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| 靶点 |
Fluorescent probe for labeling of synthetic/endogenous polyP
Polyphosphate (polyP), an inorganic linear polymer of orthophosphate residues linked by high-energy phosphoanhydride bonds. [2][3] JC-D7 does not have a specific pharmacological target. It is a fluorescent probe used for research applications rather than a therapeutic agent. JC-D7 is specifically designed for labeling polyphosphate (polyP), a linear polymer of inorganic phosphate residues found in all living organisms. PolyP plays important roles in energy metabolism, protein function, and cellular signaling. JC-D7 selectively binds to polyP, enabling its detection and imaging in cells. The probe's selectivity for polyP makes it a valuable tool for studying polyP biology. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
无机多聚磷酸盐（polyP）是一种由许多正磷酸盐通过磷酸酐键连接而成的聚合物。近期研究表明，polyP除了在微生物功能中发挥重要作用外，还在包括哺乳动物在内的高等真核生物的病理和生理功能中扮演着多种重要角色。然而，由于哺乳动物细胞中polyP的含量远低于微生物，对其进行研究面临着实验上的挑战。本文介绍了新型荧光探针的鉴定，这些探针能够特异性地标记体外合成的polyP以及活细胞中的内源性polyP。这些探针（JC-D7和JC-D8）对polyP具有高度选择性，且对多种普遍存在的有机多聚磷酸盐（尤其是RNA）不敏感。利用这些探针，我们实现了对活细胞溶酶体中polyP释放的实时检测。此外，我们已检测到携带帕金森病相关突变的细胞中聚磷酸盐（polyP）水平升高[1]。
- 对聚磷酸盐标准品的荧光响应：在含有3% DMSO和30 μmol/L JC-D7的HEPES缓冲液（12.5 mmol/L，pH 8.0）中，聚磷酸盐（链长n=45）的荧光强度与0.5至36 μmol/L的聚磷酸盐浓度呈线性关系（R² = 0.9995），检测限低于0.5 μmol/L。当聚磷酸盐浓度超过约50 μmol/L时，线性度下降，荧光最大值出现在约100-120 μmol/L。[2] - JC-D7浓度的影响：将JC-D7浓度从20 μmol/L调整至40 μmol/L，并未显著改变荧光响应的灵敏度。荧光信号变化约为 2.1 ± 0.6%，线性校准曲线的斜率变化约为 3.8 ± 1.4%。[2] - 聚磷酸盐链长的影响：聚磷酸盐链长（n = 14、45、60 和 130）对线性荧光响应没有显著影响。荧光信号平均变化为 5.0%，斜率变化约为 5.7 ± 1.0%。[2] - 与 DAPI 和 PPX 方法的比较：在野生型莱茵衣藻（聚磷酸盐积累型）中，JC-D7 法测得的聚磷酸盐含量与 PPX 和 DAPI 方法一致。在缺乏聚磷酸盐的突变株中，JC-D7 和 PPX 法均显示无法检测到聚磷酸盐，而 DAPI 法由于 DNA/RNA 干扰而产生假阳性信号。在透明沃格氏菌（Vogesella perlucida）中，JC-D7 的结果与 PPX 的结果相当（p = 0.74），而 DAPI 高估了聚磷酸盐（polyP）的含量。JC-D7 对 PPX 失效的海洋藻类样品提供了可靠的测量结果。[2] - 裂解缓冲液成分的干扰：设计的浮游生物裂解缓冲液（含有蛋白酶 K、NaCl、Triton X-100、Tween 20 和 EDTA 的 Tris-HCl 缓冲液）使 JC-D7-polyP 的荧光灵敏度降低了约 16%，但检测限（仍 <0.5 μmol/L）和线性范围（0.5-30 μmol/L）不受影响。检测限可以降低至约 0.2 μmol/L，但灵敏度也会降低。高浓度 NaCl（≥300 mmol/L）会提高检测限，降低灵敏度，并缩小线性范围。 EDTA 可显著抑制硫酸软骨素（一种硫酸化多糖）与 JC-D7 染色后的荧光，在 550 nm 发射波长处干扰降低至 <3%。[2] - 培养星形胶质细胞中聚磷酸盐 (polyP) 的染色：将培养的小鼠星形胶质细胞在 CO₂ 培养箱中用 5 μmol/L JC-D7 的 HBSS 缓冲液孵育 30 分钟，然后洗涤、固定并成像。JC-D7 用于可视化细胞内 polyP 的分布。[3] 在体外，JC-D7 用于合成聚磷酸盐 (polyP) 的特异性标记。该探针能够实现对 polyP 的高灵敏度可视化、空间定位追踪和功能分析。作为一种选择性荧光探针，JC-D7 使研究人员能够在各种实验系统中检测和定量 polyP。该化合物可用于标记合成和内源性 polyP，使其成为 polyP 研究的多功能工具。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
利用这些新型指示剂，我们检测到帕金森病动物模型脑切片中聚磷酸盐（polyP）水平升高。这一发现表明，这些探针（JC-D7 和 JC-D8）在活体样本中具有实际应用潜力。然而，应谨慎操作，并针对每组特定的实验条件制定相应的实验方案[1]。JC-D7 用于活细胞内源性聚磷酸盐的特异性标记。该探针能够可视化、空间定位追踪以及对细胞代谢和信号转导中聚磷酸盐动态变化的功能分析。通过对活细胞中聚磷酸盐进行实时成像，JC-D7 有助于深入了解聚磷酸盐在各种生理和病理过程中的作用。然而，JC-D7 并非治疗药物，也未在标准药理学疗效模型中进行评估。
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| 酶活实验 |
初筛
使用 SpectraMax M2 酶标仪在 96 孔板中测量荧光强度。将 JC 化合物溶解至终浓度为 10 μM（20 mM HEPES 缓冲液，pH 7.4，含 1% (v/v) DMSO），并与不同浓度的待测物在 20 mM HEPES 缓冲液（pH 7.4）中孵育。激发波长设置为 390 nm，发射光谱记录范围为 450 至 700 nm。通过比较 JC 化合物在有无待测物存在下的最大荧光强度来确定荧光倍数增加率。 添加多聚磷酸盐前后 JC-D7 的量子产率分别为 0.007 和 0.38。而 JC-D8 在无多聚磷酸盐存在下和存在多聚磷酸盐存在下的量子产率分别为 0.008 和 0.37。由于 JC-D7 的量子产率相对低于 JC-D8，因此前者具有略高的倍数增加 [1]。 选择性研究 [1] 将苯并咪唑化合物转移至 Greiner 96 孔黑色聚丙烯板（最终浓度为 10 μM），并测试其对 DNA 和 RNA（100 μg/mL）、其他分析物（1 mM 磷酸钠、ATP、AMP、GTP、GMP、CTP 和 CMP）以及肝素钠和聚磷酸盐（20 μg/mL）的选择性，所用缓冲液为 20 mM HEPES 缓冲液（pH = 7.4），含 1% DMSO。使用 SpectraMax M2 荧光酶标仪记录荧光光谱，激发波长为 390 nm（截止波长：420 nm），发射波长范围为 450 至 700 nm。 对于 JC-D7 探针，标准实验流程包括将细胞或样品与探针孵育特定时间，然后进行洗涤，并使用荧光显微镜或流式细胞仪进行成像。该探针选择性结合聚磷酸盐 (polyP)，可用于检测细胞中的聚磷酸盐。最佳染色条件（浓度、时间、温度）通常根据每种细胞类型或实验系统的经验确定。 |
| 细胞实验 |
活细胞成像[1]
将SHY-SY5细胞、人皮肤成纤维细胞、果蝇全脑、混合原代脑培养物或急性脑切片在室温下用5 μM JC-D7或JC-D8在HEPES缓冲盐溶液（HBSS）中孵育30分钟。HBSS的组成成分（mM）为：156 NaCl、3 KCl、2 MgSO4、1.25 KH2PO4、2 CaCl2、10葡萄糖和10 HEPES，用NaOH调节pH至7.35。 使用配备META检测系统和40×油浸物镜的蔡司710共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获取共聚焦图像。JC-D7/D8荧光在405 nm激发波长和450 nm以上发射波长下测定。为避免光毒性，照明强度保持在最低水平（激光输出的 0.1%–0.2%），针孔设置为产生约 2 μm 的光学切片。在比较不同细胞荧光水平的实验中，成像设置保持不变。为了获得更好的视觉效果，选择了不同的伪彩色。 DAPI-polyP 荧光采用 405 nm 激发波长和 480 至 520 nm 发射波长进行检测。图像使用蔡司软件进行分析。 毒性实验 [1] 在毒性测定中，细胞在成像前 30 分钟暴露于 20 μM 碘化丙啶 (PI) 和 4.5 μM Hoechst 33342（Molecular Probes，Eugene，OR）。PI 会被活细胞排除，并在细胞膜完整性受损后呈现红色荧光，而 Hoechst 33342 会将所有细胞核标记为蓝色。这样可以将死亡（红色染色）细胞的数量表示为所计数细胞核总数的百分比。每个实验均使用不同的培养物重复四次或更多次。 - 培养星形胶质细胞中的多聚磷酸盐染色（引自文献[3]）：将生长在盖玻片上的小鼠星形胶质细胞与溶于 HBSS 的 5 μmol/L JC-D7 在 CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟。孵育后，用 HBSS 洗涤细胞三次，并用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。然后将细胞与 Hoechst 核染料进一步孵育，洗涤后用 Fluoromount-G 封片剂封片于载玻片上。使用 488 nm 激发激光和共聚焦显微镜（60× 物镜，2.5 倍变焦，Z 轴间距 0.3 μm）采集 JC-D7 的荧光图像。此方法用于可视化细胞内多聚磷酸盐的分布。 [3] - 培养藻类和细菌中聚磷酸盐（polyP）的定量（引自文献[2]）：通过过滤或离心收集培养细胞（例如，莱茵衣藻、透明弧菌），并使用苯酚-氯仿法或浮游生物裂解缓冲液法提取聚磷酸盐。将提取的聚磷酸盐样品（或聚磷酸盐标准品）与工作浓度的JC-D7溶液（60 μmol/L JC-D7溶于HEPES缓冲液）以1:1 (v/v)的比例进行染色，最终染色混合物包含30 μmol/L JC-D7和3% DMSO，溶于12.5 mmol/L HEPES缓冲液中。样品孵育5-10分钟后，使用酶标仪在激发波长405 nm和发射波长535 nm处测量荧光强度。 [2] 对于 JC-D7，标准细胞检测方法是将活细胞与探针在 37°C 下孵育 15-60 分钟。洗涤后，通过荧光显微镜或流式细胞术分析细胞，以检测聚磷酸盐的定位和水平。该探针可与其他荧光标记物联合使用，进行多参数分析。最佳染色条件可能因细胞类型和实验系统而异。 |
| 动物实验 |
急性脑切片的制备 [1]
所有小鼠实验均符合机构伦理和动物福利标准，并遵守英国内政部相关规定。切片制备采用标准流程，如前所述。简而言之，从 20 至 24 周龄的野生型 (WT)、PINK1 敲除 (KO) 和 LRRK2 敲除 (KO) C57BL/6 小鼠中制备横向急性脑切片（100–200 μm）。动物通过颈椎脱臼处死，取出脑组织，并立即使用振动切片机 (Leica VT1200S) 在 4 °C 下进行切片。切片后置于生理盐水中，在室温 (24 °C) 下保存约 1 小时，然后进行成像。 JC-D7 不作为治疗剂用于标准体内动物模型中。它是一种用于细胞或组织中聚磷酸盐成像的研究工具。对于体内成像应用，探针可以局部或全身给药进行短期成像研究，但这并不是标准的药理学疗效方案。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
JC-D7 的分子量为 590.39，分子式为 C28H31BrCl2N4O，纯度为 84%。该化合物应按照制造商建议的适宜条件储存。目前尚不适用于该化合物的治疗应用，因此无需进行全面的药代动力学研究。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
JC-D7 是一种研究工具，而非治疗药物。作为一种荧光探针，它不适用于人体治疗。该化合物应按照标准实验室安全防护措施进行操作。目前尚不适用于针对治疗应用的全面毒理学评估。
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| 参考文献 |
[1]. In situ investigation of mammalian inorganic polyphosphate localization using novel selective fluorescent probes JC-D7 and JC-D8. ACS Chem Biol. 2014 Sep 19;9(9):2101-10.
[2]. Quantification of Polyphosphate in Environmental Planktonic Samples Using a Novel Fluorescence Dye JC-D7. Environ Sci Technol. 2024 Aug 13;58(32):14249-14259. [3]. Astrocytes modulate brain phosphate homeostasis via polarized distribution of phosphate uptake transporter PiT2 and exporter XPR1. Neuron. 2024 Sep 25;112(18):3126-3142.e8. |
| 其他信息 |
无机多聚磷酸盐（polyP）是由许多正磷酸盐通过磷酸酐键连接而成的聚合物。近期研究表明，polyP不仅在微生物功能中发挥重要作用，而且在包括哺乳动物在内的高等真核生物的病理和生理功能中也扮演着重要角色。然而，哺乳动物细胞中polyP的含量远低于微生物，这使得对其的研究成为一项实验挑战。本文介绍了一种新型荧光探针的发现，该探针能够特异性标记体外合成的polyP以及活细胞中的内源性polyP。这些探针具有很高的polyP标记选择性，并且对多种普遍存在的有机多聚磷酸盐（尤其是RNA）不敏感。利用这些探针，我们实现了对活细胞溶酶体释放的polyP的实时检测。此外，我们还检测到携带帕金森病相关突变的细胞中polyP水平升高。[1]
- JC-D7是一种polyP特异性荧光探针，最初用于可视化哺乳动物细胞中的polyP。在这些研究中，该方法被应用于环境浮游生物样品和培养星形胶质细胞中聚磷酸盐（polyP）的定量检测。[2][3] - 与传统的DAPI方法不同，JC-D7染色受核酸（DNA/RNA）或硫酸多糖的干扰影响较小，尤其是在与含有EDTA的浮游生物裂解缓冲液联用时。这使得在复杂的环境样品中能够准确定量聚磷酸盐，而DAPI方法通常会高估其含量（超过总颗粒磷的100%）。[2] - JC-D7荧光定量方法具有灵敏度高、操作简便、稳定性好等优点，并且适用于多种提取剂和缓冲液。该方法被推荐用于所有浮游生物样品（藻类和细菌，淡水和海洋）中聚磷酸盐的定量分析，因为与DAPI和PPX相比，它是环境应用中最稳定可靠的方法。 [2] JC-D7 是一种新型选择性荧光探针，可用于体外特异性标记合成多聚磷酸盐 (polyP)，以及活细胞内源性 polyP。该探针能够对细胞代谢和信号转导中的 polyP 动态进行高灵敏度可视化、空间定位追踪和功能分析。目前尚无药物开发或临床试验阶段。 |
| 分子式 |
C28H31BRCL2N4O
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|---|---|
| 分子量 |
590.381943941116
|
| 精确质量 |
588.105
|
| 元素分析 |
C, 56.96; H, 5.29; Br, 13.53; Cl, 12.01; N, 9.49; O, 2.71
|
| CAS号 |
1036271-54-1
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| 相关CAS号 |
909715-05-5 (cation);1036271-54-1 (bromide);
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| PubChem CID |
154724048
|
| 外观&性状 |
Solid powder
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| tPSA |
63.9Ų
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
2
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
3
|
| 可旋转键数目(RBC) |
10
|
| 重原子数目 |
36
|
| 分子复杂度/Complexity |
706
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| SMILES |
C[N+]1=C(N(C2=CC(=C(C=C21)Cl)Cl)CCCCCC(=O)NCCN)/C=C/C3=CC=CC4=CC=CC=C43.[Br-]
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| InChi Key |
DSNPFMKJUXAPGB-IERUDJENSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C28H30Cl2N4O.BrH/c1-33-25-18-23(29)24(30)19-26(25)34(17-6-2-3-12-27(35)32-16-15-31)28(33)14-13-21-10-7-9-20-8-4-5-11-22(20)21;/h4-5,7-11,13-14,18-19H,2-3,6,12,15-17,31H2,1H3;1H/b14-13+;
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| 化学名 |
1-[5-(2-Amino-ethylcarbamoyl)-pentyl]-5,6-dichloro-3-methyl-2-(2-naphthalen-1-yl-vinyl)-3H-benzoimidazol-1-ium Bromide
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| 别名 |
JC-D7; JC D7; 1-(6-((2-Aminoethyl)amino)-6-oxohexyl)-5,6-dichloro-3-methyl-2-(2-(naphthalen-1-yl)vinyl)-1H-benzo[d]imidazol-3-ium bromide; 1-[5-(2-Amino-ethylcarbamoyl)-pentyl]-5,6-dichloro-3-methyl-2-(2-naphthalen-1-yl-vinyl)-3H-benzoimidazol-1-ium Bromide; N-(2-aminoethyl)-6-[5,6-dichloro-3-methyl-2-[(E)-2-naphthalen-1-ylethenyl]benzimidazol-3-ium-1-yl]hexanamide;bromide; JCD7
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
>10 mM in DMSO
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 1.6938 mL | 8.4691 mL | 16.9382 mL | |
| 5 mM | 0.3388 mL | 1.6938 mL | 3.3876 mL | |
| 10 mM | 0.1694 mL | 0.8469 mL | 1.6938 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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