KT 5720

PHK (IC50 = 11 nM); PDK1 (IC50 = 300 nM); PKA (IC50 = 3.3 µM)

在 MDR1 细胞模型中，KT5720（0-8 μM；72 小时）可逆转多药激活 [1]。在最近分离的通道 DRG 神经元中，KT5720 (3 μM) 抑制 HCN 通道激活动力学并减少 Ih。 KT5720 (3 μM) 会降低 DRG 神经元的兴奋性和细胞内 Ca2+ 水平 [2]。

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KT-5720逆转MDR1淋巴瘤细胞模型的多药耐药性[1]
我们研究了KT-5720对携带和表达人MDR1转基因的LM1/MDR小鼠淋巴瘤细胞系的影响。相对于其亲本、药物敏感的LM1细胞系，这种细胞变体对几种细胞毒性药物具有高度交叉抗性。与LM1亲本细胞相比，LM1/MDR细胞对VBL、ACT D、COL和DOX的抗性分别为46、98、137和178倍。
使用化学致敏平板试验，我们测量了KT5720的浓度，该浓度在0.1、0.3、0.5和1.0μg/ml的耐受浓度下分别将LM1/MDR细胞对各种细胞毒性药物的耐药性逆转了50%（IC50值），以对抗ACT D、VBL、DOX和COL。在ACT D、DOX、VBL和COL存在下，KT-5720的IC50值分别为1.7、2.6、3.0和3.3μM。然而，对于LM1和LM1/MDR细胞，单独使用KT-5720的IC50值（导致50%细胞生长抑制的浓度）均为37μM。因此，KT-5720的50%毒性值比对各种细胞毒性药物的50%化学致敏值高11-22倍。
如图1所示，KT-5720对LM1/MDR细胞对COL的致敏作用是剂量依赖性的。经典的Pgp抑制剂维拉帕米（VRP）是一种标准的化学敏化剂，用于比较随后发现的所有化学敏化剂的效力和作用机制。此外，VRP已被证明与其他（但不是全部）化学增敏剂具有协同作用，包括目前正在临床试验的药物。在低浓度KT-5720和VRP下，每种药物对MDR活性的抑制作用都是部分的。然而，使用它们的组合表明，这两种MDR抑制剂以协同方式起作用，它们的联合作用是累积的（图1）。因此，KT-5720可以被纳入一个化学增敏剂亚组，该亚组在抑制动力学方面表现出协同作用。[1]

为了确认KT-5720的生物活性，我们测量了LM1/MDR细胞在KT-5720存在或不存在的情况下Pgp荧光底物Rh123的细胞积累水平（图2A）。我们还比较了KT5720对Rh123积累的影响与KT-5720的密切衍生物（K252a和K252b）的其他吲哚咔唑的影响。这些衍生品的结构如补充图（在线）所示。如图2B所示，KT-5720和VRP（阳性对照化学增敏剂）同样增加了LM1/MDR细胞中Rh123的细胞积累。在没有任何Pgp调节剂的情况下，这种增加大约是Rh123细胞积累的三倍。LM1/MDR细胞在KT-5720或VRP存在下Rh123的细胞积累水平与在不存在（或类似存在）这些调节剂的情况下在亲本、药物敏感的LM1细胞变体中测量的水平相似（图2C）。然而，KT-5720的另外两种结构紧密的衍生物（K252a和K252b）对LM1/MDR细胞和亲本LM1细胞积累Rh123没有显著影响（分别见图2B和C）。

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超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在背根神经节（DRG）神经元中表达，参与调节DRG功能的多种机制。蛋白激酶A（PKA）是一种重要的激酶，在几乎所有类型的细胞中都起着关键作用；它调节离子通道活性、细胞内钙浓度，以及调节细胞信号转导。然而，PKA抑制对DRG神经元HCN通道活性的影响仍有待阐明。在这里，我们研究了PKA抑制对HCN通道活性和DRG神经元兴奋性的影响。我们在全细胞和单通道条件下的膜片钳实验表明，KT5720（一种细胞膜可渗透的PKA特异性抑制剂）对PKA的抑制显著减弱了HCN通道电流。对新分离的DRG神经元的电流钳记录显示，KT5720降低了过冲幅度，提高了动作电位的阈值。此外，我们的活细胞钙成像实验表明，KT5720显著降低了细胞内钙水平。总的来说，这是第一篇关于KT5720减弱HCN通道活性和细胞内Ca（2+），从而降低DRG神经元兴奋性的报告。因此，我们的数据强烈表明，PKA是治疗HCN和DRG神经元相关疾病的潜在靶点。[2]

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选择性PKA抑制剂KT5720减弱新鲜分离的大鼠DRG神经元的Ih[2]
通过常规全细胞膜片钳技术研究了PKA抑制对DRG神经元Ih的影响。在-40的保持电位下 mV，全细胞Ih采用从-60到-140超极化的方案引发 mV in-10 mV间期，超极化刺激维持2 s、 然后回到1的保持电位 s.在记录过程中，电池电容保持不变。在对照条件下，在不添加任何化合物的情况下记录Ih，然后用5 mL 3 μM KT5720溶液注入记录室，显著衰减了整个细胞的Ih。录制结束时，10 μM ZD7288（一种选择性HCN通道抑制剂）被加入到镀液中，在ZD7288的存在下，剩余的内向电流被完全抑制（图1A）。为了证实KT5720对Ih的影响归因于PKA抑制，用H89进行了相同的实验，它与KT5720具有相同的效果（图1B），这证实了KT5720通过PKA抑制衰减Ih。此外，为了测试KT5720是否通过HCN通道抑制阻断Ih，在没有KT5720的情况下将ZD7288应用于DRG神经元。结果与我们的假设一致，ZD7288阻断了全细胞Ih。

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PKA抑制使HCN通道激活曲线向左偏移，其电流密度显著降低[2]
在上述段落中，我们已经证明，KT5720抑制PKA会显著降低Ih。这种抑制不仅影响电流幅度，而且对通道活动阈值也有影响。其后果是HCN通道激活曲线向负方向移动。这些点是从施加超极化电压阶跃后的尾电流振幅中获得的，并归一化为-140处的最大值 活化曲线已用玻尔兹曼函数拟合。如图2B所示，HCN通道V1/2从-81.91变为-81.91 mV（控制）至-100.85 mV（KT5720）（n=9，n=6）。此外，在3人在场的情况下 μM KT5720，Ih密度也下降。为确保HCN通道已完全激活，我们选择-140 mV作为统计分析电压，过去100年的平均电流振幅 阶跃刺激的ms。统计结果显示，Ih密度从16.82±1.77（对照组）降低到3.57±0.52（KT5720）（n=6，n=5；***p<0.005）（图2C）。

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KT5720（3μM）减缓HCN通道激活动力学[2]
由于KT5720（3μM）衰减了Ih振幅并增加了其激活阈值，从而将V1/2转移到更负的电位。我们进一步假设，KT5720抑制PKA可以减缓Ih活化动力学。Ih以持续-130引发 mV刺激2次 s.为了探索KT5720对Ih激活的影响，我们首先比较了对照组和KT5720（3μM）的原始记录。激活时间常数用单指数方程（I=Io+Ae−（x−xo）/τ）拟合，其中τ是时间常数，x表示以毫秒为单位的时间，I是电流。我们的结果表明，在3 μM KT5720（图3A）。此外，统计结果显示，Tau值从464.5±35.86变化 ms（控制）至4164.5±304.33 ms（KT5720）（n=11，n=7；***p<0.005）（图3B）。

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KT5720（3μM）抑制PKA可降低DRG神经元的兴奋性[2]
在AP结束时，人们认为Ih可以将膜电位去极化到阈值，从而诱导新的AP（Accili等人，2002）。它还报道了HCN通道选择性抑制剂ZD7288可以通过抑制AP来减弱DRG神经元的兴奋性（Chaplan等人，2003）。我们进一步假设，KT5720抑制Ih也可能对DRG神经元的兴奋性产生影响，因此，如图4A所示，对六只大鼠进行了电流钳记录。AP由2引起 s去极化电流，这证实了我们的假设。如图4A所示，使用3 μM KT5720对AP有显著抑制作用。此外，AP记录也是在10人在场的情况下进行的 μM ZD7288。如图4B所示，在这种情况下，KT5720没有显著影响，这证实了KT5720通过HCN通道抑制来衰减AP。AP阈值从-25.25±1.21变化 在控制条件下，mV降至-22.42±1.54 3存在时为mV μM KT5720（n=6，n=6）（图4C）。此外，AP过冲幅度从23.77±2.12显著降低 mV（控制）至6.93±1.39 mV（KT5720）（n=6，n=6；**p<0.01）（图4D）。

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KT5720对HCN单通道特性的影响[2]
据我们所知，到目前为止，还没有发表的文献报道新鲜分离的DRG神经元的单通道记录。因此，为了进一步揭示PKA通路调节HCN通道激活的机制，如图5A所示，进行了细胞附着单通道记录实验。为了消除不相关的影响，只有那些原始的gigaseal≥10 GΩ被考虑用于进一步记录。在gigaseal形成后，再等待15分钟以确保密封稳定。此外，在控制条件下没有观察到下降，10 添加μM ZD7288以确保记录的电流为Ih（数据未显示）。开路概率具有电压依赖特性，表明其在-50时从0.21增加 在-140时，mV降至0.91 mV，V1/2为-82.18 mV（图5），这与我们的全细胞记录结果和已发表的报告一致（Simeone等人，2005）。在3人在场的情况下 μM KT5720，Po的电压依赖特性完全被抑制。在-90 mV时，KT5720抑制了71%的Po，也使电流幅度从1.06±0.18略有衰减 pA（对照）降至1.02±0.13 pA（KT5720）。此外，在应用3之前和之后 μM KT5720，HCN通道电导从12.41±0.69降低 pS降至11.54±0.76 pS，但除Po外，电流振幅和通道电导的变化均无统计学意义（n=13，n=9）（表1）。因此，我们的数据表明，KT5720对PKA的抑制降低了HCN通道Po。

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KT5720（3μM）抑制PKA可降低细胞内Ca2+浓度[2]
先前的研究表明，HCN通道活性与细胞内Ca2+有关（Hagiwara和Irisawa，1989），这暗示PKA诱导的Ih抑制可能归因于细胞内Ca2+水平的变化。为了探索KT5720对DRG神经元细胞内Ca2+水平的影响，对新鲜分离的DRG神经元进行了实时钙成像实验。Fura 2-AM（一种比率和紫外光可激发染料）用作细胞内Ca2+指示剂，双波激发紫外光由TILL的多色V光源产生。记录盖玻片涂有聚赖氨酸以固定细胞。首先，进行了图6A所示的实验。在对照部分，非常小心地确保没有发生细胞内降解。如图6A所示，应用KT5720（3μM）显著降低了细胞内Ca2+水平，其他12个细胞也获得了与图6A所述类似的结果。对照条件下的荧光比（340/380nm）为0.80±0.05（n=13，n=4）。此后，在3的存在下，荧光比降至0.64±0.06 μM KT5720（n=13，n=4；图6B）。因此，KT5720的应用降低了DRG神经元细胞内的Ca2+水平，因此，PKA抑制诱导了Ih衰减，至少部分是由于细胞内Ca2+的减少。

在 MDR1 子弹模型中，KT5720（5 mg/kg；腹腔注射；每天一次，持续 8 天）完全逆转了 DNR 的影响 [1]。
KT-5720（5mg/kg）使MDR1转基因小鼠模型的骨髓对柔红霉素（8mg/kg）敏感，而没有全身毒性作用。[1]

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KT5720体外逆转血液系统恶性肿瘤的多药耐药性[1]
由于KT5720逆转了LM1/MDR和其他耐药细胞系的耐药性，我们进一步评估了其在原代细胞培养中对血液病患者恶性细胞的化学增敏作用（图3）。在这项研究中，我们收集了两组具有耐药性的血液系统恶性肿瘤患者的骨髓样本。第一组来自CML-BC患者（N=8；骨髓中95%以上的成髓细胞），第二组包括MM患者（N=6；骨髓中85%以上的恶性浆细胞）。在单独存在50 ng/ml的DOX（这是体内治疗可实现的细胞浓度）或与5μM的KT-5720联合存在的情况下，测试骨髓样本的MDR1 RNA表达水平和培养中的细胞存活率。之所以选择这种浓度的KT-5720，是因为之前发现它对表达与原代样本中相似或更高水平MDR1的各种细胞系最有效。在这些实验中，在没有细胞毒性剂（DOX）的情况下，细胞计数被视为对照，细胞存活率为100%。应注意的是，单独与KT-5720一起孵育对所有样品的细胞生长和存活没有影响（数值与对照组、未经处理的样品相同，数据未显示），表明单独使用KT-5720在测试剂量下没有细胞毒性活性。

如图3所示，所有患者的原代细胞均对DOX具有耐药性（细胞存活率范围为85-98%）。然而，在存在KT5720的情况下，所有多发性骨髓瘤样本的细胞对DOX的耐药性都发生了逆转（细胞存活率范围为0-20%）。MDR1在所有这些样本中分别过表达。对CML-BC患者骨髓样本的分析显示，八分之六的患者的细胞对DOX的耐药性被KT-5720逆转。然而，在KT5720的两个样本的细胞中，没有明显的化学增敏作用，也没有检测到MDR1的表达。这表明八分之二的CML-BC患者的细胞中存在对DOX的MDR1无关耐药性，并且这种耐药性不能被KT-5720逆转。

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KT5720体内效应[1]
为了评估KT5720是否可以在体内逆转MDR，我们在MDR1转基因小鼠模型上测试了它的活性。这些小鼠（骨髓中过表达人MDR1基因）对一组细胞毒性药物诱导的白细胞减少症具有抗性。KT-5720（单独或与DNR一起）对正常小鼠骨髓与MDR1转基因小鼠骨髓的影响如图4所示。根据先前的研究选择药物剂量（DNR），以诱导正常小鼠在给药后5天内白细胞（WBC）显著减少（>50%），且不会引起全身毒性。在5 mg/kg的KT-5720剂量下，DNR在MDR小鼠中诱导的白细胞减少症与仅用DNR治疗的非MDR小鼠的白细胞降低症相当（图4）。这表明该剂量的KT-5720在该动物模型中完全逆转了DNR耐药性。此外，单独使用KT-5720对正常小鼠和MDR小鼠的白细胞计数没有影响，表明在逆转MDR小鼠DNR耐药性所需的剂量下，单独使用KT-5720对骨髓没有毒性作用。

由于第一代和第二代化学增敏剂在体内具有药理学副作用，我们测试了单独或联合使用DNR或KT5720两次给药后，小鼠体内施用KT5720是否显示出一般毒性，如第2节所述。这项研究表明，KT-5720在逆转MDR1转基因小鼠耐药性所需的浓度（5mg/kg）下显然没有毒性。与单独使用DNR相比，KT-5720和DNR的组合没有额外的毒性（小鼠存活率为95%）。因此，KT-5720不会像第一代和第二代Pgp调节剂报告的那样增加对细胞毒性剂（DNR）的毒性。

KT5720（3μM）抑制PKA可降低细胞内Ca2+浓度[2]
先前的研究表明，HCN通道活性与细胞内Ca2+有关（Hagiwara和Irisawa，1989），这暗示PKA诱导的Ih抑制可能归因于细胞内Ca2+水平的变化。为了探索KT5720对DRG神经元细胞内Ca2+水平的影响，对新鲜分离的DRG神经元进行了实时钙成像实验。Fura 2-AM（一种比率和紫外光可激发染料）用作细胞内Ca2+指示剂，双波激发紫外光由TILL的多色V光源产生。记录盖玻片涂有聚赖氨酸以固定细胞。首先，进行了图6A所示的实验。在对照部分，非常小心地确保没有发生细胞内降解。如图6A所示，应用KT5720（3μM）显著降低了细胞内Ca2+水平，其他12个细胞也获得了与图6A所述类似的结果。对照条件下的荧光比（340/380nm）为0.80±0.05（n=13，n=4）。此后，在3μM KT5720的存在下，荧光比降至0.64±0.06（n=13，n=4；图6B）。因此，KT5720的应用降低了DRG神经元细胞内的Ca2+水平，因此，PKA抑制诱导了Ih衰减，至少部分是由于细胞内Ca2+的减少。

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KT5720（3μM）减缓HCN通道激活动力学[2]
由于KT5720（3μM）衰减了Ih振幅并增加了其激活阈值，从而将V1/2转移到更负的电位。我们进一步假设，KT5720抑制PKA可以减缓Ih活化动力学。通过持续-130 mV刺激2秒引发Ih。为了探索KT5720对Ih激活的影响，我们首先比较了对照组和KT5720（3μM）的原始记录。激活时间常数用单指数方程（I=Io+Ae−（x−xo）/τ）拟合，其中τ是时间常数，x表示以毫秒为单位的时间，I是电流。我们的结果表明，在3μM KT5720的存在下，Ih活化时间常数要长得多（图3A）。此外，统计结果显示，Tau值从464.5±35.86 ms（对照组）变为4164.5±304.33 ms（KT5720）（n=11，n=7；***p<0.005）（图3B）。

细胞活力测定[1]
细胞类型： LM1/MDR 细胞（携带并表达人类 MDR1 转基因）
测试浓度： 0-8 µM
孵育时间：72小时
实验结果：LM1/MDR细胞对秋水仙碱的敏感性以剂量依赖性方式增加。

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细胞系和细胞培养[1]
药物敏感的LM1细胞系及其耐药的LM1/MDR细胞变体用于体外研究。LM1是BALB/c来源的小鼠淋巴瘤细胞系。 LM1/MDR是用含有人MDR1 cDNA的逆转录病毒载体转导的LM1细胞的亚系。这些细胞在添加了10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。在LM1/MDR细胞的培养基中额外补充700ng/ml或其他指示的COL。细胞在37°C的5%CO2中孵育。

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原代细胞培养[1]
收集难治性CML-BC和MM患者的骨髓样本。患者在采样程序前给予知情书面同意。通过Ficoll-Hypaque梯度离心从骨髓样本中分离出单核细胞，用磷酸缓冲盐水洗涤，并以1×106个细胞/ml的浓度重新悬浮在含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中。细胞在37°C的5%CO2悬浮液中孵育。

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RNA制备和分析[1]
根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒从骨髓单核细胞中分离总RNA。将RNA样品（每个10μg）与RNA样品加载缓冲液混合，在变性的1%琼脂糖凝胶上电泳，然后转移到Hybond-N尼龙滤膜上进行Northern印迹，如前所述。简而言之，645 bp 32P放射性标记的PCR产物用作Northern分析的探针。PCR以质粒pHaMDR为模板，引物为：5′-AAGCTTAGTACACAAGGGCTG-3′（义）；5′-CTCCCAGCACCTTCTAGT-3′（反义）。在Paltier热循环仪PTC-200（美国马萨诸塞州MJ Research）上进行了35个循环（94°C下1分钟，55°C下一分钟，72°C下另一分钟）。如前所述，使用MDR1探针或β-actin缺口翻译探针进行Northern杂交。

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流式细胞术分析[1]
如前所述，测量细胞对Pgp底物Rh123的细胞摄取。简而言之，在37°C下，在没有或存在化学增敏剂（20μM）的情况下，将1×106个细胞在组织培养基中预孵育30分钟。在37°C下，在Rh123（0.5μg/ml）存在下额外孵育1小时后，用4°C的磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞，用配备488nm氩激光的FACS扫描流式细胞仪测量累积的Rh123的荧光。在530nm带通滤光片后收集Rh123的绿色荧光。样品在前向散射和侧向散射上进行门控，以排除细胞碎片和团块，并减去细胞的固有荧光（空白，未暴露于Rh123的细胞）。

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细胞毒性和化学致敏平板试验[1]
如前所述，在单层生长试验中测定LM1/MDR细胞系对细胞毒性药物和/或Pgp调节剂的敏感性。简而言之，如所示，在不存在或存在不同浓度的细胞毒性药物和/或Pgp调节剂的情况下，将含药物培养基中的4×104个细胞铺在96孔组织培养板的每个孔中。72小时后，用磷酸缓冲盐水洗涤板，用50%甲醇中的0.5%（w/v）亚甲基蓝染色1小时，用H2O洗涤并风干。在这个过程中，只有存活的染色细胞仍然附着在塑料盘上。通过EDAS 290文件和分析系统测量染色细胞的密度。对于每种调节剂，在不同浓度的调节剂和给定（固定）浓度的细胞毒性剂存在下，从细胞存活测量曲线中提取IC50（对细胞生长的50%抑制浓度）值。对于每种浓度的化学增敏剂，计算EC50（50%有效浓度）值。EC50是在给定浓度的化学增敏剂存在下杀死50%细胞所需的细胞毒性剂的浓度。

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电生理全细胞膜片钳记录[2]
使用Axopatch 200B、Digidata 1440A和pClamp 10.2软件（Molecular Devices，Union city，CA）记录全细胞电流，信号已用八极贝塞尔滤波器900CT/9L8L（Frequency Devices（Ottawa，IL））过滤。使用10毫米长的硼硅酸盐玻璃来制备贴片移液管。用Narishige PP-830两步拉拔器拉动移液管，然后用Micro-Forge MF-830火焰抛光机抛光，以获得3-5的最终阻力 MΩ.

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电生理单通道膜片钳记录[2]
单通道记录是在蜂窝附着模式下实现的。火焰抛光硼硅酸盐玻璃移液管，最终电阻为8-10 选择MΩ进行记录，密封电阻≥10 数据分析考虑了GΩ，10 添加μM ZD7288以确保记录的单通道电流为Ih（数据未显示）。只有那些看起来闪闪发光的DRG神经元被选为实验对象。所有单通道实验均在室温25°C–26°C下进行。

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活细胞钙显像[2]
对于细胞内Ca2+成像实验，250 将μL聚赖氨酸加入每个直径为35mm的玻璃底皿中，在37°C下孵育，将聚赖氨酸酯放在盖玻片上孵育1小时 h、 然后吸出盘子，用2 mL无菌水三次。将细胞悬浮液加入培养皿中，在室温下保持30 min，让细胞附着在盘子底部。将Fura 2-AM溶液用浴液稀释至终浓度为2 μM.然后从培养皿中取出上清液，250 将μL Fura 2-AM工作溶液加入盘中，在室温下避光储存30分钟 min。然后除去Fura 2-AM工作溶液，用浴液洗涤细胞3次。使用OLYMPUS IX81电动倒置研究显微镜在×40油物镜上采集Ca2+成像，相应软件为MetaFluor 7.7.2.0。

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溶液和药物[2]
含DRG组织的溶液具有以下成分（mg/mL）：DMEM 10 pH 7.4的氢氧化钠溶液。DRG消化液含有（mg/mL）DMEM 10，I型胶原酶1，胰蛋白酶0.5 pH 7.4的氢氧化钠溶液。全细胞膜片钳记录浴溶液含有（以mM计）NaCl 80、KCl 5、BaCl2 2、NaH2CO3 26、CoCl2 2、TEAC 40、CaCl2 1、4-AP 4、CdCl2 0.2、D-葡萄糖10 pH 7.4的氢氧化钠溶液，1 μM TTX被加入以阻断无关的钠通道。全细胞膜片钳记录移液管溶液含有（以mM计）NaCl 5、K+-葡萄糖酸盐135、ATP-Mg2+2、GTP Na+0.4、EGTA 0.5、HEPES 10 pH 7.3的KOH溶液。单通道膜片钳记录浴溶液含有（以mM计）葡萄糖酸钾100、KCl 50、NaCl 4、CaCl2 1、EGTA 5、HEPES 10和葡萄糖10 pH 7.25的KOH溶液。单通道膜片钳记录移液管溶液含有（以mM计）NaCl 140、KCl 5、CaCl2 2、MgCl2 1、HEPES 10 pH 7.4，用氢氧化钠加1 μM TTX，10 mM茶，0.2 mM CdCl2，10 μM苦味毒被补充以阻断其他电压和配体门控通道。

动物/疾病模型： MDR1转基因小鼠模型[1]。
剂量： 5 mg/kg
给药途径： 腹腔注射（ip）；每日一次，连续8天
实验结果： MDR小鼠中柔红霉素诱导的白细胞减少症与单独使用柔红霉素治疗的非MDR小鼠相当。测量结果相同。

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KT5720联合化疗在小鼠中的总体毒性评价[2]
雌性BALB/c小鼠（8周龄，体重20-22 g）被分为若干组，每组20只，分别于第0天和第10天接受柔红霉素、KT5720或二者联合治疗。所有治疗均采用腹腔注射。在第二次给药后 2 个月内监测小鼠的存活情况。

对于体内实验，将KT5720原液用 5% (v/v) 葡萄糖磷酸盐缓冲液稀释至适合腹腔注射 (ip) 的浓度。

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体外原代恶性细胞的细胞毒性和化疗增敏作用[2]
从 CML-BC 或 MM 患者的骨髓样本中分离单核细胞，并在 37 °C 下于 24 孔板中培养。对于每位患者，将初始密度为 2 × 10⁵ 个细胞/ml 的细胞在有或无 DOX、KT5720 或二者组合的情况下进行培养。培养72小时后，取悬浮细胞样品用0.4%台盼蓝溶液染色，并使用超薄纽鲍尔血细胞计数板计数未染色的活细胞。对照组（未处理组）的细胞计数被视为100%细胞存活率。细胞存活率的计算方法为：处理组细胞计数除以对照组（未处理组）细胞计数。

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试验条件[2]
研究对象为8周龄雌性同窝仔鼠。DNR通过腹腔右下象限注射给药。在化疗/化疗增敏联合试验中，KT5720在DNR给药前2小时，通过腹腔左下象限注射给药。将药物和化学增敏剂（如KT5720）的浓度调整到 5% 葡萄糖磷酸盐缓冲盐水中，以便每只小鼠注射的最大体积为 0.2 ml。

[1]. In vitro and in vivo reversal of MDR1-mediated multidrug resistance by KT-5720: implications on hematological malignancies. Leuk Res. 2006 Sep;30(9):1151-8.

[2]. Novel role of KT5720 on regulating hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel activity and dorsal root ganglion neuron excitability. DNA Cell Biol. 2013 Jun;32(6):320-8.

[3]. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 2000 Oct 1;351(Pt 1):95-105.

KT5720 是一种有机杂八环化合物，其结构为 1H,1'H-2,2'-联吲哚，其中氮原子已与己基 (3S)-3-羟基-2-甲基四氢呋喃-3-羧酸酯（2R,3S,5S 产物）的 2 位和 5 位发生形式上的氧化偶联，并且联吲哚部分的 3 位和 3' 位也已与 1,5-二氢-2H-吡咯-2-酮的 3 位和 4 位发生形式上的氧化偶联。它是一种 EC 2.7.11.11（cAMP 依赖性蛋白激酶）抑制剂。它是一种有机杂八环化合物、γ-内酰胺、叔醇、羧酸酯、半缩醛、半合成衍生物和吲哚咔唑。它在功能上与K-252a相关。

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由于MDR1 (ABCB1)基因及其P-糖蛋白(Pgp)产物的过度表达而导致的多药耐药(MDR)是血液系统恶性肿瘤治疗的一大障碍。本研究评估了KT-5720在体外和体内逆转Pgp依赖性MDR的效力。KT5720（而非其近缘衍生物K252a和K252b）在无毒浓度下逆转了LM1/MDR细胞系的多药耐药性，并增加了罗丹明123 (Rh123)的积累。KT-5720显著逆转了慢性粒细胞白血病急变期(CML-BC)和晚期多发性骨髓瘤(MM)患者原发性恶性细胞的MDR1依赖性耐药性。此外，KT-5720（5 mg/kg）可使 MDR1 转基因小鼠模型的骨髓对柔红霉素（8 mg/kg）敏感，且无全身毒性作用。因此，KT-5720 可被视为多种血液系统恶性肿瘤联合治疗的候选药物，这些肿瘤的治愈主要受 Pgp 活性的影响。[1]

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本研究表明，KT5720 可有效逆转多种血液系统恶性肿瘤模型中 Pgp 依赖性耐药性。因此，本研究支持将 KT-5720 开发为未来联合治疗多种血液系统恶性肿瘤（包括对伊马替尼无反应的慢性粒细胞白血病急变期 (CML-BC)、淋巴瘤和晚期多发性骨髓瘤 (MM)）的潜在候选药物。[1]

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超极化激活的环核苷酸门控 (HCN) 通道在背根神经节 (DRG) 神经元中表达，参与多种调节 DRG 功能的机制。蛋白激酶A (PKA) 是一种重要的激酶，在几乎所有类型的细胞中都发挥着关键作用；它调节离子通道活性、细胞内Ca²⁺浓度，并调控细胞信号转导。然而，PKA抑制对背根神经节(DRG)神经元中HCN通道活性的影响尚不明确。本研究探讨了PKA抑制对HCN通道活性和DRG神经元兴奋性的影响。我们利用膜片钳技术，在全细胞和单通道条件下进行实验，结果表明，使用细胞膜通透性PKA特异性抑制剂KT5720抑制PKA可显著减弱HCN通道电流。对新鲜分离的DRG神经元进行电流钳记录显示，KT5720降低了动作电位的超射幅度并提高了动作电位的阈值。此外，我们的活细胞Ca²⁺成像实验表明，KT5720显著降低了细胞内Ca²⁺水平。总的来说，这是首个报道KT5720可减弱HCN通道活性和细胞内Ca²⁺浓度，从而降低DRG神经元兴奋性的报告。因此，我们的数据强烈提示PKA是治疗HCN通道和DRG神经元相关疾病的潜在靶点。[2]

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总之，这是首个研究PKA抑制对HCN通道活性的影响，并进一步阐明其对DRG神经元兴奋性影响的研究。我们的全细胞和单通道电生理数据表明，PKA抑制可显著减弱HCN通道活性。我们进一步证实，KT5720选择性抑制PKA可降低细胞内Ca²⁺水平，并进一步降低DRG神经元兴奋性。因此，我们的数据强烈提示PKA是HCN通道活性和DRG神经元兴奋性的关键介质。因此，PKA可能代表治疗HCN通道和DRG神经元相关疾病的潜在药理学靶点。 [2]

C32H31N3O5

537.62

537.226

C, 71.49; H, 5.81; N, 7.82; O, 14.88

108068-98-0

454202

White to off-white solid powder

1.49g/cm3

715ºC at 760mmHg

386.2ºC

1.88E-21mmHg at 25°C

1.752

5.934

94.72

2

5

7

40

1060

3

CCCCCCOC([C@]1(O)C[C@H]2N3C4=CC=CC=C4C5=C3C6=C(C7=C5C(NC7)=O)C8=CC=CC=C8N6[C@@]1(O2)C)=O

ZHEHVZXPFVXKEY-RUAOOFDTSA-N

InChI=1S/C32H31N3O5/c1-3-4-5-10-15-39-30(37)32(38)16-23-34-21-13-8-6-11-18(21)25-26-20(17-33-29(26)36)24-19-12-7-9-14-22(19)35(28(24)27(25)34)31(32,2)40-23/h6-9,11-14,23,38H,3-5,10,15-17H2,1-2H3,(H,33,36)/t23-,31+,32+/m0/s1

hexyl (15R,16S,18S)-16-hydroxy-15-methyl-3-oxo-28-oxa-4,14,19-triazaoctacyclo[12.11.2.115,18.02,6.07,27.08,13.019,26.020,25]octacosa-1,6,8,10,12,20,22,24,26-nonaene-16-carboxylate

KT-5720; KT5720; KT 5720; KT-5720; 58HV29I28S; Hexyl (15R,16R,18S)-16-hydroxy-15-methyl-3-oxo-28-oxa-4,14,19-triazaoctacyclo[12.11.2.115,18.02,6.07,27.08,13.019,26.020,25]octacosa-1,6,8,10,12,20,22,24,26-nonaene-16-carboxylate; hexyl (15R,16S,18S)-16-hydroxy-15-methyl-3-oxo-28-oxa-4,14,19-triazaoctacyclo[12.11.2.115,18.02,6.07,27.08,13.019,26.020,25]octacosa-1,6,8,10,12,20,22,24,26-nonaene-16-carboxylate; (9R,10S,12S)-2,3,9,10,11,12-hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid hexyl ester; KT 5720

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

MEthanol : ~5 mg/mL (~9.30 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。