Necrosis; MLKL/mixed lineage kinase domain-like protein
Mixed Lineage Kinase Domain-like protein (MLKL) [2][3]. The compound targets the N-terminal coiled-coil (CC) domain of human MLKL, specifically covalently modifying the Cys86 residue [2]. It does not inhibit mouse MLKL due to a tryptophan residue at the corresponding position [2].

坏死磺酰胺通过阻断MLKL的N端CC结构域功能来抑制MLKL介导的坏死。在RIP3激活后，坏死磺酰胺可阻止坏死的发生。即使浓度低至5 μM，坏死磺酰胺对RIP3缺陷的Panc-1细胞中TNF-α联合Smac模拟物诱导的细胞凋亡也无影响。在人细胞中，坏死磺酰胺能有效抑制坏死，但在小鼠细胞中则无效。坏死磺酰胺共价修饰的人 MLKL 中第 86 位残基的半胱氨酸，在小鼠 MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）中被色氨酸残基取代，这解释了坏死磺酰胺的物种特异性[2]。

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- 坏死磺酰胺 (NSA) 可抑制人结肠癌 HT-29 细胞和 FADD 缺失的人 T 细胞白血病 Jurkat 细胞的坏死，IC50 小于 1 μM，其效力高于坏死抑制剂-1。衍生物 3-甲氧基吡嗪-2-基的 IC50 小于 0.2 μM [2]。
- 在表达 RIP3 的 HeLa 细胞系中，NSA 能有效阻断 TNF-α 和 Smac 模拟物诱导的坏死 [2]。
- 在表达小鼠 RIP3 的小鼠 3T3 细胞中，坏死对 NSA 抑制不敏感 [2]。
- 活细胞成像显示，NSA 将坏死阻滞在 RIP3 形成离散斑点且无法扩大的阶段 [2]。
- 在表达 RIP3 的 HeLa 细胞中，NSA 不阻断 RIP1 和 RIP3 的相互作用，但增强了它们的相互作用和磷酸化 [2]。
- NSA 处理阻断了通过膜渗漏实验测量的坏死性凋亡，但并未阻断磷酸化 MLKL 信号 [3]。
- 在无细胞脂质体渗漏实验中，纯化的重组磷酸化模拟物 MLKL (T357E/S358D) 导致含有 5% PI(4,5)P2 的脂质体释放超过 50% 的 Tb3+，导致含有 15% 心磷脂的脂质体释放接近 90% 的 Tb3+。野生型 MLKL 分别导致约 30% 和 60% 的释放。 坏死磺酰胺 (2 μM) 显著抑制了两种脂质体的泄漏[3]。
- 在 HT-29 细胞中，NSA 阻止了磷酸化 MLKL 在 Triton X-114 相分离实验中转移到去垢剂相，表明它阻断了磷酸化 MLKL 向细胞膜的靶向[3]。
- 在阿尔茨海默病大鼠模型（AlCl3 诱导）中，与 AD 组相比，NSA 治疗显著降低了海马中磷酸化 MLKL (p-MLKL, Ser358) 的水平 87.24%，而未影响海马中升高的 p-RIP1 (Ser166) 和 p-RIP3 (Ser232) 水平[4]。
- 在 AD 大鼠模型中，NSA 治疗显著降低了海马中 β-淀粉样蛋白和 BACE1 的水平，分别降低了 67.4% 和 69.6%，并降低了与 AD 组相比，p-tau (Ser404) 和 GSK-3β 分别降低了 74.2% 和 74.3% [4]。

坏死磺酰胺 (NSA) 是一种小分子，靶向 MLKL（坏死性凋亡的最终执行者），从而特异性抑制坏死性凋亡。

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- 在阿尔茨海默病大鼠模型（17 mg/kg AlCl3 诱导 6 周）中，使用坏死磺酰胺（1.65 mg/kg/天，腹腔注射，持续 6 周）治疗可显著改善空间学习和记忆缺陷，Morris 水迷宫（逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间延长）和 Y 迷宫（自发交替百分比增加，同一臂返回次数减少）行为学测试结果证实了这一点 [4]。
- 在同一阿尔茨海默病大鼠模型中，NSA 治疗显著减少了海马 CA1 区的 β-淀粉样蛋白斑块沉积，刚果红染色结果显示减少了近 50% [4]。
- 给予阿尔茨海默病大鼠 NSA 可显著恢复海马乙酰胆碱水平。与 AD 组相比，乙酰胆碱酯酶活性（增加 2.6 倍）降低（下降 63.3%）[4]。
- 对接受 NSA 治疗的 AD 大鼠的海马（CA1、CA3 和齿状回）进行组织学检查显示，完整神经元的数量显著高于 AD 组（例如，CA1 区增加 89.8%）[4]。

使用抗Flag抗体对RIP1和RIP3进行免疫沉淀。将Flag磁珠与2 μCi [32P]γ-ATP在37°C下孵育1小时，孵育前用激酶缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，10 mM MgCl2，50 mM NaCl，0.02% BSA，150 μM ATP和1 mM DTT）洗涤三次，然后加入人工底物MBP或纯化的重组MLKL。之后对反应混合物进行SDS-PAGE和放射自显影分析。我们描述了一种名为(E)-N-(4-(N-(3-甲氧基吡嗪-2-基)磺酰基)苯基)-3-(5-硝基噻吩-2-基)丙烯酰胺的小分子化合物的发现，该化合物也称为坏死磺酰胺，它能特异性抑制RIP3激活下游的坏死。通过抗RIP3抗体和坏死磺酰胺亲和探针的共免疫沉淀，鉴定出混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）为相互作用靶点。MLKL上的苏氨酸357和丝氨酸358残基被RIP3磷酸化，这些磷酸化事件对坏死至关重要。

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- 体外激酶活性测定：使用抗Flag抗体从HeLa细胞中免疫纯化RIP1和RIP3。用激酶缓冲液（50 mM HEPES [pH 7.5]、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.02% BSA、150 μM ATP和1 mM DTT）洗涤Flag磁珠三次。将磁珠与 2 μCi 的 [γ-32P]-ATP 在 37°C 下孵育 1 小时，同时加入人工底物髓鞘碱性蛋白 (MBP) 或纯化的重组 MLKL。反应混合物经 SDS-PAGE 电泳分离后进行放射自显影。该实验表明 RIP3 而非 RIP1 可以磷酸化 MLKL [2]。
- 脂质体渗漏实验：制备含有 Tb3+ 离子和不同脂质组成（例如，5% PI(4,5)P2 或 15% 心磷脂）的脂质体。将纯化的重组 MLKL 蛋白（野生型、磷酸化失活型或磷酸化模拟型）与这些脂质体在二吡啶甲酸 (DPA) 存在下孵育。使用酶标仪记录 Tb3+-DPA 螯合物释放的荧光。为了测试 NSA 的效果，将磷酸模拟物 MLKL 与 2 μM 坏死磺酰胺 或 DMSO 在室温下预孵育 2 小时，然后再进行测定 [3]。

坏死抑制剂对 MLKL 磷酸化产生多种影响。将 T/S/Z 应用于 HT-29 细胞 12 小时或 8 小时，并分别加入或不加入坏死抑制剂。通过监测培养基中释放的蛋白酶活性，计算死亡细胞的数量。制备全细胞提取物，并进行蛋白质印迹分析。终浓度为 1 或 10 μM 的坏死磺酰胺或坏死抑制剂-1 可抑制坏死。

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- 筛选实验设计：将 2000 个 HT-29 细胞接种于 384 孔板的每个孔中。第二天，加入 TNF-α (20 ng/ml)、Smac 模拟物 (100 nM) 和 z-VAD (20 μM) 诱导坏死。同时，加入化合物库（约 200,000 个化合物）中的化合物，终浓度为 10 μM。 24 小时后，使用 CellTiter-Glo 试剂盒测定 ATP 水平来确定细胞活力 [1]。
- 细胞存活率测定：根据制造商的说明，使用 CellTiter-Glo 发光细胞活力测定试剂盒进行细胞存活率测定。使用酶标仪记录发光值 [1][2]。
- 生物素标记的坏死磺酰胺沉淀：收集细胞并裂解。将 20 nmol 生物素标记的坏死磺酰胺 (NSA) 与 20 μl 链霉亲和素琼脂糖在 4°C 下预孵育 2 小时。用裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠两次。然后将 NSA 结合的琼脂糖与细胞裂解液在 4°C 下孵育过夜。加入非生物素标记的 NSA 作为结合竞争剂。将磁珠用裂解缓冲液洗涤四次，然后直接在 1X SDS 上样缓冲液中煮沸 [1][2]。
- 基因敲低和拯救：将 RIP3-HeLa 细胞接种于 96 孔板中，并用强力霉素处理。第二天，每个孔中加入 2.5 pmol 针对 MLKL 或荧光素酶（对照）的 siRNA，以及 0.05 μg 带有沉默突变的 cDNA（siRNA 抗性野生型 MLKL 或 C86S 突变体）或载体质粒。再过一天，用坏死诱导剂处理细胞 24 小时，并通过测量 ATP 水平来确定细胞活力 [2]。

雄性Wistar大鼠
1.65 mg/kg
ip

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将大鼠随机分为四组（每组8只）。第1组（对照组）为正常大鼠，仅给予溶剂处理。第2组（AlCl3组；AD组）为大鼠，连续6周每日口服17 mg/kg溶于蒸馏水的AlCl3，代表AD组。第3组（AlCl3 + 坏死磺胺（NSA）组）为大鼠，在给予AlCl3的同时，每日腹腔注射1.65 mg/kg溶于二甲基亚砜的坏死磺胺（NSA），连续6周。第 4 组（坏死磺酰胺 (NSA) 组）由正常大鼠组成，这些大鼠腹腔注射溶于二甲基亚砜的 NSA，剂量为 1.65 mg/kg/天，持续 6 周。NSA 的剂量是根据主要研究之前进行的预实验确定的。在该预实验中，通过对海马组织进行淀粉样斑块沉积和神经元变性的组织学检查、通过 Morris 水迷宫和 Y 迷宫测试评估学习和记忆能力，以及分析 AlCl3 + NSA 治疗组和 AlCl3 治疗组大鼠海马中 p-MLKL、p-tau 和 β-淀粉样蛋白的水平来评估剂量疗效。[4]

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- 阿尔茨海默病大鼠模型：成年雄性 Wistar 大鼠（180-220 g）被随机分配到各组（n=8）。通过口服氯化铝（AlCl3，溶于蒸馏水）诱导阿尔茨海默病，剂量为17 mg/kg/天，连续6周。坏死磺胺（NSA）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，腹腔注射，剂量为1.65 mg/kg/天，连续6周，单独或与AlCl3同时给药。在实验结束前5天进行行为学测试（莫里斯水迷宫和Y迷宫）[4]。

[1]. Med Chem Commun. 2014, 5, 333.

[2]. Cell . 2012 Jan 20;148(1-2):213-27.

[3]. Mol Cell . 2014 Apr 10;54(1):133-146.

[4]. ACS Chem Neurosci . 2020 Oct 21;11(20):3386-3397.

坏死磺酰胺 (NSA) 是一种磺酰胺类药物，是 (E)-N-(4-(N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)磺酰基)苯基)-3-(5-硝基噻吩-2-基)丙烯酰胺的 3-甲氧基吡嗪-2-基衍生物。NSA 特异性地阻断 RIP3（受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶 3）激活下游坏死，RIP3 是程序性坏死（细胞凋亡）通路中的关键信号分子。NSA 可作为坏死性凋亡抑制剂和神经保护剂发挥作用。它是一种磺酰胺类化合物，属于吡嗪和噻吩类。通过对20万种化合物进行高通量筛选以及后续的构效关系（SAR）研究，我们发现SSA是一种强效的小分子抑制剂，能够抑制由TNF-α、Smac模拟物和z-VAD-fmk（T/S/Z）联合作用诱导的坏死性凋亡。我们采用正向化学遗传学方法和基于NSA的化学探针，进一步揭示了NSA选择性靶向混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）以阻断坏死体的形成。[1]受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIP3）是程序性坏死（坏死性凋亡）通路中的关键信号分子。该通路在多种生理和病理条件下发挥着重要作用，包括发育、组织损伤反应和抗病毒免疫。本文报道了一种名为(E)-N-(4-(N-(3-甲氧基吡嗪-2-基)磺酰基)苯基)-3-(5-硝基噻吩-2-基)丙烯酰胺（以下简称坏死磺酰胺）的小分子化合物的鉴定，该化合物能够特异性地阻断RIP3激活的下游坏死过程。通过坏死磺酰胺衍生的亲和探针以及与抗RIP3抗体的共免疫沉淀实验，鉴定出混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）为该化合物的相互作用靶点。RIP3在苏氨酸357和丝氨酸358位点磷酸化MLKL，这些磷酸化事件对坏死至关重要。用坏死磺酰胺处理细胞或敲低MLKL的表达，均可使坏死过程停滞在RIP3在细胞内形成离散斑点的特定步骤。这些结果表明，MLKL是RIP3激酶下游坏死信号传导的关键介质。[2]肿瘤坏死因子α (TNF-α) 细胞因子家族诱导的程序性坏死性细胞死亡依赖于由受体相互作用激酶RIP1和RIP3组成的激酶级联反应。这些激酶活性如何导致细胞死亡尚不清楚。MLKL是一种混合谱系激酶结构域样蛋白，是RIP3的功能性底物，它通过其激酶样结构域与RIP3结合，但自身缺乏激酶活性。RIP3在T357和S358位点磷酸化MLKL。本文报道了一种单克隆抗体的研制，该抗体能够特异性识别通过该通路死亡的细胞以及药物性肝损伤患者的肝脏活检样本中的磷酸化MLKL。磷酸化的MLKL形成寡聚体，可与磷脂酰肌醇和心磷脂结合。这种特性使MLKL能够从胞质溶胶迁移至质膜和细胞内膜，直接破坏膜的完整性，导致细胞死亡。[3] 阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗方法。现有疗法只能缓解症状，疗效有限。坏死性凋亡是一种受控的细胞死亡形式，近年来发现其与多种神经退行性疾病的发病机制相关。本研究探讨了坏死性凋亡在AD发病机制中的作用，并评估了坏死性凋亡抑制剂磺胺甲噁唑（NSA）在AD大鼠模型中的潜在治疗效果。通过连续6周口服氯化铝（AlCl3，17 mg/kg/天）诱导AD。腹腔注射NSA（1.65 mg/kg/天）6周可显著改善AlCl3诱导的大鼠空间学习和记忆障碍，表现为Morris水迷宫和Y迷宫测试成绩的提高。NSA可降低海马中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、β-淀粉样前体蛋白裂解酶1 (BACE1)、β-淀粉样蛋白、糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)、磷酸化tau蛋白和乙酰胆碱酯酶的异常高表达，并伴随乙酰胆碱的补充。NSA改善阿尔茨海默病相关障碍的作用机制与其抑制关键坏死性凋亡执行因子——混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 的磷酸化有关。组织病理学改变也支持上述生化结果。总之，NSA 疗法是一种有前景的阿尔茨海默病治疗方法，它通过靶向 MLKL 依赖性坏死性凋亡来减轻 AD 的神经病理学。[4]

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- 坏死磺酰胺 (NSA) 通过选择性靶向混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 来阻断坏死性凋亡 [2]。该化合物是通过对约20万种化合物进行高通量筛选而发现的，筛选采用的是TNF-α、Smac模拟物和z-VAD-fmk诱导的HT-29细胞坏死模型[2]。
- 该化合物通过共价键与人MLKL的N端卷曲螺旋(CC)结构域结合，其α,β-不饱和烯酮部分可能作为迈克尔受体，靶向Cys86残基[2]。
- 其作用机制位于RIP3激活的下游，因为它不阻止RIP1-RIP3相互作用或RIP3磷酸化，而是阻断磷酸化MLKL的膜转位和寡聚化[2][3]。
- 坏死磺酰胺具有物种特异性，能有效抑制人细胞的坏死性凋亡，但对小鼠细胞无效[2]。
- 该化合物已被用作药理学工具，以证明MLKL 磷酸化是坏死性凋亡执行的关键步骤，已被用于检测人类疾病中的坏死性凋亡，例如使用磷酸化特异性 MLKL 抗体检测药物性肝损伤患者的肝脏活检样本[3]。
- 这是首项报道 NSA 对 AlCl3 诱导的大鼠模型中阿尔茨海默病相关神经病理学具有改善作用的研究，表明 MLKL 是 AD 的潜在治疗靶点[4]。

C18H15N5O6S2

461.4716

461.046

C, 46.85; H, 3.28; N, 15.18; O, 20.80; S, 13.89

432531-71-0

Necrosulfonamide;1360614-48-7

1566236

Light yellow to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

1.695

4.08

195.95

2

10

7

31

760

0

COC1=NC=CN=C1NS(=O)(=O)C2=CC=C(C=C2)NC(=O)C=CC3=CC=C(S3)[N+](=O)[O-]

FNPPHVLYVGMZMZ-XBXARRHUSA-N

InChI=1S/C18H15N5O6S2/c1-29-18-17(19-10-11-20-18)22-31(27,28)14-6-2-12(3-7-14)21-15(24)8-4-13-5-9-16(30-13)23(25)26/h2-11H,1H3,(H,19,22)(H,21,24)/b8-4+

(E)-N-[4-[(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl]phenyl]-3-(5-nitrothiophen-2-yl)prop-2-enamide

Necrosulfonamide, MLKL inhibitor; Necrosome Inhibitor II; Necrosis Inhibitor III; Necrosulfonamide; 1360614-48-7; 432531-71-0; (E)-N-(4-(N-(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl)phenyl)-3-(5-nitrothiophen-2-yl)acrylamide; CHEBI:63770; (E/Z)-Necrosulfonamide; (2E)-N-{4-[(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl]phenyl}-3-(5-nitrothiophen-2-yl)prop-2-enamide; (E)-N-[4-[(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl]phenyl]-3-(5-nitrothiophen-2-yl)prop-2-enamide; Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein Inhibitor

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~92 mg/mL (~199.4 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。