗效。首先，我们证实这两种药物在细胞培养中能有效抑制两种 FIPV 病毒。体外实验表明，这两种药物均对 FIPV-rQS79 型和 FIPV II 型病毒具有广谱抗病毒作用。药代动力学 (PK) 与药效学密切相关。药代动力学测试可以确定与猫相关的药物过程（吸收、分布、代谢和排泄）（Asif等，2005）。通过药代动力学研究，我们发现与GS441524相比，GC376的代谢速度更快。与GS441524相比，GC376的血浆消除半衰期也更短，平均滞留时间（MRT）更短。与皮下注射相比，口服GC376显著提高了总清除率和表观分布容积（P < 0.0001）。GC376是一种共价肽模拟抑制剂，它可能由肽抑制剂修饰而来，因此具有更多不稳定的化学键。先前的研究也表明，亚硫酸氢盐加合物在水中容易转化为醛形式，醛形式容易发生差向异构化，形成活性抑制立体异构体（Vuong等，2021）。以上两点原因表明，使用GC376可能导致不理想的临床结果。然而，使用GS441524时，皮下注射和口服给药途径的药代动力学参数无显著差异。GS441524表现出良好的药代动力学参数，皮下注射或口服给药的曲线下面积（AUC）相同（生物利用度相同）。本研究与先前在人和小鼠中的报道不同，因为不同物种的口服生物利用度差异很大，大鼠的F值为33%，犬为85%，食蟹猴为8.3%（Davis et al., 2021; Humeniuk et al., 2020; Li et al., 2022; Wei et al., 2021; Xie and Wang, 2021）。结果表明，代谢差异是这些药物体内作用差异的原因之一。这些结果初步解释了GS441524在体内疗效优于GC376的原因。溶解度是影响药物吸收的因素之一，由于GS441524的溶解度较低，我们推测制剂因素也影响其口服吸收。结果显示，与口服液体GS441524相比，口服GS441524粉剂的药物吸收显著降低；然而，GS441524的口服和皮下给药途径的药物吸收无显著差异。相反，与口服液体GC376相比，口服GC376粉剂并未改变药物吸收。因此，溶解度影响GS441524的吸收，但不影响GC376的吸收。
体内研究发现，口服GS441524无论剂量如何均有效，而口服GC376仅在高剂量（150 mg/kg）下有效。尽管这两种药物在体外均具有良好的抑制作用，但它们在体内的作用却显著不同。
药物可通过多种途径进入体内，包括肠内、肠外和局部给药途径。每种给药途径都有其特定的目的、优势和劣势。从根本上讲，药物到达靶点的可及性和药物治疗的有效性都强烈依赖于给药途径。
在各种给药途径中，口服给药因其诸多优势而备受关注，包括患者依从性好、方便、成本低、易于储存、运输和给药（Mignani等，2013）。尽管口服给药是小分子药物的最佳给药途径，但其应用仍存在一些局限性。与其他给药途径相比，口服给药后的药物吸收机制更为复杂，且受多种因素影响（例如胃肠动力、胃排空速率以及食物的存在）。口服药物必须克服胃部的强酸性环境，溶解于胃液中，并在动态的肠道菌群中保持稳定；此外，这些药物还必须避开能够穿透粘稠黏液屏障和外排泵的降解酶，才能达到治疗所需的生物利用度（Srinivasan et al., 2022）。克服这些障碍并非易事。除了口服途径外，药物还可以通过皮下注射进入循环系统发挥作用；这种给药方式起效相对较快，但同时也具有刺激作用，且对动物而言较为痛苦。此外，注射液的生产成本和质量要求也较高。这些途径差异导致药物吸收和代谢的差异。
因此，我们应该基于多种因素选择更优的给药途径。同时，药代动力学为临床用药提供了指导。药代动力学数据还可以为药物结构优化提供思路。我们可以通过结构修饰进一步降低化合物的现有缺点，并有望开发出更具优势的抗FIPV化合物。例如，Liu等人优化了GC376的结构，发现苄基的进一步修饰可能导致与Mpro形成更强的键，甚至形成额外的氢键。化合物NK-0163的优势在于其在肺等重要组织中具有较长的半衰期，尽管这种卤素取代可能改变了其药代动力学（Liu等人，2022）。Quan等人。据报道，一系列强效的含α-酮酰胺的化合物，特别是Y180，在啮齿动物和非啮齿动物中均具有优异的生物利用度（Quan et al., 2022）。
先前的研究也报道，GS441524具有良好的抗病毒活性，并具有口服给药的潜力。然而，其不利的口服药代动力学阻碍了其进一步开发为口服药物（Li et al., 2022）。为了解决这个问题，Wei等人……据报道，一系列GS441524类似物（碱基或糖基部分进行了修饰）以及一些前药形式，其中3′-异丁酰酯5a、5′-异丁酰酯5c和异丁酰酯5g氢溴酸盐的口服生物利用度优于GS441524（分别为71.6%、86.6%和98.7%）（Wei等，2021）。上述GC376和GS441524的修饰可进一步研究，有望提高GC376和GS441524对FIPV患者的治疗效果。
总之，本研究首次报道了口服GS441524和GC376可有效治疗动物模型中的FIPV感染。我们的研究表明，口服给药可以替代皮下注射，尽管我们仍需通过新的方法或途径解决现有问题。总体而言，GS441524 和 GC376 完全抑制了 CRFK 细胞中 FIPV-rQS79 和 FIPV II 的复制。我们的研究还验证了口服 GC376 和 GS441524 的疗效，并证实了 GS441524 和 GC376 的口服生物利用度。通过药代动力学 (PK) 研究，我们确定了这两种药物在猫体内的吸收、分布、代谢和排泄情况。此外，PK 结果进一步解释了两种药物体内疗效差异的原因，并为药物优化和转化提供了思路和方向。[4] 世界卫生组织于 3 月 11 日宣布 COVID-19 为全球大流行，因为其对全球公共卫生构成巨大威胁。冠状病毒主蛋白酶（Mpro，也称3CLpro）对病毒多聚蛋白的加工和成熟至关重要，因此被认为是一个极具吸引力的药物靶点。本文研究表明，临床批准的抗丙型肝炎病毒（HCV）药物博赛匹韦（Boceprevir）和猫传染性腹膜炎（冠状病毒）病毒（FIPV）的临床前抑制剂GC376均能通过靶向Mpro有效抑制Vero细胞中的SARS-CoV-2病毒。此外，GC376与瑞德西韦（一种抑制病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的核苷酸类似物）联合应用，可产生显著的叠加抑制效果。进一步的结构分析表明，这两种抑制剂均与SARS-CoV-2蛋白酶Mpro的催化活性位点结合，这是其主要的抑制机制。我们的研究结果可能为优化和设计更有效的SARS-CoV-2病毒抑制剂提供关键信息。来源：Nat Commun. 2020; 11: 4417.

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由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 引起的COVID-19大流行是本世纪最重大的全球公共卫生紧急事件。GC376是一种Mpro抑制剂，在体外对SARS-CoV-2具有抗病毒活性。本研究使用K18-hACE2小鼠模型评估了GC-376在体内对SARS-CoV-2的抗病毒疗效。GC-376治疗对K18-hACE2小鼠无毒性。与对照组相比，GC-376治疗组小鼠在SARS-CoV-2攻击后的临床症状和存活率总体上没有改善。在以105 TCID50/只小鼠的高病毒剂量攻击后，GC-376治疗使小鼠的存活率从0%略微提高到20%。最值得注意的是，与载体对照组相比，GC-376 治疗组小鼠在接受 103 TCID50/只低剂量病毒攻击后，组织损伤更轻，病毒载量更低，病毒抗原含量更少，炎症反应也更轻。尤其是在脑组织中，GC-376 治疗组小鼠的病毒滴度较载体对照组降低了 5 个数量级。这项研究支持以下观点：GC-376 是一种有前景的先导化合物，值得进一步开发用于治疗 SARS-CoV-2 感染；K18-hACE2 小鼠模型适用于研究针对 SARS-CoV-2 的抗病毒疗法。来源：Sci Rep. 2021; 11: 9609。

C21H30N3NAO8S

507.5330

507.165

C, 49.70; H, 5.96; N, 8.28; Na, 4.53; O, 25.22; S, 6.32

1416992-39-6

1416992-39-6 (sodium);1417031-79-8 (free acid);

71481119

Off-white to yellow solid powder

182Ų

4

8

12

34

783

2

CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1CCNC1=O)C(O)S(=O)(=O)[O-])NC(=O)OCC2=CC=CC=C2.[Na+]

BSPJDKCMFIPBAW-JPBGFCRCSA-M

InChI=1S/C21H31N3O8S.Na/c1-13(2)10-16(24-21(28)32-12-14-6-4-3-5-7-14)19(26)23-17(20(27)33(29,30)31)11-15-8-9-22-18(15)25;/h3-7,13,15-17,20,27H,8-12H2,1-2H3,(H,22,25)(H,23,26)(H,24,28)(H,29,30,31);/q;+1/p-1/t15?,16-,17-,20?;/m0./s1

sodium;(2S)-1-hydroxy-2-[[(2S)-4-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoyl]amino]-3-(2-oxopyrrolidin-3-yl)propane-1-sulfonate

GC376 sodium; GC-376; GC 376; GC-376 sodium; GC376; GC376 sodium; H1NMJ5XDG5; (betaS)-alpha-Hydroxy-beta-[[(2S)-4-methyl-1-oxo-2-[[(phenylmethoxy)carbonyl]amino]pentyl]amino]-2-oxo-3-pyrrolidinepropanesulfonic acid sodium salt; Sodium (2S)-2-((S)-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-4-methylpentanamido)-1-hydroxy-3-(2-oxopyrrolidin-3-yl)propane-1-sulfonate; GC-376; sodium;(2S)-1-hydroxy-2-[[(2S)-4-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoyl]amino]-3-(2-oxopyrrolidin-3-yl)propane-1-sulfonate; GC 376 sodium

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~197.0 mM)
Ethanol: ~100 mg/mL (~197.0 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。