GSK484 free base

PAD4 (IC50 = 50 nM, in the absence of Calcium); PAD4 (IC50 = 250 nM, in the presence of 2 mM Calcium)
PAD4 (peptidylarginine deiminase 4); IC50 = 50 nM in the absence of calcium, IC50 = 250 nM in the presence of 2 mM calcium (FP binding assay) [1]; also inhibits PAD4 citrullination activity in a concentration-dependent manner in the presence of 0.2 mM calcium (NH3 release assay) [1]. Highly selective over PAD1, PAD2, PAD3, and PAD6 (no specific IC50 values provided for other family members) [1].

在无钙（0 mM）和有钙（2 mM）条件下，GSK484 盐酸盐分别以高亲和力与低钙型 PAD4 结合，IC50 值分别为 50 nM 和 250 nM。使用 NH3 释放试验，GSK484 盐酸盐还显示出浓度依赖性地抑制苯甲酰精氨酸乙酯 (BAEE) 底物上 PAD4 的酸化（在 0.2 mM 钙浓度下）[1]。

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GSK484 游离碱（CAS#: 1652629-23-6） 在荧光偏振配体结合试验中抑制 PAD4，IC50 值分别为 50 nM（无钙）和 250 nM（2 mM 钙）[1]。质谱和透析证实其与 PAD4 的结合是可逆的[1]。在以BAEE为底物（0.2 mM钙）的功能性氨释放测定中，GSK484以浓度依赖的方式抑制PAD4介导的瓜氨酸化[1]。在小鼠中性粒细胞中，10 μM GSK484预处理可显著降低离子霉素诱导的组蛋白H3过度瓜氨酸化和NET形成；观察到这些终点的降低呈剂量依赖性[1]。在用金黄色葡萄球菌刺激的人中性粒细胞中，与溶剂对照组相比，10 μM GSK484可导致弥散性NETs显著减少，而剩余的弥散性NETs缺乏瓜氨酸化[1]。GSK484对人或小鼠中性粒细胞或金黄色葡萄球菌培养物的活力没有影响[1]。在稳定表达FLAG标签PAD4的HEK293细胞中，100 μM GSK484可抑制瓜氨酸化[1]。在荷瘤小鼠中，GSK484 治疗（每天腹腔注射 4 mg/kg，持续一周）可抑制外周血中发生 NETosis 的中性粒细胞数量增加，这可通过 Gr1 染色和 Hoechst DNA 染色检测到，显示粒细胞具有外化的 DNA 尾 [2]。

为了研究PAD4抑制剂是否能减轻癌症相关的肾损伤，研究人员给MMTV-PyMT小鼠每天注射4 mg/kg的PAD4染料GSK484盐酸盐，持续一周。结果显示，MMTV-PyMT小鼠的总蛋白水平显著低于未接受常规治疗的荷瘤小鼠，这进一步证实了GSK484盐酸盐给药后肾功能得到改善。在荷瘤动物中，每日腹腔注射4 mg/kg GSK484盐酸盐一周后，肾功能最终恢复至与DNase I治疗相同的程度，且未观察到明显的毒性[2]。在MMTV-PyMT乳腺癌和RIP1-Tag2胰腺神经内分泌肿瘤荷瘤小鼠中，每日腹腔注射4 mg/kg GSK484游离碱（CAS#: 1652629-23-6）一周可预防癌症相关的肾损伤。治疗组小鼠血浆肌酐水平未升高（所有数值均在健康范围内），尿液总蛋白水平较未治疗的荷瘤小鼠显著降低，肾脏血管灌注恢复（通过FITC-凝集素灌注和CD31染色测定）。 GSK484治疗可抑制肿瘤诱导的肾脏促炎细胞因子IL-1β和IL-6以及内皮细胞活化标志物E-选择素、ICAM-1和VCAM-1的表达升高，使其恢复至健康小鼠的水平或更低。电镜分析显示，GSK484治疗后肾脏足细胞足突恢复正常。治疗7天后，观察到系膜细胞增生有抑制的趋势。未报告任何可检测到的毒性迹象。[2]

FP结合亲和力研究[2]
在含有10 nM GSK215的测定缓冲液（100 mM HEPES，pH 8，50 mM NaCl，5%甘油，1 mM CHAPS，1 mM DTT）中，PAD4在不同钙浓度（0、0.2、2和10 mM）下进行系列稀释。孵育50分钟后，使用单一位点饱和曲线确定每种钙浓度下的表观Kd值。为了确定IC50值，将测试化合物在DMSO中进行系列稀释（最终测定浓度为1%），并在相同测定缓冲液和体积中，在含有PAD4（浓度为每种钙条件下计算的Kd值）和10 nM GSK215的条件下，测试相同钙浓度范围。反应孵育 50 分钟后，使用四参数逻辑方程计算 IC50 值。

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PAD4 功能测定[2]
根据已发表的方法²⁶，通过氨释放检测瓜氨酸化。将 PAD4 稀释至 30 nM，溶于测定缓冲液（100 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM DTT、0.6 mg/mL BSA，pH 8），并加入到含有不同浓度化合物或 DMSO 溶剂（终浓度 0.8%）的高容量黑色 384 孔板（Greiner）的孔中。室温预孵育 30 分钟后，加入底物（3 mM N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 (BAEE)，溶于 100 mM HEPES、50 mM NaCl、600 µM CaCl₂、2 mM DTT，pH 8）启动反应。反应进行60分钟后，加入含有50 mM EDTA、2.6 mM邻苯二甲醛和2.6 mM DTT的终止/检测缓冲液终止反应。将反应体系在室温下孵育90分钟，然后在Envision酶标仪上测量荧光强度（激发波长λex 405 nm/发射波长λem 460 nm）。荧光偏振（FP）配体结合实验：将PAD4在含有不同钙离子浓度（0、0.2、2和10 mM）和10 nM荧光示踪剂GSK215的实验缓冲液（100 mM HEPES pH 8、50 mM NaCl、5%甘油、1 mM CHAPS、1 mM DTT）中进行系列稀释。孵育50分钟后，测定表观Kd值。为测定 IC50 值，将包括GSK484 游离碱 (CAS#: 1652629-23-6)在内的测试化合物用 DMSO 进行系列稀释（终浓度为 1%），并在相同钙浓度下，于 PAD4（根据每种钙条件计算 Kd 值）和 10 nM GSK215 存在下进行测试。孵育 50 分钟后，使用四参数逻辑方程 [1] 计算 IC50 值。
PAD4 功能性氨释放测定：将 PAD4 用测定缓冲液（100 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM DTT、0.6 mg/mL BSA、pH 8）稀释至 30 nM，并加入含有不同浓度化合物或 DMSO 溶剂（终浓度为 0.8%）的孔中。室温预孵育 30 分钟后，加入底物（3 mM N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 (BAEE)，溶于 100 mM HEPES、50 mM NaCl、600 μM CaCl2、2 mM DTT，pH 8）启动反应。60 分钟后，加入含有 50 mM EDTA、2.6 mM α-邻苯二甲醛和 2.6 mM DTT 的终止/检测缓冲液终止反应。室温孵育 90 分钟后，测量荧光强度（λex405/λem460）[1]。
稳态瓜氨酸生成测定：将不同浓度的 BAEE 溶于反应缓冲液（50 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM DTT、10 mM CaCl2）中，于 37°C 预孵育 10 分钟，然后加入 PAD 同工酶（0.2-0.5 μM）。37°C 孵育 6 分钟后，将样品置于液氮中冷冻，并使用 COLDER 法定量瓜氨酸水平。初始反应速率符合米氏方程。对于抑制研究，数据分别拟合竞争性抑制、非竞争性抑制或混合抑制方程。 GSK484 表现出混合型抑制模式 [1]。
质谱可逆性研究：将 10 μM 测试化合物（包括 GSK484）与 2 μM PAD4 在含有或不含 10 mM 钙的测定缓冲液（100 mM HEPES pH 8、50 mM NaCl、5% 甘油、1 mM CHAPS）中孵育过夜。使用飞行时间质谱仪分析样品以确定共价结合情况。GSK484 显示可逆结合（无共价加合物）[1]。
透析可逆性研究：将 2 μM PAD4 与 100 μM GSK199（结构相似）在 37°C 下孵育 1 小时。取一部分进行残余活性测定。将剩余酶在 4°C 下用储存缓冲液透析 18 小时，然后重新测定活性。可逆性已得到证实[1]；GSK484 预计具有类似的机制[1]。

将小鼠颈椎脱臼处死后，解剖取出肾脏，并在4℃下用2.5%戊二醛固定过夜（健康组，n = 2；MMTV-PyMT组，n = 2；MMTV-PyMT + DNase I组，n = 3；MMTV-PyMT + GSK484组，n = 3）。使用Agar 100树脂包埋剂包埋组织，并切取50-60 nm厚的超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色。使用配备ORIUS™ SC200 CCD相机的Technai G2电子显微镜进行成像。分析由一位经认证的病理学家和一位经过专门培训的研究人员完成，他们对治疗和结果数据均不知情[2]。

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小鼠中性粒细胞分离和NET检测：通过密度梯度离心分离小鼠外周血中性粒细胞，然后进行低渗裂解（纯度>90%）。将细胞在含有 10 mM HEPES 的 RPMI 培养基中于 37°C 孵育，并使其贴壁于玻璃底孔板中 15 分钟。加入 GSK484 游离碱（CAS#: 1652629-23-6）或溶剂，孵育 20 分钟后，用 4 μM 离子霉素刺激 2 小时。细胞用 2% PFA 固定，进行透化、封闭，并用抗瓜氨酸化组蛋白 H3 抗体（0.3 μg/mL）染色，随后用 Alexa Fluor 488 标记的二抗染色。细胞核用 Hoechst 33342 复染。采集并分析荧光图像。GSK484 (10 μM) 可显著减少 H3Cit+ 细胞和 NET 的形成；观察到剂量依赖性降低[1]。
人中性粒细胞NET（NET）试验（金黄色葡萄球菌）：使用葡聚糖密度梯度离心和Ficoll从外周血中分离人中性粒细胞（纯度>90-95%）。将细胞接种于96孔板（2.5×10^4个细胞/孔），在RPMI培养基中于37℃孵育20分钟使其贴壁，然后用GSK484或溶剂（0.1% DMSO）预孵育30分钟。加入5倍MOI的金黄色葡萄球菌。刺激3小时后，用2% PFA固定细胞，并用Hoechst 33342染色。使用Opera共聚焦显微镜成像，并使用算法将细胞分类为分叶状、去分叶状或弥散状NET。与载体组相比，GSK484 (10 μM) 可显著降低弥散性中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 的含量 [1]。
人中性粒细胞瓜氨酸化成像分析：将分离的人中性粒细胞 (3.5×10^5/mL) 与化合物在 384 孔板中于 37°C 孵育 45 分钟，然后用 2 μM 钙离子载体刺激 60 分钟。细胞用 1.3% 多聚甲醛固定，进行透化、封闭，并用小鼠抗 H3Cit 单克隆抗体 (6 μg/mL) 染色，随后用 Alexa Fluor 488 标记的羊抗小鼠 IgG 染色，最后用 Hoechst 33342 复染。使用 IN Cell Analyzer 2000 成像，并以中性粒细胞核内的 FITC 强度作为 H3 瓜氨酸化的指标。 GSK484 可降低 H3 瓜氨酸化水平 [1]。
中性粒细胞活力检测：将人源和鼠源中性粒细胞与化合物单独孵育，孵育时间与 NET 研究相同，并使用 Cell Titer Glo 试剂盒评估细胞活力。GSK484 对细胞活力无影响 [1]。
HEK293 细胞瓜氨酸化检测：将稳定表达 N 端 FLAG 标签 PAD4 的 HEK293 细胞在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解。将裂解液分别与 2% DMSO、100 μM GSK484 或对照品在 4°C 下预孵育 20 分钟。在 2 mM 钙离子存在下，于 37°C 进行 30 分钟的瓜氨酸化反应。通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，转移至 PVDF 膜，对瓜氨酸化蛋白质进行化学修饰，并使用抗修饰瓜氨酸抗体进行检测。 GSK484抑制瓜氨酸化[1]。
中性粒细胞胞外DNA尾的细胞涂片分析：将荷瘤小鼠经GSK484（4 mg/kg，每日腹腔注射，持续一周）治疗后的柠檬酸盐抗凝血离心，裂解红细胞，并将剩余细胞用于细胞涂片制备。玻片用抗Gr1抗体（1:300）染色以识别中性粒细胞，用Hoechst染色以识别DNA。GSK484治疗抑制了胞外DNA尾粒细胞数量的增加[2]。

小鼠每日接受腹腔注射PAD4抑制剂GSK484（4 mg/kg）治疗。GSK484溶于99.9%乙醇，配制成浓度为25 mg/mL的储备液，并在注射前不久用0.9%氯化钠溶液进一步稀释1:50，每只小鼠注射200 μL[2]。

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对于荷瘤小鼠（MMTV-PyMT乳腺癌和RIP1-Tag2胰腺神经内分泌癌模型）的GSK484游离碱（CAS#: 1652629-23-6）治疗：GSK484溶于99.9%乙醇，配制成浓度为25 mg/mL的储备液，然后在注射前不久用0.9%氯化钠溶液进一步稀释1:50。小鼠每日腹腔注射4 mg/kg剂量，每只小鼠注射200 μL，持续一周（7天）[2]。肾功能分析采用心脏穿刺法采集血液样本，使用柠檬酸盐作为抗凝剂，并通过连续离心制备血浆[2]。灌注分析中，将FITC标记的凝集素（100 μg溶于100 μL PBS）经眼眶后注射给药，使其循环2-3分钟，随后用10 mL PBS和10 mL 2% PFA进行心脏灌注固定。解剖肾脏并进行冰冻切片处理[2]。中性粒细胞分析中，采集血液并按所述方法制备细胞涂片[2]。

在接受腹腔注射4 mg/kg GSK484游离碱（CAS号：1652629-23-6）治疗一周的荷瘤小鼠中，未观察到任何可检测到的毒性迹象[2]。GSK484在浓度高达10 μM时，对体外培养的人或小鼠中性粒细胞的活力没有影响[1]。对金黄色葡萄球菌培养物也没有影响[1]。对包括半胱氨酸利用酶和染色质修饰酶（例如组蛋白去乙酰化酶1-11，在100 μM浓度下抑制率<50%）在内的50种无关蛋白没有脱靶活性。与GSK199不同，GSK484即使在100 μM浓度下也不会激活HDAC1-11[1]。

[1]. Lewis\nHD, et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse\nand human NET formation. Nat Chem Biol. 2015 Mar;11(3):189-91.

[2]. Cedervall\nJ, et al. Pharmacological targeting of peptidylarginine deiminase 4\nprevents cancer-associated kidney injury in mice. Oncoimmunology. 2017\nApr 20;6(8):e1320009.

通过临床遗传学和基因敲除小鼠研究，PAD4已被证实与自身免疫性疾病、心血管疾病和肿瘤的发病机制密切相关。一种新型选择性PAD4抑制剂可与钙缺乏的PAD4酶结合，据我们所知，这是首次证实人和小鼠PAD4在组蛋白瓜氨酸化和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成中的关键酶促作用。PAD4抑制剂的治疗潜力现在可以得到探索。[1]

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肾功能不全是一种常见的癌症相关并发症，超过一半的癌症患者在确诊时即存在肾功能不全。为了最大限度地减少肾毒性，这些患者通常接受较低剂量的抗癌药物，导致治疗效果不佳。尽管这种癌症相关病理十分严重，但其分子机制和治疗方案仍知之甚少。本文证明，肿瘤诱导的血管内中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成是荷瘤小鼠肾损伤的原因之一。肾功能临床生物标志物分析显示，荷瘤小鼠的肌酐清除率降低，尿总蛋白水平升高。荷瘤小鼠肾脏的电镜观察显示，存在可逆性病理改变，例如系膜细胞增殖，但未观察到纤维化或坏死等永久性损伤。使用DNase I清除NETs或药理学抑制肽基精氨酸脱亚胺酶4 (PAD4) 足以恢复荷瘤小鼠的肾功能。PAD4抑制剂可以逆转肿瘤诱导的全身炎症和外周血管灌注受损。总之，本研究发现NETosis是癌症相关肾功能障碍的一个先前未知的原因，并描述了一种预防癌症患者肾衰竭的新型有效方法。 [2]

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GSK484 游离碱（CAS#: 1652629-23-6） 是一种首创的高选择性可逆 PAD4 抑制剂。它与 PAD4 的低钙构象结合，诱导残基 633-645 形成一种新型 β-发夹结构，该结构在抑制剂表面形成疏水盖，从而解释了其相对于其他 PAD 家族成员（PAD1-3,6）的高特异性，因为 Phe634 残基在其他人类 PAD 中并不保守 [1]。对于底物 BAEE，其结合模式为混合型抑制，因为该抑制剂稳定了一种无活性的、缺钙的酶构象 [1]。GSK484 通过抑制肿瘤诱导的血管内 NETosis、改善肾脏灌注、减轻炎症和恢复肾小球结构（足细胞足突），从而预防小鼠癌症相关的肾损伤 [2]。它还能降低长期治疗后的系膜细胞增生[2]。这些发现表明，该疗法在预防癌症患者的肾衰竭、深静脉血栓形成和转移方面具有潜在的治疗应用价值[2]。

C27H31N5O3

473.566745996475

473.243

1652629-23-6

1652629-23-6 1652591-81-5 (HCl)

86340175

Typically exists as solid at room temperature

3.785

98.54

2

5

5

35

780

2

O[C@@H]1CCN(C(C2C=C(C3=C(C=2)N=C(C2=CC4C=CC=CC=4N2CC2CC2)N3C)OC)=O)C[C@@H]1N

BDYDINKSILYBOL-WMZHIEFXSA-N

InChI=1S/C27H31N5O3/c1-30-25-20(11-18(13-24(25)35-2)27(34)31-10-9-23(33)19(28)15-31)29-26(30)22-12-17-5-3-4-6-21(17)32(22)14-16-7-8-16/h3-6,11-13,16,19,23,33H,7-10,14-15,28H2,1-2H3/t19-,23+/m0/s1

[(3S,4R)-3-amino-4-hydroxypiperidin-1-yl]-[2-[1-(cyclopropylmethyl)indol-2-yl]-7-methoxy-1-methylbenzimidazol-5-yl]methanone

CHEMBL4539512; GSK-484; GSK 484; ((3S,4R)-3-amino-4-hydroxypiperidin-1-yl)(2-(1-(cyclopropylmethyl)-1H-indol-2-yl)-7-methoxy-1-methyl-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)methanone; GTPL8577; SCHEMBL18247692; GSK 484;GSK-484;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。