FIPV ( EC50 = 0.78 μM ); RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)

体外活性：细胞在所有浓度的 GS-441524 下均出现并正常生长，并且在 24 小时时无法吸收荧光染料 CellTox Green。因此，细胞毒性浓度 50% (CC50) > 100 μM。 GS-441524 的有效浓度 50% (EC50) 经计算为 0.78 μM。细胞测定：为了确定 GS-441524 对 CRFK 细胞的毒性，用 100、33.3、11.1、3.7 或 1.2 μM GS-441524 处理 CRFK 细胞 24 小时。

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GC376和GS441524的联合应用增强了Vero E6细胞中抑制严重急性呼吸系统综合征冠状病毒-2的能力[5]
我们评估了GC376、GS441524以及GC376和GS441524（摩尔比：1:1）的联合应用（GC376+GS441524）对Vero E6细胞中活病毒（严重急性呼吸系统综合征冠状病毒-2:HRB26和HRB26M）复制的抑制效果。我们首先在体外测试了这些化合物的细胞毒性。GC376和GS441524在Vero E6细胞中浓度高达250μM时没有产生明显的细胞毒性（CC50>250μM；补充图3）。我们的结果表明，GC376和GS441524对HRB26有效，50%抑制浓度（EC50）值分别为0.643±0.085μM和5.188±2.476μM（图2A、B）。GC376和GS441524对HRB26M也有效，EC50值分别为0.881±0.109μM和5.047±2.116μM（图2D，E）。我们的结果表明，当单独使用这些药物时，GC376抑制病毒（HRB26和HRB26M）复制的能力优于GS441524。我们观察到，GC376+GS441524比单一治疗更有效地抑制HRB26和HRB26M复制，EC50值分别为0.531±0.162μM和0.369±0.068μM（图2C，F）。在冠状病毒的复制过程中，Mpro是第一批被多聚蛋白加工的nsps之一，其他与复制相关的蛋白质，如RdRp，可以在Mpro和PLP蛋白酶的参与下产生[8,9]。这种现象可能是GC376优于GS441524的原因，它们的联合应用可能会产生协同效应，因为这些药物靶向参与病毒复制的不同蛋白质。

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GS441524和GC376对猫传染性腹膜炎病毒感染患者的体外抗病毒活性[6]
为了评估口服GC376和GS441524的治疗效果，我们研究了这两种药物在猫肾（CRFK）细胞中的抗病毒活性。使用CCK-8试验测试GC376和GS441524抑制FIPV-rQS79和FIPV-II增殖的能力。我们的实验室之前构建了一种名为FIPV-rQS79的重组病毒，该病毒已被证明在体内可导致100%的死亡率（Delaplace等人，2021；Wang等人，2021）。我们证实了GC376和GS441524对FIPV-rQS79和FIPV-II的抗病毒活性。CRFK细胞通常与药物和病毒一起培养48小时。GC376和GS441524均显示出对FIPV II的作用，EC50值分别为0.9μM和2.142μM（图1A和D）。之前报道的FIPV的EC50值分别为0.78μM（Murphy等人，2018）和0.3μM（Pedersen等人，2018年）。GC376和GS441524也抑制FIPV-rQS79，EC50值分别为1.239μM和2.52μM（图1B和E）。通过CCK-8法测定GC376和GS441524的可能细胞毒性。在CRFK细胞中，在高达100μM的任何浓度下，这两种化合物都没有表现出明显的细胞毒性（图1C和F）。感染后12小时，使用免疫荧光法验证了用GC376和GS441524连续稀释处理的感染细胞中的抗FIPV效力（图1G）。与阳性对照组相比，FIPV-rQS79和FIPV-II感染后，当细胞与1.25μM GS441524或2.5μM GC376（图1G）一起孵育24小时时，没有观察到明显的病理变化。我们的结果表明，GS441524和GC37

10只接受治疗的猫对治疗产生了快速反应，淋巴细胞水平和直肠温度恢复到感染前的水平和两只无症状猫的水平。到目前为止，所有接受过一次或两次治疗的十只猫都保持正常（感染后八个多月）。注射化合物后 10 秒内，某些猫会出现短暂的刺痛反应。局部和短暂的疼痛表现为不寻常的姿势、舔注射部位和/或注射后持续约 30-60 秒的发声。相对于其他动物，某些动物的注射反应更为明显，一次注射与下一次注射的反应不一致，并且随着时间的推移而减少。在 7 天的治疗过程中，NHP 中的 Remdesivir（静脉注射）导致血清中 GS441524 的浓度比 Remdesivir 高 1000 倍。

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GC376是一种亚硫酸氢二肽加合物盐，它是3CLpro（3C样蛋白酶）的抑制剂，具有强效的抗病毒和冠状病毒活性，特别是对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的前所未有的2019冠状病毒病（新冠肺炎）大流行对全球公共卫生构成严重威胁。迫切需要开发针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的有效疗法。在这里，我们使用小鼠适应的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染小鼠模型，评估了瑞德西韦母体核苷酸类似物GS441524和猫冠状病毒前药GC376的抗病毒活性，前者靶向冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶，后者靶向其主要蛋白酶。我们的结果表明，GS441524通过联合鼻内（i.n.）和肌肉内（i.m.）治疗有效地阻断了小鼠上呼吸道和下呼吸道中严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的增殖。然而，高剂量GC376（i.m.或i.n.和i.m.）的能力弱于GS441524。值得注意的是，低剂量联合应用GS441524和GC376可以通过静脉注射或静脉注射和肌肉注射治疗有效保护小鼠免受严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染。此外，我们发现GS441524的药代动力学特性优于GC376，GC376和GS441522的联合应用具有协同作用。我们的研究结果支持在未来的临床研究中进一步评估GC376和GS441524的联合应用[5]。

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口服GS441524和GC376在FIPV模型中有效[6]
根据GS441524和GC376 PK分析数据，我们选择了各种口服给药方案。在此阶段，我们评估了不同口服剂量的GS441524（5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg）和GC376（15mg/kg，100mg/kg和150mg/kg）在体内对抗FIPV-rQS79。猫被随机分为八组（n=3），口服FIPV-rQS79疫苗。我们以105 TCID50的剂量给猫接种了FIPV-rQS79。 所有接种病毒的猫在GS441524治疗时都出现了发烧和体重急剧下降等症状。接种病毒后，动物体重逐渐下降，治疗后体重逐渐增加，如图3A所示。经过治疗干预后，猫的发烧症状明显减轻，体温逐渐恢复到正常范围，如图3B所示。接种后患者的临床评分显著升高，经GS441524治疗后，临床评分逐渐降低；具体来说，GS441524治疗组的患者症状比阳性对照组的患者轻（图3C）。在观察期间，所有接受GS441524（5mg/kg，与未经治疗的对照组中的感染猫相比，10 mg/kg和20 mg/kg）的存活率显著提高（P<0.05）。20 mg/kg和10 mg/kg的GS441524剂量提供了最大的保护，保护率为100%。5 mg/kg/天的GS441524剂量提供了66%的保护（图3D）。结果表明，口服5mg/kg GS441524是有效的，尽管它不能完全保护FIPV感染的患者。

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在FIPV-rQS79感染动物模型中，三种剂量的GS441524治疗30天，150 mg/kg剂量的GC376治疗24小时，可预防FIP相关的死亡率[6]
20只猫暴露于FIPV-rQS79，在出现疾病症状后监测它们对GS441524和GC376治疗的反应（图9）。接种病毒约一周后，大多数猫都出现了临床症状。GS441524和GC376经不同剂量治疗30天后，一些猫恢复健康，但其中4只经口服治疗的猫在治疗后5至6周出现疾病复发，其中2只出现严重的神经症状，表现为瞳孔大小不均和无法控制后腿。除复发性疾病的猫外，其余接受过一次治疗的猫在两个月后保持正常。

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与口服或皮下GC376相比，GS441524在药代动力学参数方面表现出更多优势[6]
为了说明口服GC376或GS441524治疗效果的差异，本研究中GS441524的药代动力学参数如表1、表2所示。与GC376相比，GS441524的清除时间更长。当皮下注射后的GC376血浆浓度达到Cmax（18000ηg/mL）时，大约需要8小时才能降至有效浓度以下。但皮下注射后GS441524为2000ηg/mL，给药后约12小时，浓度降至有效浓度以下。尽管GC376的AUC（0-∞）比GS441524高，但其平均停留时间（MRT）也相对较短，表明它比GS441520更容易代谢。

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由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的前所未有的2019冠状病毒病（新冠肺炎）大流行对全球公共卫生构成严重威胁。迫切需要开发针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的有效疗法。在这里，我们使用小鼠适应的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染小鼠模型，评估了瑞德西韦母体核苷酸类似物GS441524和猫冠状病毒前药GC376的抗病毒活性，前者靶向冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶，后者靶向其主要蛋白酶。我们的结果表明，GS441524通过鼻内（i.n.）和肌肉内（i.m.）联合治疗有效地阻断了小鼠上呼吸道和下呼吸道中严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的增殖。然而，高剂量GC376（i.m.或i.n.和i.m.）的能力弱于GS441524。值得注意的是，低剂量联合应用GS441524和GC376可以通过静脉注射或静脉注射和肌肉注射治疗有效保护小鼠免受严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染。此外，我们发现GS441524的药代动力学特性优于GC376，GC376和GS441522的联合应用具有协同作用。我们的研究结果支持在未来的临床研究中进一步评估GC376和GS441524的联合应用[5]。

有几种方法可以测量抑制剂的RdRP酶活性，具体如下：[4]
生化RdRP酶活性测定
（1）RdRP聚合酶延伸模板元件（PETE）测定
由于RdRP在RNA延伸过程中催化NTPs的掺入，因此可以开发一种PETE测定法来检测RdRP的延伸活性。46在这种测定方法中，用荧光探针标记RNA模板5′端的寡核苷酸，用于荧光偏振（FP）测量。荧光探针的极化信号随着RdRP延长新合成的互补RNA链后其迁移率变低而增加。当互补RNA链的延伸停止时，化合物对RdRP活性的抑制降低了FP信号
（2）基于荧光的碱性磷酸酶-聚合酶偶联分析（FAPA）
FAPA方法在通过RdRP合成RNA的过程中在底物系统中包括修饰的核苷酸类似物。随着聚合酶反应的进行，修饰核苷酸类似物的掺入导致荧光团的释放，从而允许检测。例如，RdRP催化结合到生长的RNA链中的修饰核苷酸类似物（2-[2-苯并噻唑基]-6-羟基苯并噻唑）缀合的三磷酸腺苷（BBT-ATP），产生BBT的副产物焦磷酸（PPi）。BBTPPi随后与碱性磷酸酶反应以产生高荧光的BBT阴离子
（3）荧光RdRP活性测定
荧光团已被广泛用于RNA和DNA的检测。在该荧光定量RdRP活性测定中，荧光团用于检测来自ssRNA模板的dsRNA形成（图3C）。该测定的一个应用是筛选丙型肝炎病毒（HCV）RdRP的抑制剂。51通过使用聚（C）RNA模板，HCV RdRP催化荧光染料PicoGreen检测到的dsRNA的引物非依赖性合成。51 PicoGreen最初被开发用于量化dsDNA，但随后发现它也优先结合dsRNA而不是ssRNA。51这种测定可以很容易地适用于多种类型病毒的RdRP抑制剂的化合物筛选。除了PicoGreen，其他荧光团也被用于区分dsRNA和ssRNA，它们可用于这种类型的RdRP测定
（4）闪烁邻近度测定（SPA）
SPA也已用于HTS的RdRP酶测定。该测定依赖于在3H-GTP存在下使用生物素化引物模板通过RdRP催化将放射性核苷酸掺入新合成的RNA链。链霉亲和素偶联的SPA检测珠在这种放射性酶测定中的应用能够实现均匀的测定检测，避免了原始放射性NTP掺入测定的劳动密集型过滤和洗涤步骤。然而，由于它们是放射性测定，因此需要特定的安全预防措施和废物处理，这可能很不方便，需要加强安全协议。因此，近年来大多数放射性测定已被荧光测定法所取代。

GS-441524在CRFK细胞上用100、33.3、11.1、3.7或1.2μM处理24小时，以评估其毒性[1]。

Vero e6细胞抗病毒活性的评价[5]
按照制造商的说明，使用Cell Titer Glo试剂盒测定细胞存活率。简而言之，将Vero E6细胞接种在具有不透明壁的96孔板中。12-16小时后，加入指定浓度的GC376（0、1、5、10、50、100、500µM）、GS441524（0、1,5、10、50100500µM）和GC376+GS441524（0,0.5、2.5、5、25、50、250µM）24小时。向每个孔中加入Cell Titer-Glo试剂，并使用GloMax 96微孔板光度计测量发光

抗病毒活性实验按照之前的方法进行测定。简而言之，Vero E6细胞用指定浓度的GC376（0，0.5，1，2，4，6，8，10µM）、GS441524（0，0.5,1,2,4,6,8,10µM）和GC376+GS441524（0，0.25,0.5,1,2,3,4,5µM）或单独用载体溶液（12%磺丁基醚-β-环糊精，pH 3.5）预处理1小时。然后用MOI为0.005的HRB26或HRB26M感染细胞，并在37°C下孵育1小时。用PBS洗涤细胞，加入含有指定量的GC376、GS441524和GC376+GS441524的病毒生长培养基或单独的载体溶液。在腹膜后24小时收集上清液，用于在Vero E6细胞中通过PFU测定进行病毒滴定。根据与模拟处理对应物中病毒滴度的比率计算相对病毒滴度。使用GraphPad Prism 7.0对数据进行分析。结果显示为三个独立实验的平均值和标准偏差

在96孔透明平底板中，接种Vero E6细胞（3000个细胞/孔），在37°C下用5%的CO2孵育24小时。孵育后，使用0.1的多重感染（MOI）感染细胞。允许严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型在37°C下吸附1小时。在去除病毒接种物后，用含有三倍稀释的莫奈韦（0.62-50μM）、奈马替韦（0.62-50μM）和GC376（0.21-16.7μM）的培养基覆盖细胞。每个平板都含有模拟感染细胞、感染阳性对照（仅限严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型）和阴性对照（仅含化合物）。在37°C和5%CO2下孵育48和72小时后，使用MTT还原法评估细胞的存活率。

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GS441524和GC376在CRFK细胞中的细胞毒性[6]
将CRFK细胞接种到96孔板中，并在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM（Gibco，USA）中生长。当细胞形成单层时，用2%FBS和不同浓度的GC376（0.3125µM、0.625µM、1.25µM和2.5µM）或GS441524（0.3125μM、0.625M、1.25μM和2.5μM）代替培养基。使用含有0.4%DMSO的DMEM作为空白对照。在含有5%CO2的气氛下，将细胞在37°C下孵育48小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。然后加入不含FBS的MEM（100µL）和CCK-8（10µL），将细胞在37°C下孵育1-4小时。使用FLUOstar Omega读取450 nm处的光密度（OD）。使用以下方程式计算细胞存活率：
细胞存活率=[OD（化合物）-OD（空白）]/[OD（对照）-OD-（空白）]×100%·
EC50值是使用GraphPad Prism软件版本8.0.2计算的。
评估GC376和GS441524对FIPV-rQS79和FIPV-II的体外抗病毒作用（0.01 MOI）；将不同浓度的GC376或GS441524加入含有CRFK细胞单层的96孔板中，在37°C和5%CO2的气氛下孵育细胞28小时。在五个重复孔中测试每种药物浓度，并使用0.4%DMSO作为空白对照。EC50值通过CCK-8测定法测定。

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间接免疫荧光法（IFA）[6]
通过将细胞接种在玻璃盖玻片上并允许其生长直至达到50%的膜融合，对FIPV感染期间以及经GS441524和GC376处理的CRFK细胞中FIPV N蛋白表达进行免疫荧光分析。简而言之，将盖玻片上的CRFK细胞单层在37°C下接种FIPV II或FIPV-rQS79（MOI=0.01）24小时。用PBS洗涤后，我们将CRFK细胞在4%多聚甲醛中固定20分钟，然后在室温下在0.3%Triton-X-100中透化30分钟，并在37°C下用5%BSA封闭30分钟。用PBS洗涤后，我们在4°C下用抗FIPV N单克隆抗体孵育细胞过夜。用PBS吐温-20（PBST）洗涤3次后，我们将细胞与山羊抗兔488（1:1000）在37°C下孵育1.5小时。我们在室温下用DAPI（1:1000）再次孵育15分钟。然后用PBST洗涤三重染色的细胞三次，我们在高倍镜下捕获图像进行分析。

猫：在出现明确的FIP临床证据三天后（感染后12-19天），将10只出现疾病症状的猫分为两组，分别接受5 mg/kg（A组；n=5）或2 mg/kg（B组；n=5）的GS-441524皮下注射，每24小时一次。两只未出现任何疾病症状的猫作为对照组，用于检测正常的直肠温度和血液淋巴细胞计数[1]。

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GC376和GS441524的体内毒性研究[5]
毒性研究在4至6周龄的雌性BALB/c小鼠中进行。 BALB/c小鼠被随机分为四组（每组五只），一组为对照组（肌注溶剂），三组为给药组：GC376组（40 mM/l，100 µl）、GS441524组（40 mM/l，100 µl）和GC376+GS441524联合给药组（20 mM/l，100 µl）。对照组和给药组的小鼠连续15天每日称重。此外，分别于给药后0、5、10和15天采集血样。各项血液生化指标或血细胞计数均在武汉赛维生物科技有限公司进行检测。数据采用GraphPad Prism 7.0进行分析。

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GC376和GS441524的体内抗病毒研究[5]
首先，将6只4至6周龄的雌性BALB/c小鼠分为一组，分别肌注GC376（40或8 mM/l，100 µl）、GS441524（40或8 mM/l，100 µl）和GC376 + GS441524（20或4 mM/l，100 µl）负荷剂量，随后每日维持给药。或者，对小鼠进行鼻内单次给药（GC376，20 mM/l，50 µl；GS441524，20 mM/l，50 µl；GC376 + GS441524，10 mM/l，50 µl）或以下组合给药：GC376（20 mM/l，50 µl，鼻内给药；40 mM/l，100 µl，肌肉注射）、GS441524（20 mM/l，50 µl，鼻内给药；40 mM/l，100 µl，肌肉注射）和 GC376 + GS441524（10 mM/l，50 µl，鼻内给药；20 mM/l，100 µl，肌肉注射），随后每日给予维持剂量。作为对照，小鼠每日接受载体溶液（12%磺丁基醚-β-环糊精，pH 3.5）灌胃。在给予GC376、GS441524、GC376 + GS441524或载体溶液负荷剂量1小时后，每只小鼠经鼻内接种50 μl含10³.⁶ PFU HRB26M的病毒。每组各取3只小鼠于接种后第3天和第5天处死。收集鼻甲和肺组织，按照先前描述的方法进行qPCR和PFU检测。以含有SARS-CoV-2 N基因全长cDNA的质粒标准曲线对靶向SARS-CoV-2 N基因的vRNA量进行标准化。检测灵敏度为1000拷贝/ml。使用 Microsoft Excel 2016 和 GraphPad Prism 7.0 对数据进行分析。

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GC376 和 GS441524 在 BALB/c 小鼠和 SD 大鼠中的药代动力学研究[5]
本研究采用健康 SPF 级 BALB/c 小鼠（7-8 周龄）和 SD 大鼠（4-6 周龄）进行单剂量药代动力学研究。在零时点，A、B 和 C 组（每组包含 20 只 BALB/c 小鼠或 5 只 SD 大鼠）的 BALB/c 小鼠和 SD 大鼠分别接受 GC376（111 mg/kg）、GS441524（67 mg/kg）和 GC376 + GS441524（55.5 + 33.5 mg/kg）的肌注，这些剂量与体内抗病毒研究中的剂量相同。分别于0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时采集血液样本，置于预冷的聚丙烯离心管中，该离心管内含有3.0 µl 40% EDTAK2溶液。然后，将全血在4°C下以7800 g/min的转速离心10分钟。收集血浆并储存于-80°C冰箱中。采用LC-MS/MS分析血浆药物浓度。使用WinNonlin软件（6.4版）计算药代动力学参数，并采用非房室模型进行数据拟合。使用 Microsoft Excel 2016 和 GraphPad Prism 7.0 对数据进行分析。

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GC376 和 GS441524 在猫体内的药代动力学研究 [6]本研究在实验猫中开展，旨在确定口服 GS441524 和 GC376 的疗效。GS441524 以 12 mg/mL 的浓度溶解于 5% 乙醇、30% 丙二醇、45% PEG 和 20% 水的混合溶液中，并用浓盐酸调节 pH 至 1.9。所有动物随机分为以下三组：A 组（n ≥ 3；静脉注射），B 组（n ≥ 3；皮下注射），C 组（n ≥ 3；口服）。在零时点，A组猫静脉注射5 mg/kg体重的化合物，B组猫皮下注射5 mg/kg体重的化合物。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时，从每只猫的前肢桡静脉采集0.5 mL EDTA抗凝全血样本。采集后，立即将血样置于冰上，并以5000 rpm离心5分钟。将分离的血浆转移至1.5 mL微量离心管中，并于-80 °C冷冻保存，用于后续游离GS441524的分析。所有样品均采用液相色谱-单键串联质谱法（LC-MS/MS）检测浓度。

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经中和抗体检测确认无病毒后，将健康猫（1-3岁，2.0-4.5 kg）随机分为8组（每组4只）。同时，我们还检测了它们的肝肾功能，结果均正常，确保试验猫能够正常吸收和代谢药物。首先在猫传染性腹膜炎（FIP）模型中研究了口服GC376或GS441524的效果。病毒感染后，治疗组中感染FIPV-rQS79的动物分别口服GS441524（20 mg/kg、10 mg/kg或5 mg/kg）或GC376（150 mg/kg、100 mg/kg或15 mg/kg），溶于PBS缓冲液（500 µL）。对照组接受等体积的PBS。第0天，猫经口接种FIPV-rQS79（105 × TCID50，溶于DMEM培养基，1000 µL）进行感染。随后检测GC376和GS441524在感染发生后的治疗效果。动物的临床症状和存活率按先前所述进行监测，并每日评估猫的健康状况[6]。

吸收、分布和排泄
与瑞德西韦相比，GS-441524 进入细胞的转运能力较差。

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代谢/代谢物
GS-441524 经 3 次磷酸化形成活性核苷三磷酸。

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不同给药途径和不同剂量下 GS441524 和 GC376 的药代动力学[6]
为了确定 GC376 和 GS441524 的口服剂量，我们测试了健康成年猫经不同给药途径（包括皮下、口服和静脉注射）给药后的药代动力学。图2A和2C分别展示了GS441524和GC376在不同给药途径后的浓度-时间曲线。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）检测药代动力学样品中的药物浓度。结果表明，口服GS441524的药时曲线下面积与皮下注射相同，表明改变给药途径不影响药物吸收；因此，GS441524可以按照文献报道的剂量进行口服给药。相比之下，口服GC376的吸收率显著低于皮下注射；因此，口服GC376可能需要更高的剂量。由于GS441524的溶解度较低，我们假设药物溶解度的降低会影响其吸收。为了验证这一假设，我们评估了以粉末或溶液形式给药的GS441524和GC376的药代动力学差异。结果显示，与液体GS441524相比，GS441524粉末的药物吸收率显著降低；然而，口服和皮下注射GS441524的药物AUC值无显著差异（图2 G和H）。相反，与液体GC376相比，GC376粉末的药物吸收率无变化；然而，口服和皮下注射GC376的药物吸收率存在显著差异（图2 E和F）。在本研究中，该溶液被用作后续动物试验的主要剂型。

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GC376 和 GS441524 单独或联合用药的药代动力学研究[5]
为了进一步检验 GC376 和 GS441524 的潜力，我们评估了 SPF BALB/c 小鼠和 SD 大鼠在肌注 GC376 (111 mg/kg)、GS441524 (67 mg/kg) 和 GC376 + GS441524 (55.5 + 33.5 mg/kg) 后的药代动力学 (PK) 特性，这些剂量与体内抗病毒研究中的剂量相同。在小鼠中，药代动力学结果显示，肌注GC376和GS441524后均被迅速吸收，血浆峰浓度分别在注射后0.22 ± 0.07 h和0.80 ± 0.24 h达到（图5A、B和表1）。由于GC376的肌注剂量约为GS441524的1.7倍，我们发现GC376的最大血浆药物浓度（Cmax）（46.70 ± 10.69 μg/ml）约为GS441524（39.64 ± 2.93 μg/ml）的1.2倍（表1）。然而，GS441524 的曲线下面积 (AUC0−t) 值 (AUC0−t = 106.82 ± 16.79) 约为 GC376 (AUC0−t = 55.29 ± 11.26) 的 1.9 倍。同时，我们观察到 GC376 的血浆清除率 (CL/F，1985 ± 485 ml/h/kg) 约为 GS441524 (CL/F，639 ± 119 ml/h/kg) 的 3.1 倍（表 1）。此外，SD 大鼠的药代动力学结果显示，GC376 和 GS441524 的达峰时间 (Tmax) 分别为 1.30 ± 0.60 小时和 2.00 ± 1.10 小时（图 5D、E 和表 2）。与小鼠相比，GS441524在SD大鼠体内的利用效率显著高于GC376。我们发现，GC376的血浆药物最大浓度（Cmax）（12.56 ± 1.90 μg/ml）约为GS441524（30.96 ± 8.40 μg/ml）的2.5倍（表2）。GS441524的曲线下面积（AUC0−t）（AUC0−t = 183.33 ± 64.36）约为GC376（AUC0−t = 92.14 ± 9.99）的2.0倍。我们还观察到，血浆中 GC376 (CL/F, 1208 ± 122 ml/h/kg) 的清除率约为 GS441524 (CL/F, 423 ± 186 ml/h/kg) 的 2.9 倍。

GC376 和 GS441524 在 Vero E6 细胞中浓度高达 250 μM 时未表现出明显的细胞毒性（CC50 > 250 μM；补充图 3）。[5]

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通过 CCK-8 法测定了 GC376 和 GS441524 的潜在细胞毒性。在 CRFK 细胞中，这两种化合物在浓度高达 100 μM 时均未显示出明显的细胞毒性（图 1 C 和 F）。[6]

[1]. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. 2018 Jun;219:226-233.

[2]. What Do We Know About Remdesivir Drug Interactions? Clin Transl Sci. 2020 May 13;10.1111/cts.12815.

[3]. Advantages of the Parent Nucleoside GS-441524 over Remdesivir for Covid-19 Treatment. ACS Med. Chem. Lett. 2020.
[4]. https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/2472555220942123

[5]. The preclinical inhibitor GS441524 in combination with GC376 efficaciously inhibited the proliferation of SARS-CoV-2 in the mouse respiratory tract. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):481-492.

[6]. Better therapeutic effect of oral administration of GS441524 compared with GC376. Vet Microbiol. 2023 Aug:283:109781.

GS-441524 是一种 C-核苷类似物，其结构为 (2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-腈，在 2 位被 4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基取代。它是瑞德西韦的活性代谢物，对包括丙型肝炎病毒 (HCV)、副流感病毒和 SARS-CoV 在内的多种 RNA 病毒具有广泛的抑制活性。它可作为药物代谢物、抗病毒剂和抗冠状病毒剂发挥作用。它是一种吡咯并三嗪类化合物、腈类化合物、C-核苷类化合物和芳香胺类化合物。
GS-441524 是一种腺苷核苷酸类似物抗病毒药物，与瑞德西韦类似。该分子于2009年获得专利。体外研究表明，GS-441524 对多种病毒的 EC50 值高于瑞德西韦，这意味着 GS-441524 的效力较低。GS-441524 目前仍在研究用于治疗猫传染性腹膜炎病毒（一种仅感染猫的冠状病毒）。

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作用机制
GS-441524 经 3 次磷酸化形成活性核苷三磷酸，该核苷三磷酸可整合到病毒颗粒的基因组中，从而终止病毒复制。

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这些结果表明，GS441524 在体内的利用效率显著高于 GC376。这一发现可能是 GC376 在体内抑制 SARS-CoV-2 能力较差的原因之一。先前的研究结果表明，靶向FIPV 3CLpro的GC376能够有效降低猫腹水巨噬细胞中的病毒载量，且该作用与抗病毒治疗持续时间相关[17,19]。因此，我们推测GC376能够有效抑制冠状病毒（FIPV和SARS-CoV-2）的增殖，但无法快速清除感染组织中的病毒。在持续给药过程中，GC376需要长时间维持有效浓度才能抑制感染组织中的病毒增殖。然而，与GS441524相比，GC376在BALB/c小鼠和SD大鼠体内能够被快速清除。此外，鼻甲和肺是SARS-CoV-2增殖的主要靶器官，这些组织中存在大量的SARS-CoV-2。因此，GC376 难以完全抑制 SARS-CoV-2 在小鼠鼻甲和肺部的增殖。
此外，我们发现 GC376 与 GS441524 联合应用可将 SPF BALB/c 小鼠的 T1/2 从 1.51 ± 0.16 小时延长至 1.67 ± 0.24 小时，并将 GS441524 的停留时间（MRT0−t 从 2.07 ± 0.42 小时延长至 2.37 ± 0.73 小时）延长（图 5C 和表 1）。同样，药代动力学结果显示，GC376与GS441524联合应用可使SPF级SD大鼠的T1/2从3.80 ± 1.17 h延长至5.13 ± 2.56 h，GS441524的滞留时间（MRT0−t）从4.50 ± 1.11 h延长至6.03 ± 1.37 h（图5F和表2）。此外，药代动力学研究结果表明，GC376达到Cmax的时间（小鼠中Tmax = 0.25 h，SD大鼠中Tmax = 1.40 ± 0.49 h）早于GS441524（小鼠中Tmax = 0.55 ± 0.24 h，SD大鼠中Tmax = 3.40 ± 1.20 h），从而产生协同效应（图5C、F）。当这些药物联合使用时，GC376 是第一个抑制 SARS-CoV-2 复制的药物。在 GC376 的血浆浓度下降后，GS441524 达到其 Cmax（图 5C、F 和表 1、2），从而持续抑制 SARS-CoV-2 的增殖，并维持更长时间的有效浓度。这一现象或许可以解释为什么 GC376 和 GS441524 联合应用优于单独使用。
总之，我们使用小鼠适应性病毒感染模型评估了 GC376 和 GS441524 抑制 SARS-CoV-2 复制的疗效。重要的是，我们发现鼻内给药GS441524和GC376+GS441524均能显著抑制病毒在上呼吸道的复制，且GC376+GS441524抑制病毒在下呼吸道复制的效果显著优于GS441524。鼻内和肌肉注射GS441524和GC376+GS441524联合给药能有效保护小鼠免受HRB26M病毒在上呼吸道和下呼吸道的感染，但单独使用GC376未能抑制SARS-CoV-2在小鼠体内的增殖。与单独使用GC376或GS441524相比，GC376+GS441524的剂量减半，这些结果表明Mpro和RdRp抑制剂联合应用具有叠加效应，因此应进一步开发并考虑用于未来的临床实践。[5]

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由猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）引起的猫传染性腹膜炎（FIP）威胁猫的健康。GS441524和GC376通过抑制病毒复制对FIPV有效，但皮下注射给药方式存在局限性，口服给药具有患者依从性好、方便、成本低、易于储存等优点（Shriya S. Srinivasan，2022）。口服给药有望成为FIP治疗的新方法。因此，我们的研究证实了口服GS441524和GC376在体内外对致死性重组FIPV-rQS79的疗效。
首先，我们证实这两种药物在细胞培养中能有效抑制两种FIPV病毒。这两种药物在体外均对FIPV-rQS79型和FIPV II型具有广谱抗病毒作用。药代动力学(PK)与药效学密切相关。药代动力学测试可以确定与猫相关的药物过程（吸收、分布、代谢和排泄）（Asif等，2005）。通过药代动力学研究，我们发现与GS441524相比，GC376的代谢速度更快。与GS441524相比，GC376的血浆消除半衰期也更短，平均滞留时间(MRT)更短。与皮下注射相比，口服GC376显著提高了总清除率和表观分布容积（P < 0.0001）。GC376是一种共价肽模拟抑制剂，它可能由肽抑制剂修饰而来，因此存在更多不稳定的化学键。既往研究也表明，亚硫酸氢盐加合物在水中易转化为醛基形式，而醛基形式又易发生差向异构化，形成活性抑制性立体异构体（Vuong et al., 2021）。以上两点提示，使用GC376可能导致临床疗效不佳。然而，使用GS441524时，皮下注射和口服给药途径的这些药代动力学参数无显著差异。GS441524表现出良好的药代动力学参数，皮下注射和口服给药的GS441524均具有相同的药时曲线下面积（生物利用度相同）。本研究与以往在人和小鼠中的报道有所不同，因为不同物种的口服生物利用度差异很大，大鼠的F值为33%，犬为85%，食蟹猴为8.3%（Davis et al., 2021; Humeniuk et al., 2020; Li et al., 2022; Wei et al., 2021; Xie and Wang, 2021）。结果表明，代谢差异是这些药物体内作用差异的原因之一。这些结果初步解释了GS441524在体内疗效优于GC376的原因。溶解度是影响药物吸收的因素之一，由于GS441524的溶解度较低，我们推测制剂因素也对其口服吸收有影响。结果表明，与口服液体GS441524相比，口服GS441524粉剂的药物吸收率显著降低；然而，GS441525的口服和皮下给药途径的药物吸收率无显著差异。相反，与口服液体GC376相比，口服GC376粉剂的药物吸收率未发生改变。因此，溶解度影响GS441524的吸收，但不影响GC376的吸收。
体内研究发现，口服GS441524无论剂量如何均有效，而口服GC376仅在高剂量（150 mg/kg）下有效。尽管这两种药物在体外均具有良好的抑制作用，但它们在体内的作用却存在显著差异。
药物可通过多种途径进入体内，包括肠内、肠外和局部给药途径。每种给药途径都有其特定的目的、优势和劣势。从根本上讲，药物靶点的可及性和药物治疗的有效性都与给药途径密切相关。
在各种给药途径中，口服给药因其诸多优势而备受关注，包括患者依从性高、方便、成本低、易于储存、运输和给药（Mignani et al., 2013）。尽管口服给药是小分子药物的最佳给药方式，但其应用也存在一些局限性。与其他给药途径相比，口服给药后的药物吸收机制更为复杂，并受多种因素影响（例如胃肠动力、胃排空速率和食物的存在）。口服药物必须克服胃部的强酸性环境，能够溶解于胃液中，并在动态的肠道菌群中保持稳定；此外，这些药物还必须避免降解酶的降解，并能穿透粘稠的黏液屏障和外排泵，才能达到治疗所需的生物利用度（Srinivasan et al., 2022）。克服这些障碍并非易事。除了口服途径外，该药物还可以通过皮下微血管注射进入循环系统发挥作用；因此，这种给药方式起效相对较快，但也具有刺激作用，且对动物而言较为痛苦。此外，注射液的生产成本和质量要求也较高。这些给药途径的差异会导致药物吸收和代谢的差异。
因此，我们应该综合考虑各种因素，选择更优的给药途径。同时，药代动力学为临床用药提供了指导。药代动力学数据还可以为药物结构优化提供思路。我们可以通过结构修饰进一步降低化合物的现有缺点，并有望开发出更具优势的抗FIPV化合物。例如，Liu等人对GC376的结构进行了优化，发现苄基的进一步修饰可以增强其与Mpro的键合，甚至形成额外的氢键。化合物NK-0163的优势在于其在肺等重要组织中具有较长的半衰期，尽管卤素取代可能改变了其药代动力学（Liu et al, 2022）。Quan等人报道，一系列强效的含α-酮酰胺的化合物，特别是Y180，在啮齿动物和非啮齿动物中均具有优异的生物利用度（Quan et al., 2022）。
先前的研究也报道，GS441524具有良好的抗病毒活性，并具有口服给药的潜力。然而，其不利的口服药代动力学阻碍了其进一步开发为口服药物（Li et al., 2022）。为了解决这个问题，Wei等人……据报道，一系列GS441524类似物（碱基或糖基部分进行了修饰）以及一些前药形式，其中3′-异丁酰酯5a、5′-异丁酰酯5c和异丁酰酯5g氢溴酸盐的口服生物利用度优于GS441524（分别为71.6%、86.6%和98.7%）（Wei等，2021）。上述GC376和GS441524的修饰可进一步研究，有望提高GC376和GS441524对FIPV患者的治疗效果。
总之，本研究首次报道了口服GS441524和GC376可有效治疗动物模型中的FIPV感染。我们的研究表明，口服给药可以替代皮下注射，尽管我们仍需通过新的方法或途径解决现有问题。总体而言，GS441524 和 GC376 完全抑制了 CRFK 细胞中 FIPV-rQS79 和 FIPV II 的复制。我们的研究还验证了口服 GC376 和 GS441524 的疗效，并证实了 GS441524 和 GC376 的口服生物利用度。通过药代动力学 (PK) 研究，我们确定了这两种药物在猫体内的吸收、分布、代谢和排泄情况。此外，PK 结果进一步解释了两种药物体内疗效差异的原因，并为药物优化和转化提供了思路和方向。[6]

C12H14CLN5O4

327.723660945892

C, 43.98; H, 4.31; Cl, 10.82; N, 21.37; O, 19.53

2378280-82-9

1191237-69-0;2378280-82-9 (HCl);2378280-83-0 (sulfate);

Typically exists as solid at room temperature

RUKJXQWRCFJDMA-BITRNDABSA-N

InChI=1S/C12H13N5O4.ClH/c13-4-12(10(20)9(19)7(3-18)21-12)8-2-1-6-11(14)15-5-16-17(6)8/h1-2,5,7,9-10,18-20H,3H2,(H2,14,15,16)1H/t7-,9-,10-,12+/m1./s1

(2R,3R,4S,5R)-2-(4-aminopyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-7-yl)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-carbonitrile hydrochloride

GS-441524 HCl; GS-441524 hydrochloride; GS-441524; GS441524; GS 441524; Remdesivir-metabolite, GS-5734-metabolite; GS5734-metabolite; GS 5734-metabolite

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。