ML303

目录号: V32427 纯度: ≥98%
ML303是一种吡唑并吡啶化合物,是流感病毒非结构蛋白1(NS1)的拮抗剂(IC90为155 nM),其针对流感病毒H1N1亚型的EC50为0.7 μM。
ML303 CAS号: 1638211-04-7
产品类别: New2
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产品描述
ML303是一种吡唑并吡啶化合物,是流感病毒非结构蛋白1(NS1)的拮抗剂(IC90为155 nM),其针对流感病毒H1N1亚型的EC50为0.7 μM。
生物活性&实验参考方法
靶点
MDCK cells treated with ML303 (20 μM) for 6 hours exhibit increased levels of IFN-β mRNA [1].
体外研究 (In Vitro)
用 ML303 (20 μM) 处理 6 小时的 MDCK 细胞表现出 IFN-β mRNA 水平升高 [1]。
ML303(化合物32)在TCID50实验中,对MDCK细胞中的甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)的抑制IC90为155 nM。在10 µM浓度下,能使病毒滴度降低128倍。
在针对季节性流感病毒A/California/7/2009 (H1N1)的细胞病变效应(CPE)保护实验中,ML303的EC50为0.7 µM,EC90 >50 µM。其在MDCK细胞中的CC50为25.3 µM,选择性指数(SI50)为38。
ML303在基于酵母的实验中,能够逆转NS1诱导的缓慢生长表型,在50 µM浓度下恢复酵母生长,表明其具有功能性NS1拮抗作用,且在酵母中无急性毒性。
在感染A/PR/8/34的MDCK细胞中,ML303(20 µM)能显著恢复通过RT-PCR检测到的IFN-β mRNA水平,效果与阳性对照poly(I:C)相当。这种恢复作用具有感染特异性,因为该化合物在未感染细胞中不诱导IFN-β mRNA。
在293细胞的荧光素酶报告基因实验中,ML303(20 µM)能够恢复被共转染的NS1所抑制的、由poly(I:C)诱导的IFN-β启动子活性,证实其阻断NS1功能的能力。该化合物在无NS1表达时对荧光素酶活性无影响。
蛋白质印迹分析证实,ML303不影响感染细胞中NS1蛋白的稳态水平,表明其通过功能性作用而非降解NS1来发挥作用。[1]
细胞实验
Western Blot 分析[1]
细胞类型: MDCK 细胞用 A/PR/8/34 以 MOI 2 感染 6 小时。
测试浓度:20μM。
孵化持续时间:6 小时。
实验结果:MDCK细胞中IFN-β mRNA水平恢复。
病毒复制抑制实验: MDCK细胞以0.1的感染复数(MOI)感染甲型流感病毒A/PR/8/34。加入化合物并孵育48小时。收集上清液,使用血凝实验和标准TCID50分析测定病毒滴度。相对于DMSO对照计算降低倍数。[1]
细胞毒性实验: 在未感染的MDCK细胞中使用基于ATP含量的细胞活力测定法(如CellTiter-Glo)测试化合物的细胞毒性。确定CC50值。[1]
CPE保护实验: MDCK细胞感染不同流感病毒株。加入化合物,孵育一段时间后,测量细胞活力以确定化合物保护细胞免受病毒致死作用的能力。EC50、EC90和CC50值从剂量反应曲线中得出。[1]
酵母生长恢复实验: 表达流感NS1蛋白的酵母菌株表现出缓慢生长表型。在化合物或DMSO存在下培养酵母。在22、42和60小时监测生长(OD600nm)。缓慢生长表型的逆转表明NS1拮抗作用。[1]
IFN-β mRNA恢复实验(RT-PCR): MDCK细胞以MOI为2感染A/PR/8/34,并用化合物处理6小时。提取总RNA,通过RT-PCR分析IFN-β mRNA水平,β-肌动蛋白作为内参对照。[1]
IFN-β荧光素酶报告基因实验: 将受人类IFN-β启动子控制的萤火虫荧光素酶报告质粒与NS1表达质粒共转染至293细胞。16小时后,用poly(I:C)诱导启动子,并加入测试化合物。24小时后测量荧光素酶活性,以评估化合物对抗NS1介导的抑制的能力。[1]
NS1蛋白免疫印迹实验: 裂解感染并经化合物处理的MDCK细胞。蛋白质通过SDS-PAGE分离,转移至膜上,用抗NS1和α-微管蛋白(内参对照)的抗体进行检测,以评估NS1蛋白水平。[1]
动物实验
药代动力学研究:雄性 C57BL/6 小鼠(每种化合物 3 只)单次腹腔注射 30 mg/kg 的 ML303。文中未明确说明给药所用的制剂/溶剂。分别于给药后不同时间点采集血液(用于血浆分析)、肝脏和肺组织。测定这些组织中 ML303 的浓度,以计算药代动力学参数。[1]
药代性质 (ADME/PK)
体外ADME:ML303在小鼠肝微粒体(MLM)中表现出良好的稳定性,孵育15分钟和30分钟后,母体化合物的残留量分别为66%和45%。其水溶性为3.1 µM。在Caco-2单层细胞渗透性测定中,其从顶端到基底外侧方向的表观渗透率(Papp,AB)为0.10 × 10⁻⁶ cm/s,从基底外侧到顶端方向的表观渗透率(Papp,BA)为0.22 × 10⁻⁶ cm/s,外排比为2.29。低渗透性归因于其低溶解度。 [1]
体内药代动力学(小鼠,腹腔注射):单次腹腔注射 30 mg/kg ML303 后,血浆中 Cmax 为 2457 ng/mL,肝脏中为 49,600 ng/mL,肺中为 18,567 ng/mL,达峰时间 (Tmax) 为 0.25 小时。
末端半衰期 (t₁/₂) 在血浆中约为 4.6 小时,在肝脏中约为 4.7 小时,在肺中约为 4.5 小时。
血浆中浓度-时间曲线下面积 (AUC) 为 53,894 hng/mL。肝脏(AUC 比值约为 10.5)和肺(AUC 比值约为 7.0)中的暴露量显著高于血浆。
该化合物在肺部(流感病毒感染的主要部位)的浓度维持在 1 µM 以上超过 12 小时。 [1]
毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK)
在MDCK细胞活力测定中,ML303在浓度高达100 µM时未显示细胞毒性,这使其具有较高的选择性指数(SI50 >100)。在酵母生长恢复测定中,该化合物在50 µM浓度下未显示急性毒性。在单剂量小鼠药代动力学研究(30 mg/kg,腹腔注射)中,未观察到不良反应或毒性迹象。[1]
参考文献

[1]. Identification, design and synthesis of novel pyrazolopyridine influenza virus nonstructural protein 1 antagonists. Bioorg Med Chem Lett. 2019 May 1;29(9):1113-1119.

其他信息
ML303 属于一类新型吡唑并吡啶类小分子,经酵母系统中的定量高通量筛选 (qHTS) 鉴定为流感病毒 NS1 拮抗剂。其作用机制被认为是抑制甲型流感病毒 NS1 蛋白的功能,从而逆转 NS1 介导的宿主先天免疫反应抑制,特别是 IFN-β 的诱导。该化合物定位为研究 NS1 功能的工具,并有望在未来的体内概念验证研究中验证 NS1 作为流感治疗靶点的有效性。[1]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C21H16F3N3O2
分子量
399.36585521698
精确质量
399.119
CAS号
1638211-04-7
PubChem CID
136141525
外观&性状
White to off-white solid powder
LogP
5
tPSA
60.2
氢键供体(HBD)数目
1
氢键受体(HBA)数目
7
可旋转键数目(RBC)
3
重原子数目
29
分子复杂度/Complexity
556
定义原子立体中心数目
0
SMILES
FC(C1C=CC(=CC=1)N1C2C(C(C)=N1)=C(C=CN=2)C1C=CC(=C(C=1)OC)O)(F)F
InChi Key
YBRHGNCGFMRGSV-UHFFFAOYSA-N
InChi Code
InChI=1S/C21H16F3N3O2/c1-12-19-16(13-3-8-17(28)18(11-13)29-2)9-10-25-20(19)27(26-12)15-6-4-14(5-7-15)21(22,23)24/h3-11,28H,1-2H3
化学名
2-methoxy-4-[3-methyl-1-[4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrazolo[3,4-b]pyridin-4-yl]phenol
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
溶解度 (体内实验)
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方,主要用于溶解难溶或不溶于水的产品(水溶度<1 mg/mL)。 建议您先取少量样品进行尝试,如该配方可行,再根据实验需求增加样品量。

注射用配方
(IP/IV/IM/SC等)
注射用配方1: DMSO : Tween 80: Saline = 10 : 5 : 85 (如: 100 μL DMSO 50 μL Tween 80 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备:将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中,得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL DMSO 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL DMSO 900 μL Corn oil)
示例: 注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液,加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。
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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如:100 μL DMSO 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备(4°C,储存1周):将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中,得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如: 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精) 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如: 50 μL DMSO 100 μL PEG300 200 μL Castor oil 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10: 10 : 80 (如: 100 μL Ethanol 100 μL Cremophor 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL EtOH 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL EtOH 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)


口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中,得到0.5%CMC-Na澄清溶液;然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中,得到悬浮液。
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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合


注意: 以上为较为常见方法,仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型,对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物,需通过前期实验来确定(建议先取少量样品进行尝试),包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案:
1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL;

3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用!
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 2.5039 mL 12.5197 mL 25.0394 mL
5 mM 0.5008 mL 2.5039 mL 5.0079 mL
10 mM 0.2504 mL 1.2520 mL 2.5039 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);

4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。

计算器

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度,具体如下:

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示:
假如化合物的分子量为350.26 g/mol,在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少?
  • 在分子量(MW)框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在“体积”框中输入5,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式,您可以计算体积和浓度。

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如,可以输入C1、C2和V2来计算V1,具体如下:

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液?
使用方程式C1V1=C2V2,其中C1=10mM,C2=25μM,V2=25 ml,V1未知:
  • 在C1框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在C2框中输入25,然后选择正确的单位(μM)
  • 在V2框中输入25,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL(0.1 ml)出现在V1框中
g/mol

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成,具体如下:

注:化学分子式大小写敏感:C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量(分子量)的说明:
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量),请输入化学/分子式,然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义:
  • 分子质量(或分子量)是一种物质的一个分子的质量,用统一的原子质量单位(u)表示。(1u等于碳-12中一个原子质量的1/12)
  • 摩尔质量(摩尔重量)是一摩尔物质的质量,以g/mol表示。
/

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器(澄清溶液)
第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量)
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶/难溶于水的化合物),不同的产品和批次配方组成不同,如对配方有疑问,可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外,请注意这只是一个配方计算器,而不是特定产品的确切配方。
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计算结果:

工作液浓度 mg/mL;

DMSO母液配制方法 mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。

体内配方配制方法μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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