KIN1148

Interferon regulatory factor 3 (IRF3)
KIN1148 acts on interferon regulatory factor 3 (IRF3) as an agonist [1]

KIN1148 是一种 IRF3（RIG-I 样受体）途径的小分子激动剂，也是一种新型流感疫苗佐剂，可增强流感疫苗的功效。它诱导 PH5CH8 细胞中 IRF3 的剂量依赖性核转位以及 IRF3 响应启动子的特异性激活。 KIN1148 还可诱导 PH5CH8 细胞更大程度地诱导内源 IRF3 依赖性 ISG54 和 OASL 表达。 KIN1148。 KIN1148 诱导剂量依赖性 IRF3 核转位和 IRF3 响应启动子的特异性激活。使用次优剂量的单价大流行性流感裂解病毒 H1N1 A/California/07/2009 疫苗加 KIN1148 对小鼠进行初免加强免疫，可防止小鼠适应流感病毒 (A/California/04/2009) 的致命攻击并诱导来自肺和肺引流淋巴结的 T 细胞产生流感病毒特异性 IL-10 和 Th2 反应。使用疫苗加 KIN1148 的初免-加强免疫（而非单独初免）诱导的抗体能够抑制流感病毒血凝素并中和病毒感染性。尽管如此，使用疫苗加 KIN1148 进行单次免疫比单独使用疫苗提供了更强的保护，并减少了攻击后肺部的病毒载量。这些发现表明，保护作用至少部分是由细胞免疫成分介导的，并且 KIN1148 佐剂疫苗诱导 Th2 和免疫调节细胞因子可能特别有益于改善与流感病毒相关的免疫发病机制。 KIN1148 在 PH5CH8 细胞中诱导 IRF3 剂量依赖性核转位以及 IRF3 响应启动子的特异性激活。 KIN1148 还可诱导 PH5CH8 细胞更大程度地诱导内源 IRF3 依赖性 ISG54 和 OASL 表达。

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KIN1148可在PH5CH8细胞中诱导IRF3呈剂量依赖性核转位，且相较于其前体化合物KIN1000，KIN1148激活PH5CH8细胞中IRF3应答基因（ISG54和OASL）表达的活性更强[1]
- KIN1148可诱导佛波酯（PMA）激活的THP-1细胞产生IP-10[1]

使用次优剂量的单价大流行性流感裂解病毒 H1N1 A/California/07/2009 疫苗加 KIN1148 对小鼠进行初免加强免疫，可防止小鼠适应流感病毒 (A/California/04/2009) 的致命攻击，并诱导来自肺和肺引流淋巴结的 T 细胞产生流感病毒特异性 IL-10 和 Th2 反应。使用疫苗加 KIN1148 进行 Primeboost 免疫（而非单独初次免疫）可诱导能够抑制流感病毒血凝素并中和病毒感染性的抗体。尽管如此，与单独使用疫苗相比，使用疫苗加 KIN1148 进行单次免疫可提供更强的保护，并减少攻击后肺部的病毒载量

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对C57BL/6N小鼠采用初免-加强免疫方案（两次免疫间隔21天），给予亚适剂量的单价甲型H1N1流感裂解疫苗（A/California/07/2009株）联合KIN1148，加强免疫后21天用10倍半数致死量（LD₅₀）的小鼠适应型流感病毒（A/California/04/2009株）攻毒，相较于疫苗联合PBS/赋形剂组，该方案可显著提高小鼠存活率、减轻体重下降[1]
- 疫苗联合KIN1148的初免-加强免疫可诱导攻毒小鼠（攻毒后7天取材）的肺及肺引流淋巴结来源T细胞产生流感病毒特异性IL-10和Th2型免疫应答[1]
- 疫苗联合KIN1148的初免-加强免疫可诱导更高的IgG抗体滴度（加强免疫后14天）、中和抗体滴度及血凝抑制（HAI）抗体滴度；仅单次初免疫苗联合KIN1148也能比单独接种疫苗提供更强的保护力，并降低攻毒后小鼠肺部病毒载量[1]
- 将经疫苗联合KIN1148初免-加强免疫的小鼠血清进行被动转移（给受体小鼠腹腔注射），可保护C57BL/6N受体小鼠抵抗10倍LD₅₀的H1N1流感致死性攻毒；而仅单次初免后的血清被动转移保护效果较弱[1]

KIN1148 是一种 IRF3（RIG-I 样受体）途径的小分子激动剂，也是一种新型流感疫苗佐剂，可增强流感疫苗的功效。它诱导 PH5CH8 细胞中 IRF3 的剂量依赖性核转位以及 IRF3 响应启动子的特异性激活。 KIN1148 还可诱导 PH5CH8 细胞更大程度地诱导内源 IRF3 依赖性 ISG54 和 OASL 表达。

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分离疫苗特异性IgG ELISA试剂盒[1]
在每ml PBS中加入1 μg HA的裂解疫苗包被ELISA板。用5% BSA加0.1% Tween-20 （PBST）的PBS液阻断培养皿。将小鼠血清按指定的血清稀释倍数（1:1000/ 1:1000）一式两份加入板中，与抗原结合1.5小时。用1:5000的生物素化山羊抗小鼠IgG抗体检测小鼠抗体。然后以1:20 000的比例加入链亲和素- hrp，孵育30分钟。洗板，用TMB底物显影2分钟，用1 M H3PO4停止。在450nm处测量单孔光密度（OD）

KIN1148 在 PH5CH8 细胞中诱导 IRF3 剂量依赖性核转位以及 IRF3 响应启动子的特异性激活。 KIN1148 还可诱导 PH5CH8 细胞更大程度地诱导内源 IRF3 依赖性 ISG54 和 OASL 表达。

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血凝抑制（HAI）和病毒微中和（VMN） [1]
根据世卫组织指南，使用0.5%新鲜全火鸡血进行HAI测定。对于VMN检测，血清在56°C下热灭活45分钟，并在感染培养基中稀释两倍。将病毒在感染培养基中稀释后，以感染倍数为0.15加入稀释后的血清中，在37℃加湿培养箱中孵育90 min。将病毒和血清混合液转移到MDCK细胞上，37℃孵育6 h，冷冻甲醇-丙酮（1:1）固定细胞10 min，抽吸固定液，PBS洗涤细胞1次。用含BSA的10%马血清（1mg /ml）和0.1% Triton X-100阻断1小时。将异硫氰酸荧光素标记的小鼠流感核蛋白IgG（1:3000）和Hoechst染料（1:5000）加入1%马血清培养皿中，室温孵育2小时。使用ArrayScan HCS仪器定量检测感染细胞计数和细胞核染色。中和效价测定为血清最高稀释度的倒数，导致感染比阴性对照（无血清）减少50%。

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IRF3核转位实验：将PH5CH8细胞用不同剂量的KIN1148处理，检测IRF3的核转位情况；实验设双复孔，独立重复三次[1]
- IRF3应答基因表达实验：将PH5CH8细胞暴露于KIN1148（以KIN1000为对照），检测IRF3依赖性基因ISG54和OASL的表达水平；实验设双复孔，独立重复三次[1]
- IP-10产生实验：用PMA激活THP-1细胞后加入KIN1148处理，检测细胞培养上清中IP-10的产生量；实验设三复孔，独立重复三次[1]
- T细胞细胞因子检测实验：分离攻毒后小鼠的肺及肺引流淋巴结T细胞，用流感裂解疫苗（SV）、CD4表位肽（MA-CA/04 NP₂₆₀₋₂₈₃）、CD8表位肽（MA-CA/04 NP₃₆₆₋₃₇₄）或刀豆蛋白A（Con A）刺激18小时，采用多重ELISA检测培养上清中的细胞因子（包括IL-10）；肺来源T细胞按个体小鼠样本分析，淋巴结来源细胞按组合并分析，刺激实验设三复孔[1]

mg/mL；肌注
\n小鼠\nKIN1148 通过超声处理 6 小时，在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中制备成含有磷脂酰胆碱、聚乙二醇化磷脂酰乙醇和胆固醇的脂质体。与疫苗混合前的最终脂质体含有 KIN1148 (5 mg/mL) 和磷脂 (40 mg/mL)，并进行肌注（每次注射 KIN1148 50 μg，磷脂 400 μg）。制备不含 KIN1148 的空白脂质体作为载体对照。 KIN1148脂质体和空白脂质体制剂在4℃下至少稳定4个月，并在制备后一个月内用于体内实验。[1]小鼠用异氟烷麻醉后，肌内注射50 μl疫苗（总蛋白3.3 μg，相当于0.6 μg HA和0.069 EU），疫苗分为两份，每份25 μl，分别注射于左右腓肠肌。通过逐步减少分装疫苗的剂量，直至达到对致死性攻击的次优保护率（>25%），确定了疫苗的亚优剂量（3.3 μg）。所有疫苗接种研究均使用相同剂量和批次的Virapur分装疫苗。对于初次免疫和初次/加强免疫，小鼠分别进行一次（初次免疫）或两次（间隔21天）免疫。在接种最后一剂疫苗21天后，小鼠经鼻内接种10倍LD50（2500噬斑形成单位/只小鼠，即导致50%未感染小鼠死亡的致死病毒剂量）的小鼠适应性流感病毒。若小鼠体重下降≥30%（以初始体重为基准）或出现严重疾病症状（包括弓背、呼吸不规则、阴茎勃起和活动减少），则采用二氧化碳窒息法实施安乐死。血清学检测时，小鼠用异氟烷麻醉，经眼眶后静脉丛采集全血（200 μl）用于血清处理。为了进行细胞因子谱分析，将肺和肺引流淋巴结中的T细胞用裂解疫苗（1 μg/ml）、CD4表位肽MA-CA/04 NP260–283（5 μM）、CD8表位肽MA-CA/04 NP366–374（5 μM）或刀豆蛋白A（Con A，5 μg/ml）刺激18小时。然后使用多重ELISA（Quansys）检测培养上清液中的细胞因子。所有细胞因子实验均重复三次。将骨髓来源的树突状细胞作为抗原呈递细胞添加到淋巴结 T 细胞测定中。[1]

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\n致死性流感攻击模型（初免-加强免疫）：将 10 只 C57BL/6N 小鼠分为两组，分别用亚最佳剂量的单价大流行性流感裂解病毒 H1N1 A/California/07/2009 疫苗加 KIN1148 进行两次免疫（间隔 21 天）（疫苗加 PBS/载体作为对照）；加强免疫 21 天后，用 10 倍 LD₅₀ 的小鼠适应性流感病毒 A/California/04/2009 攻击小鼠，并在攻击后 14 天内监测存活率和体重变化；该实验独立重复两次[1]
\n- 体液免疫反应测定：C57BL/6N 小鼠接种两次疫苗（间隔 21 天），疫苗加 KIN1148（以疫苗加 PBS/载体作为对照）；分别于初次免疫后第 18 天和加强免疫后第 35 天（加强免疫后 14 天）采集小鼠血液，测定血清 IgG 滴度、中和抗体滴度和 HAI 滴度；IgG 滴度检测 n=15，中和抗体和 HAI 滴度检测 n=8；该实验独立重复三次[1]
\n- 被动转移试验：收集接种一次（初次免疫）或两次（初次免疫-加强免疫，间隔 21 天）疫苗加 KIN1148（以疫苗加载体作为对照）的小鼠的免疫血清； 6 只 C57BL/6N 受体小鼠在攻毒前第 -2 天和第 -1 天腹腔注射 200 μl 混合免疫血清；然后，受体小鼠接受 10× LD₅₀ 小鼠适应性 A/California/04/2009 流感病毒的攻毒，并在攻毒后观察 14 天 [1]
\n- 致死性流感攻毒模型（仅初次免疫）：C57BL/6N 小鼠接种一次疫苗加 KIN1148（疫苗加 PBS/载体作为对照）；在用 10× LD₅₀ 流感病毒进行攻击后，监测存活率（每组 10 只小鼠），在攻击后 3 天测量肺部病毒载量（每组 5 只小鼠），并在攻击后 7 天检测肺部和肺引流淋巴结中的 T 细胞细胞因子反应（每组 5 只小鼠）；该实验至少独立重复两次[1]
\n- T 细胞细胞因子反应测定（体内）：C57BL/6N 小鼠（载体组 n=4，KIN1148 组 n=8）用疫苗加载体/KIN1148 进行两次免疫（间隔 21 天），然后用 10× LD₅₀ 流感病毒进行攻击；在攻毒后第7天，从肺和肺引流淋巴结中分离出T细胞，用特异性抗原/Con A刺激18小时，并通过多重ELISA检测上清液中的细胞因子[1]

[1]. A small-molecule IRF3 agonist functions as an influenza vaccine adjuvant by modulating the antiviral immune response. Vaccine. 2017 Apr 4;35(15):1964-1971.

在疫苗抗原免疫原性较弱、疫苗抗原数量有限或需要增强特定人群（例如老年人）疫苗效力的情况下，疫苗佐剂对于诱导保护性免疫反应至关重要。为了发现新型疫苗佐剂，我们采用了一种高通量筛选 (HTS) 方法，旨在鉴定 RIG-I 样受体 (RLR) 通路的小分子激动剂，该通路可激活干扰素调节因子 3 (IRF3)。RLR 是一类胞质模式识别受体，在病毒感染过程中对病毒核酸的识别至关重要。病毒核酸配体结合后，RLR 被激活，并向包括 IRF3 在内的转录因子发出信号，启动先导免疫转录程序以控制病毒感染。在我们的 HTS 筛选结果中，发现了一系列苯并噻唑类化合物，我们从中设计了先导化合物 KIN1148。KIN1148 可剂量依赖性地诱导 IRF3 核转位，并特异性激活 IRF3 反应性启动子。用亚最佳剂量的单价甲型H1N1流感病毒裂解株疫苗（A/California/07/2009）联合KIN1148对小鼠进行初免-加强免疫，可有效抵抗小鼠适应性流感病毒（A/California/04/2009）的致死性攻击，并诱导肺及肺引流淋巴结来源的T细胞产生流感病毒特异性IL-10和Th2反应。疫苗联合KIN1148的初免-加强免疫（而非单独的初免免疫）可诱导产生能够抑制流感病毒血凝素并中和病毒感染性的抗体。然而，单次疫苗联合KIN1148的免疫接种比单独接种疫苗更能提供保护，并在攻击后降低肺部病毒载量。这些研究结果表明，保护作用至少部分是由细胞免疫成分介导的，并且KIN1148佐剂疫苗诱导Th2细胞和免疫调节细胞因子可能对改善流感病毒相关的免疫病理过程尤为有益。[1]

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我们发现KIN1148是一种RLR通路的小分子激动剂，可激活IRF3。与核酸RLR激动剂不同，我们的小分子激动剂可以针对其疗效、反应原性和递送进行优化。KIN1148是一种亲脂性小分子化合物，cLogP值为4.76，在水溶液中的溶解度有限。与PBS配制的KIN1148相比，KIN1148脂质体的加入提高了该化合物的佐剂活性（数据未显示）。这种效应可能由KIN1148脂质体和裂解疫苗的均匀分散以及递送更高化合物剂量的能力介导。与核酸RIG-I配体不同，KIN1148佐剂系统无需转染试剂或整合到DNA疫苗中即可发挥体内佐剂活性。[1]
使用KIN1148/裂解疫苗佐剂系统进行初免-加强免疫后，病毒攻击后，肺部和肺引流淋巴结中可诱导产生保护性抗体、IL-10和Th2反应。类似地，DMXAA（一种强效的IRF3依赖性I型干扰素诱导剂）也能诱导对裂解流感病毒疫苗的Th2反应。[1]
尽管Th2免疫反应，特别是嗜酸性粒细胞增多症，有可能引发过敏反应，但近期对黏膜表面Th2免疫的研究表明，Th2反应内部存在多样性。 Th2免疫反应可分为两类：抗炎反应（组织保护或修复）或促炎反应（组织损伤，肥大细胞脱颗粒，哮喘、过敏和炎症）。在小鼠感染流感病毒后，我们观察到其肺部和肺引流淋巴结中存在流感抗原特异性IL-10产生T细胞群，这表明疫苗联合KIN1148免疫可促进平衡的免疫反应，从而减轻流感病毒引起的免疫病理。我们的研究结果支持将小分子RLR激动剂作为新型免疫调节佐剂用于RNA病毒疫苗的临床前开发。此外，还将探索使用 KIN1148 佐剂疫苗对抗致病性人类和禽流感病毒，以期通过诱导组织保护性 Th2 调节性免疫反应来控制这些病毒引起的过度炎症反应。

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KIN1148 是一种小分子 IRF3 激动剂，源自一系列通过高通量筛选 (HTS) 鉴定的苯并噻唑化合物，其靶向 RIG-I 样受体 (RLR) 通路，从而激活 IRF3 [1]
- KIN1148 通过调节抗病毒免疫反应发挥流感疫苗佐剂的作用；机体对流感病毒攻击的保护作用至少部分由细胞免疫成分介导，而KIN1148佐剂疫苗诱导的Th2细胞和免疫调节细胞因子可能减轻流感相关的免疫病理[1]。RLR是胞质模式识别受体，对识别病毒核酸至关重要。激活后，RLR会向IRF3等转录因子发出信号，启动针对病毒感染的先天免疫反应[1]。

C19H11N3OS2

361.44

361.034

C, 63.14; H, 3.07; N, 11.63; O, 4.43; S, 17.74

1428729-56-9

71549151

Light yellow to yellow solid powder

5.3

111

1

5

2

25

519

0

YAISOECYKYATLL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H11N3OS2/c23-18(13-6-5-11-3-1-2-4-12(11)9-13)22-19-21-14-7-8-15-16(17(14)25-19)20-10-24-15/h1-10H,(H,21,22,23)

N-(benzo[1,2-d:3,4-d']bis(thiazole)-2-yl)-2-naphthamide

KIN 1148; KIN1148; 1428729-56-9; N-Benzo[1,2-d; KIN-1148; N-(benzo[1,2-d:3,4-d']bis(thiazole)-2-yl)-2-naphthamide; N-([1,3]thiazolo[5,4-e][1,3]benzothiazol-2-yl)naphthalene-2-carboxamide; SCHEMBL14847549; KIN-1148;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 10.5~100 mg/mL ( 29.05~276.67 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。