Necrosis; MLKL/mixed lineage kinase domain-like protein

Necrosulfonamide 通过阻断 N 末端 CC 结构域功能来抑制 MLKL 介导的坏死。 RIP3 激活后，可防止坏死。即使浓度为 5 μM，necrosulfonamide 对 TNF-α 加 Smac 模拟物在 RIP3 缺陷的 Panc-1 细胞中诱导的细胞凋亡也没有影响。在人类细胞中，necrosulfonamide 可有效抑制坏死，但在小鼠细胞中则不然。 necrosulfonamide 共价修饰的人 MLKL 残基 86 处的半胱氨酸被小鼠 MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）中的色氨酸残基取代，这解释了 necrosulfonamide 的物种特异性[2]。

Necrosulfonamide (NSA) 是一种小分子，靶向坏死性凋亡的最终执行者 MLKL，特异性抑制坏死性凋亡。

使用抗 Flag 抗体对 RIP1 和 RIP3 进行免疫沉淀。 Flag 珠子用激酶缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，10 mM MgCl2）洗涤 3 次后，与人工底物 MBP 或纯化的重组 MLKL 一起在 37°C 下与 2 μCi 的 [32P]γ-ATP 一起孵育 1 小时。 、50 mM NaCl、0.02% BSA、150 μM ATP 和 1 mM DTT）。然后对反应混合物进行SDS-PAGE和放射自显影。我们描述了一种称为 (E)-N-(4-(N-(3-甲氧基吡嗪-2-基)氨磺酰基)苯基)-3-(5-硝基噻吩-2-基)丙烯酰胺的小分子的发现，还称为坏死磺酰胺，它特异性抑制 RIP3 激活下游的坏死。通过与抗 RIP3 抗体和由 necrosulfonamide 制成的亲和探针进行共免疫沉淀，混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 被鉴定为相互作用靶标。 MLKL 上的苏氨酸 357 和丝氨酸 358 残基被 RIP3 磷酸化，这些磷酸化事件对于坏死至关重要。

坏死抑制剂对 MLKL 磷酸化产生多种影响。 T/S/Z 适用于 HT-29 细胞 12 或 8 小时，有或没有坏死抑制剂。通过监测培养基中释放的蛋白酶活性，计算死亡细胞的数量。制备全细胞提取物，并使用蛋白质印迹对其进行分析。 1 或 10 μM necrosulfonamide 或 necrostatin-1 的最终浓度可抑制坏死。

Male Wistar rats
1.65 mg/kg
i.p.

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Rats were randomly allocated into four groups (8 rats/group). Group 1 (Control group) comprised normal vehicle-treated rats. Group 2 (AlCl3 group; AD group) comprised rats that were treated with AlCl3, dissolved in distilled water, orally at a dose of 17 mg/kg daily for 6 consecutive weeks, and represented the AD group. Group 3 (AlCl3 + necrosulfonamide (NSA) group) comprised rats that were treated with AlCl3, as in group 2, concomitantly with necrosulfonamide (NSA), dissolved in dimethyl sulfoxide, intraperitoneally at a dose of 1.65 mg/kg daily for 6 weeks. Group 4 (necrosulfonamide (NSA) group) comprised normal rats that were treated with NSA dissolved in dimethyl sulfoxide at a dose of 1.65 mg/kg/day intraperitoneally for 6 weeks. The dose of NSA was selected based on a pilot experiment conducted prior to the main study. In this preliminary study, the dose efficacy was evaluated based on histological examination of the hippocampus for amyloid plaque deposits and neuronal degeneration, learning and memory evaluation by Morris water maze and Y-maze tests, and analysis of hippocampal p-MLKL, p-tau, and β-amyloid levels, in AlCl3 + NSA-treated rats compared to AlCl3-treated rats.[4]

[1]. Med Chem Commun. 2014, 5, 333.

[2]. Cell . 2012 Jan 20;148(1-2):213-27.

[3]. Mol Cell . 2014 Apr 10;54(1):133-146.

[4]. ACS Chem Neurosci . 2020 Oct 21;11(20):3386-3397.

坏死磺酰胺是一种磺酰胺类药物，是(E)-N-(4-(N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)磺酰基)苯基)-3-(5-硝基噻吩-2-基)丙烯酰胺的3-甲氧基吡嗪-2-基衍生物。坏死磺酰胺特异性地阻断RIP3（受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3）激活下游的坏死，RIP3是程序性坏死（坏死性凋亡）通路中的关键信号分子。它具有作为坏死性凋亡抑制剂和神经保护剂的作用。它是一种磺酰胺类化合物，属于吡嗪类和噻吩类化合物。

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通过对20万种化合物进行高通量筛选以及后续的构效关系（SAR）研究，我们发现坏死磺酰胺（NSA）是一种有效的小分子抑制剂，可抑制由TNF-α、Smac模拟物和z-VAD-fmk（T/S/Z）联合诱导的坏死性凋亡。我们采用正向化学遗传学方法，利用基于NSA的化学探针进一步揭示了NSA选择性靶向混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）以阻断坏死体的形成。[1]

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受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIP3）是程序性坏死（坏死性凋亡）通路中的关键信号分子。该通路在多种生理和病理条件下发挥重要作用，包括发育、组织损伤反应和抗病毒免疫。本文报道了一种名为(E)-N-(4-(N-(3-甲氧基吡嗪-2-基)磺酰基)苯基)-3-(5-硝基噻吩-2-基)丙烯酰胺（以下简称坏死磺酰胺）的小分子化合物的鉴定，该化合物能特异性地阻断RIP3激活下游的坏死过程。利用坏死磺酰胺衍生的亲和探针以及抗RIP3抗体的共免疫沉淀实验均鉴定出混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）为相互作用靶点。RIP3可磷酸化MLKL的苏氨酸357和丝氨酸358位点，而这些磷酸化事件对坏死至关重要。用坏死磺酰胺处理细胞或敲低MLKL的表达均可使坏死过程停滞在RIP3在细胞内形成离散斑点的特定步骤。这些研究结果表明，MLKL是RIP3激酶下游坏死信号传导的关键介质。[2]

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由肿瘤坏死因子α (TNF-α) 细胞因子家族诱导的程序性坏死性细胞死亡依赖于由受体相互作用激酶RIP1和RIP3组成的激酶级联反应。这些激酶活性如何导致细胞坏死尚不清楚。混合谱系激酶结构域样蛋白MLKL是RIP3的功能性底物，它通过其激酶样结构域与RIP3结合，但自身缺乏激酶活性。RIP3在T357和S358位点磷酸化MLKL。本文报道了一种单克隆抗体的研制，该抗体能够特异性识别通过该通路死亡的细胞以及药物性肝损伤患者的肝脏活检样本中的磷酸化MLKL。磷酸化的MLKL形成寡聚体，该寡聚体可与磷脂酰肌醇和心磷脂结合。这种特性使MLKL能够从胞质溶胶转移到质膜和细胞内膜，并在那里直接破坏膜的完整性，导致细胞坏死。[3]阿尔茨海默病（AD）是一种进行性加重的神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗方法，现有的治疗方法仅能缓解症状且疗效有限。坏死性凋亡是一种受控的细胞死亡形式，近年来发现其与多种神经退行性疾病的发病机制相关。本研究探讨了坏死性凋亡在AD发病机制中的作用，并评估了坏死性凋亡抑制剂坏死磺酰胺（NSA）在AD大鼠模型中的潜在治疗效果。通过连续6周口服氯化铝（AlCl3，17 mg/kg/天）诱导AD。腹腔注射NSA（1.65 mg/kg/天）6周可显著改善AlCl3诱导的空间学习和记忆障碍，表现为大鼠在Morris水迷宫和Y迷宫中的表现增强。NSA可减轻海马中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、β位点淀粉样前体蛋白裂解酶1 (BACE1)、β-淀粉样蛋白、糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)、磷酸化tau蛋白和乙酰胆碱酯酶的异常高表达，并伴随乙酰胆碱的补充。NSA对阿尔茨海默病相关紊乱的改善与其对关键坏死性凋亡执行因子混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 磷酸化的抑制作用相关。组织病理学改变支持了上述生化结果。总之，NSA 治疗是一种很有前途的抗阿尔茨海默病方法，它通过靶向 MLKL 依赖性坏死性凋亡来减轻 AD 神经病理学。[4]

C18H15N5O6S2

461.4716

461.046

C, 46.85; H, 3.28; N, 15.18; O, 20.80; S, 13.89

432531-71-0

Necrosulfonamide;1360614-48-7

1566236

Light yellow to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

1.695

4.08

195.95

2

10

7

31

760

0

COC1=NC=CN=C1NS(=O)(=O)C2=CC=C(C=C2)NC(=O)C=CC3=CC=C(S3)[N+](=O)[O-]

FNPPHVLYVGMZMZ-XBXARRHUSA-N

InChI=1S/C18H15N5O6S2/c1-29-18-17(19-10-11-20-18)22-31(27,28)14-6-2-12(3-7-14)21-15(24)8-4-13-5-9-16(30-13)23(25)26/h2-11H,1H3,(H,19,22)(H,21,24)/b8-4+

(E)-N-[4-[(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl]phenyl]-3-(5-nitrothiophen-2-yl)prop-2-enamide

Necrosulfonamide, MLKL inhibitor; Necrosome Inhibitor II; Necrosis Inhibitor III; Necrosulfonamide; 1360614-48-7; 432531-71-0; (E)-N-(4-(N-(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl)phenyl)-3-(5-nitrothiophen-2-yl)acrylamide; CHEBI:63770; (E/Z)-Necrosulfonamide; (2E)-N-{4-[(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl]phenyl}-3-(5-nitrothiophen-2-yl)prop-2-enamide; (E)-N-[4-[(3-methoxypyrazin-2-yl)sulfamoyl]phenyl]-3-(5-nitrothiophen-2-yl)prop-2-enamide; Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein Inhibitor

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~92 mg/mL (~199.4 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。