Ikarugamycin   中文名称: 斑鸠霉素

CME/clathrin-mediated endocytosis
Clathrin-mediated endocytosis (CME) and multiple microbial targets. Ikarugamycin inhibits clathrin-mediated endocytosis, a key cellular uptake mechanism. It also shows antimicrobial activity against bacteria and fungi.

伊卡鲁霉素在H1299细胞中的半衰期为2.7 μM [1]。
伊卡鲁霉素（IKA）是一种先前发现的抗生素，已被证实能够抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取。此外，一些研究小组曾利用IKA抑制植物细胞系中的网格蛋白介导的内吞作用（CME）。然而，IKA的详细特性尚未得到充分研究。因此，我们进行了生物化学和显微镜实验，以进一步表征IKA对CME的影响。结果表明，IKA在H1299细胞中的IC50为2.7 μM，并且在多种细胞系中能够急性抑制CME，但对其他内吞途径没有影响。尽管长期与IKA孵育会产生细胞毒性作用，但其对CME的短期抑制作用是可逆的。因此，IKA 可作为研究内吞运输途径的有效工具[1]。体外实验表明，伊卡鲁霉素具有抗菌、抗真菌和抗原生动物活性。它能抑制网格蛋白介导的内吞作用，而网格蛋白介导的内吞作用常被用作研究细胞生物学中内吞途径的工具。该化合物对多种癌细胞系具有抗癌活性，并具有抗病毒特性。详细的 IC₅₀ 值可在相关文献中找到。

伊卡鲁霉素已在动物模型中进行了体内抗菌和抗癌活性评估。该化合物的生物活性和独特结构使其成为药物研发的重要先导化合物。有关体内疗效的更多详细信息，请参阅相关研究文献。

全内反射荧光显微镜[1]
使用稳定表达 eGFP-CLCa 的 ARPE-19 细胞进行全内反射荧光 (TIRF) 显微镜成像，成像设备为配备完美聚焦系统的 Ti-Eclipse 倒置显微镜，并安装了 100×1.49 NA Apo TIRF 物镜。成像过程中，细胞培养于不含酚红的培养基中，培养基中添加或不添加 4 µM 伊卡鲁霉素 (IKA)（对照组）。使用像素尺寸为 6.5 µm 的 pco-edge 5.5 sCMOS 相机，以 1 帧/秒的帧速率和 150 ms 的曝光时间采集不同细胞的延时图像序列。细胞在成像前用 4 µm 的伊卡鲁霉素 (IKA) 处理 3 小时，或不处理（对照组），然后立即成像。
使用 Matlab (MathWorks) 和自定义软件对 CCP 动态进行图像和数据分析。该软件的最新版本可在 http://lccb.hms.harvard.edu/software.html 获取。

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电子显微镜[1]
剥离法[1]
将细胞接种到涂有胶原蛋白的电镜载网（200 目碳膜金 - Electron Microscopy Sciences）上，并在正常培养条件下过夜使其贴壁。向细胞中加入所需浓度的伊卡鲁霉素 (IKA)，孵育 3 小时，然后清洗贴壁细胞的载网，并进行剥离法成像。用冷的PBS缓冲液（20 mM磷酸钠，pH 7.4，150 mM氯化钠）洗涤后，将贴附有细胞的网格用0.5% (v/v)多聚甲醛(PFA) PBS溶液轻度固定2分钟。然后用PBS缓冲液和低渗缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.2，含25 mM氯化钾和2.5 mM醋酸镁）洗涤网格。最后一次用低渗缓冲液洗涤后，让细胞略微膨胀10-15分钟。然后迅速将网格细胞面朝下放置在预先涂有聚赖氨酸的盖玻片上。用一小块滤纸吸走网格上的水分，同时快速地将网格从盖玻片上横向拉开。最后，将网格用2% (v/v) PFA PBS溶液固定10分钟；用去离子水洗涤3次，每次5分钟。用 2% (v/v) 戊二醛水溶液固定 10 分钟；用水洗涤 2 次，每次 5 分钟；用 1% (w/v) 单宁酸水溶液固定 1 分钟；用水洗涤 3 次，每次 5 分钟；用 1% (w/v) 醋酸铀酰溶液固定 1 分钟；用水洗涤 2 次，每次 5 分钟。用滤纸吸走网格上的液滴，最后将网格平铺在滤纸上风干，直至成像。

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超薄切片[1]
将细胞接种于胶原蛋白包被的玻璃底培养皿中，并在正常培养条件下过夜使其贴壁。向细胞中加入所需浓度的伊卡鲁霉素 (IKA)，孵育 3 小时。然后用冷 PBS 洗涤细胞，并用 2.5% (v/v) 戊二醛 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液固定。包埋和切片处理步骤如下：用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液漂洗三次后，用1%锇酸（溶于0.1 M二甲胂酸钠缓冲液）固定1小时。细胞用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液漂洗，并用0.5%单宁酸（溶于0.05 M二甲胂酸钠缓冲液）整体染色30分钟。用1%硫酸钠（溶于0.1 M二甲胂酸钠缓冲液）漂洗两次后，样品用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液漂洗三次，再用水漂洗五次。然后，样品经一系列浓度递增的乙醇脱水，并浸入Embed-812树脂中进行包埋。在MatTek培养皿中加入适量树脂，刚好填满孔，并在60℃下聚合。聚合后的样品被放入液氮中，使树脂圆盘从MatTek培养皿中心脱落。将两块含有相同样品的树脂圆片夹在新鲜的 Embed-812 包埋剂中，使单层细胞彼此相对。树脂圆片在 60°C 下聚合过夜，然后用 Leica Ultracut UCT 6 超薄切片机上的金刚石刀片沿两层细胞的纵轴进行切片。切片用 2% (w/v) 醋酸铀水溶液和柠檬酸铅进行后染色。

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伊卡鲁霉素的非细胞结合试验并非标准方法。网格蛋白介导的内吞作用抑制的作用机制研究采用无细胞系统，例如纯化的网格蛋白包被囊泡或体外内吞作用重建试验。抗菌活性采用标准肉汤微量稀释法针对各种细菌菌株进行评估。抗真菌活性采用类似方法，使用真菌培养物进行评估。

伊卡鲁加霉素 (IKA)抑制[1]
为了研究伊卡鲁加霉素 (IKA)的抑制作用，将细胞在37°C下预先孵育不同时间，分别在无伊卡鲁加霉素 (IKA)（对照）或有特定浓度的伊卡鲁加霉素 (IKA)的情况下进行，然后按照上述方法进行内吞作用实验，但PBS4+中含有IKA。IKA按照制造商的说明，以1000倍浓度的DMSO储备液储存在-20°C下，最长可保存2个月。所有实验均使用相同浓度的DMSO，并设置DMSO对照。

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免疫荧光[1]
表达增强型绿色荧光蛋白与网格蛋白轻链α N端融合蛋白（eGFP-CLCa）的ARPE-19细胞在玻璃盖玻片上过夜培养后，在37°C下，分别在无（对照）或有4 µM伊卡鲁霉素（IKA）的条件下预孵育3小时。用PBS洗涤后，在室温下用4% PFA/PBS固定10分钟，用0.1% Triton X-100透化2分钟，然后用Q-PBS（0.01%皂苷，2% BSA，0.1%赖氨酸，pH 7.4）封闭1小时。用PBS洗涤三次后，将细胞与推荐稀释度的指定一抗在Q-PBS中孵育1小时。细胞用PBS洗涤三次，然后与合适的AlexaFluor®标记的二抗孵育1小时。再次用PBS洗涤三次后，将样品用Fluoromount G封片剂封片于载玻片上，并使用安装在Ti-Eclipse倒置荧光显微镜上的60×或100× 1.49 NA物镜（Nikon）进行观察。

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细胞活力和caspase 3/8/9激活[1]
细胞活力/细胞毒性的测定采用CCK-8计数试剂盒，该试剂盒可测定活细胞中的脱氢酶活性。简而言之，将1 × 10⁵个细胞/孔接种于96孔板中，分别用4或32 µM的伊卡鲁霉素（IKA）处理，并在37°C下孵育不同时间，然后根据制造商的说明进行分析。为了平行测定细胞活力，将细胞以与摄取实验相同的密度接种于相同条件下。
采用蛋白质印迹法评估Caspase-3、-8和-9的激活情况。简而言之，将ARPE-19细胞用4 µM伊卡鲁霉素（IKA）处理2、4或8小时，或不处理（对照），用PBS洗涤三次，收集细胞并重悬于200 µL还原性Laemmli样品缓冲液中。将细胞裂解液煮沸10分钟，然后上样至SDS-PAGE凝胶。转移至硝酸纤维素膜后，用针对以下蛋白的抗体进行膜探针检测：caspase-3、-8和-9。

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使用培养的哺乳动物细胞（例如HeLa或CHO细胞）进行内吞抑制的细胞实验。将细胞用浓度为 0.1-10 μM 的伊卡鲁霉素处理 1-4 小时。通过流式细胞术或荧光显微镜检测荧光标记的转铁蛋白或低密度脂蛋白的摄取，以评估网格蛋白介导的内吞作用。采用 MTT 或 CellTiter-Glo 检测法评估细胞活力，以区分特异性效应和细胞毒性。

伊卡鲁霉素的体内动物研究包括细菌感染或肿瘤异种移植的小鼠模型。该化合物通过腹腔注射或静脉注射给药，剂量根据药代动力学和耐受性研究确定。疗效终点包括生存期、细菌清除率或肿瘤生长抑制率。组织分布和靶点结合情况也可进行评估。

已发表的伊卡鲁霉素药代动力学数据有限。作为一种具有复杂多环结构的天然产物（分子量：478.6，CAS号：36531-78-9），预计其生物利用度中等，且代谢广泛。需要进一步研究以确定其半衰期、清除率和蛋白结合率。该化合物通常用于研究用途。

伊卡鲁霉素的完整毒理学数据尚未公开。体外有效浓度下未见明显毒性报道。治疗药物开发需要进行标准的安全性药理学研究。该化合物应按照标准实验室防护措施进行操作。

[1]. Ikarugamycin: A Natural Product Inhibitor of Clathrin-Mediated Endocytosis. Traffic. 2016 Oct;17(10):1139-49.

伊卡鲁加霉素是一种含有四氢吡咯烷-2,4-二酮（吡咯烷-2,4-二酮）环系的聚酮大环内酰胺。它从链霉菌中分离得到，是一种具有抗原生动物和细胞毒活性的抗生素。伊卡鲁加霉素可用作抗菌剂、抗原生动物药物、抗肿瘤剂、细胞凋亡诱导剂和细菌代谢产物。它是一种内酰胺、氮杂六环化合物、烯酮、聚酮化合物和有机杂五环化合物。据报道，伊卡鲁加霉素存在于链霉菌、哈尔滨链霉菌和其他具有相关数据的生物体中。

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伊卡鲁加霉素是一种具有独特多环四氢吡咯烷酸大环内酰胺结构的生物活性天然产物。它是一种强效抗生素，也是网格蛋白介导的内吞作用抑制剂，因此是研究内吞途径的重要工具，也是抗菌和抗癌药物开发的先导化合物。该化合物分离自链霉菌属，仅供研究使用，不得用于人类治疗。

C29H38N2O4

478.62302

478.283

C, 72.77; H, 8.00; N, 5.85; O, 13.37

36531-78-9

54680304

White to light yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

741.9±60.0 °C at 760 mmHg

402.5±32.9 °C

0.0±5.6 mmHg at 25°C

1.604

5.05

95.5

3

4

1

35

1010

9

CC[C@@H]1[C@@H](C[C@H]2[C@H]1C=C[C@H]3[C@@H]2C[C@@H]/4[C@@H]3C/C=C\C(=O)NCCC[C@H]5C(=O)/C(=C(\C=C4)/O)/C(=O)N5)C

GHXZHWYUSAWISC-KZRBWAKNSA-N

InChI=1S/C29H38N2O4/c1-3-18-16(2)14-22-20(18)10-11-21-19-6-4-8-26(33)30-13-5-7-24-28(34)27(29(35)31-24)25(32)12-9-17(19)15-23(21)22/h4,8-12,16-24,32H,3,5-7,13-15H2,1-2H3,(H,30,33)(H,31,35)/b8-4-,12-9+,27-25-/t16-,17-,18-,19+,20+,21-,22+,23+,24+/m1/s1

(1Z,3E,5S,7R,8R,10R,11R,12S,15R,16S,18Z,25S)-11-ethyl-2-hydroxy-10-methyl-21,26-diazapentacyclo[23.2.1.05,16.07,15.08,12]octacosa-1,3,13,18-tetraene-20,27,28-trione

Ikarugamycin; 36531-78-9; (1Z,3E,5S,7R,8R,10R,11R,12S,15R,16S,18Z,25S)-11-ethyl-2-hydroxy-10-methyl-21,26-diazapentacyclo[23.2.1.05,16.07,15.08,12]octacosa-1(2),3,13,18-tetraene-20,27,28-trione; EIA; CHEMBL4283254; CHEBI:75276; MFCD01722005; NSC789948;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。