Nusinersen   中文名称: 诺西那生

SMN2 gene; Nusinersen is an antisense oligonucleotide (ASO) that targets the SMN2 pre-mRNA, promoting exon 7 inclusion to increase functional SMN protein production in spinal muscular atrophy (SMA). [1]
Nusinersen targets the SMN2 gene, a paralog of SMN1 that produces only low levels of functional SMN protein due to exclusion of exon 7 during splicing. Nusinersen is an SMN-ASO (antisense oligonucleotide) that increases SMN levels by blocking an intronic splice silencer in SMN2, thereby facilitating exon 7 inclusion and generation of full-length SMN2 transcripts. This mechanism restores SMN protein production, which is essential for motor neuron survival.

通过抑制SMN2基因内含子剪接沉默子，SMN反义寡核苷酸（SMN-ASO）nusinersen可提高SMN蛋白水平，促进外显子7的插入，从而产生全长SMN2转录本[2]。体外实验表明，nusinersen可提高脊髓性肌萎缩症（SMA）患者来源细胞系中的SMN蛋白水平。该反义寡核苷酸与SMN2前体mRNA结合，促进外显子7的插入，进而增加全长SMN蛋白的产生。这种效应呈剂量依赖性，并在多种SMA细胞模型中得到证实。该化合物的作用机制已在临床前研究中得到广泛验证。

在一项随机、双盲、假手术对照试验中，患有婴儿期发病的脊髓性肌萎缩症（SMA）的患儿接受了鞘内注射诺西那生（每次12毫克）。与假手术对照组相比，治疗组的运动功能（通过哈默史密斯婴儿神经系统检查评估）显著改善（37% vs. 0% 有效率）。[1] 在SMA小鼠模型中，与单独使用诺西那生相比，诺西那生与靶向NCALD的ASO联合给药进一步改善了运动功能和生存率，提示二者存在协同作用。 [2]

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在中期分析中，与对照组相比，nusinersen 组婴儿达到运动里程碑反应的比例显著更高（51 例婴儿中有 21 例 [41%] vs. 27 例婴儿中有 0 例 [0%]，P<0.001），这一结果促使试验提前终止。在最终分析中，nusinersen 组婴儿达到运动里程碑反应的比例显著高于对照组（73 例婴儿中有 37 例 [51%] vs. 37 例婴儿中有 0 例 [0%]），并且 nusinersen 组的无事件生存率高于对照组（死亡或使用永久性辅助通气的风险比为 0.53；P=0.005）。与对照组相比，nusinersen 组的总体生存率更高（死亡风险比为 0.37；P=0.004），且筛查时病程较短的婴儿比病程较长的婴儿更有可能从 nusinersen 治疗中获益。两组不良事件的发生率和严重程度相似。结论：在脊髓性肌萎缩症 (SMA) 患儿中，接受 nusinersen 治疗的患儿比对照组患儿更有可能存活且运动功能有所改善。早期治疗可能对于最大程度地发挥药物疗效至关重要。（由 Biogen 和 Ionis Pharmaceuticals 资助；ENDEAR ClinicalTrials.gov 编号：NCT02193074。）[1]

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脊髓性肌萎缩症 (SMA) 是一种神经肌肉疾病，是导致儿童期最常见的遗传性致死性疾病。近期，一种名为nusinersen的反义寡核苷酸（ASO）已获得FDA和EMA批准用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。nusinersen能够纠正SMN2的剪接，从而增加全长SMN蛋白的表达。然而，对于重症和/或症状后SMA患者，单独使用nusinersen不足以对抗疾病。因此，需要开发其他不依赖于SMN的疗法来支持运动神经元和神经肌肉接头的功能。我们近期发现，SMN1基因缺失的无症状个体由于神经钙蛋白δ（NCALD）表达降低而免受SMA的侵害。NCALD表达降低已被证实是多种物种（包括线虫、斑马鱼和小鼠）中SMA的保护性调节因子。在本研究中，我们通过在皮层神经元以及成年和新生小鼠中应用逐步筛选策略，从450种已开发的Ncald ASO中筛选出Ncald-ASO3，认为它是对中枢神经系统最有效且无毒的ASO。在一项随机双盲临床前研究中，研究人员在严重脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中，于症状出现前分别给予单次皮下低剂量SMN-ASO和单次脑室内注射Ncald-ASO3或对照ASO。NCALD水平降低超过70%的疗效持续约1个月。低剂量SMN-ASO可改善多器官功能障碍，而NCALD水平的进一步降低则显著改善了SMA病理，包括出生后第21天（P21）神经肌肉接头和肌肉的电生理和组织学特性，以及3个月时的运动功能障碍。本研究表明，联合使用SMN依赖性和SMN非依赖性ASO疗法对SMA具有额外益处。这项研究阐明了在一些无症状个体中发现的修饰基因如何帮助开发针对所有脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的治疗方法。[2]
体内研究表明，诺西那生（nusinersen）能显著改善SMA患者的运动发育里程碑，包括独立坐立、站立和行走能力。临床试验表明，鞘内注射诺西那生可显著提高SMA患儿的生存率和运动功能。该药物已被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为治疗SMA的孤儿药。诺西那生通过解决该疾病的根本遗传病因，彻底改变了SMA的治疗。

由于nusinersen是一种反义寡核苷酸，其作用机制是通过RNA结合而非酶或受体相互作用，因此体外酶/受体结合试验不适用于nusinersen。然而，已开展了与SMN2前体mRNA的结合研究，以表征nusinersen与其靶序列的特异性和亲和力。这些研究采用电泳迁移率变动分析、表面等离子共振或RNA下拉实验等技术来测定结合亲和力和特异性。

体外细胞研究采用脊髓性肌萎缩症（SMA）患者来源的成纤维细胞或诱导多能干细胞来源的运动神经元。细胞用不同浓度（通常为纳摩尔至微摩尔范围）的诺西那生处理特定时间。采用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SMN蛋白水平。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）定量全长SMN2 mRNA。评估细胞存活率和神经突生长情况，以评价SMN修复的功能效应。

背景：脊髓性肌萎缩症是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，由运动神经元存活蛋白（SMN）水平不足引起。Nusinersen 是一种反义寡核苷酸药物，可修饰 SMN2 基因的前体信使 RNA 剪接，从而促进全长 SMN 蛋白的生成。方法：我们开展了一项随机、双盲、安慰剂对照的 III 期临床试验，旨在评估 nusinersen 对脊髓性肌萎缩症患儿的疗效和安全性。主要终点为运动里程碑反应（根据 Hammersmith 婴儿神经系统检查结果定义）和无事件生存期（至死亡或需要永久性辅助通气的时间）。次要终点包括总生存期以及根据筛选时疾病持续时间进行的无事件生存期亚组分析。仅对主要终点进行了预先设定的中期分析。为了将总体I类错误率控制在0.05，最终分析中对第二个主要终点和次要终点采用了分层检验策略。[1]

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在小鼠研究中，SMA模型小鼠在出生后第1天（P1）和第5天（P5）通过脑室内（ICV）注射接受nusinersen（每次40 μg）。反义寡核苷酸（ASO）溶解于人工脑脊液（aCSF）中。[2]
体内动物实验采用SMA小鼠模型（例如SMNΔ7小鼠）进行。动物通过脑室内或鞘内注射给予不同剂量的nusinersen。终点包括存活率、运动功能（例如翻正反射、握力、转棒试验表现）以及脊髓和肌肉组织的组织学检查。测量靶组织中的SMN蛋白水平以确认靶点结合。

诺西那生的药代动力学特性具有反义寡核苷酸的典型特征。鞘内注射后，该化合物分布于整个中枢神经系统，在脑脊液和脊髓组织中均可检测到。其在中枢神经系统中的半衰期为数月，因此可以减少给药频率（通常在负荷剂量后每4-6个月给药一次）。该化合物主要通过核酸酶降解代谢，而细胞色素P450酶对其代谢作用不显著。

在临床试验中，nusinersen总体耐受性良好，治疗组和对照组均常见不良事件（例如呼吸道感染）。未报告剂量限制性毒性。[1]
nusinersen的毒理学数据来源于临床试验和上市后监测。最常见的不良事件包括头痛、背痛和鞘内给药相关的操作性疼痛。严重不良事件罕见，但可能包括血小板减少症、肾毒性和脑积水。对nusinersen或其任何成分过敏的患者禁用该化合物。目前正在通过持续的研究和注册登记收集长期安全性数据。

[1]. Nusinersen versus Sham Control in Infantile-Onset Spinal Muscular Atrophy. N Engl J Med. 2017 Nov 2;377(18):1723-1732.

[2]. NCALD Antisense Oligonucleotide Therapy in Addition to Nusinersen further Ameliorates Spinal Muscular Atrophy in Mice. Am J Hum Genet. 2019 Jul 3;105(1):221-230.

另见：Nusinersen（注：已移至此处）。

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药物适应症
Spinraza适用于治疗5q脊髓性肌萎缩症。 因此，需要开发其他不依赖于SMN的方法来维持运动神经元和神经肌肉接头（NMJ）的终生功能。该系统的优势在于，SMN和NCALD基因将通过同一系统（即反义寡核苷酸（ASO）方法）进行靶向。我们通过在P2小鼠脑室内注射特异性Ncald-ASO，实现了靶组织中NCALD蛋白水平的下调（超过70%）。然而，用于下调RNA的Ncald MOE gapmer ASO与可恢复SMN2剪接的SMN MOE ASO（nusinersen）相比，代谢稳定性较差。皮下注射SMN-ASO后非常稳定，6个月后仍对肝脏有积极作用³¹，而Ncald-ASO3的作用仅持续约1个月，3个月后消失。这表明需要每月重复注射或进一步设计方案以优化其作用持续时间。我们的结果提供了概念验证，即NCALD介导的中枢神经系统ASO下调是可能的，并且单次症状前注射Ncald-ASO3可以改善新生动物的SMA病理和运动功能障碍。尽管NCALD蛋白及其抑制作用在出生后第4天至10个月龄期间脊髓中逐渐下调，但在最初几个月每月重复脑室内（icv）注射Ncald-ASO3可能进一步增强其积极作用，类似于基因修饰的SMA-Ncaldko/wt小鼠²²中的作用。本研究的未来展望是设计靶向人类NCALD的反义寡核苷酸（ASO），并分析其在人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的培养运动神经元中的作用，这些运动神经元可能用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）患者。此外，本研究还阐明了在某些无症状个体中发现的修饰基因如何有助于开发适用于所有SMA患者的疗法^[2]。Nusinersen（Spinraza®）是首个获得FDA批准的用于治疗所有类型SMA的疾病修饰疗法。它通过调节SMN2剪接来补偿SMN1突变。[1] 在临床前模型中，与靶向NCALD的ASO联合治疗可能比nusinersen单药治疗更有效。[2]
Nusinersen也以商品名Spinraza为人所知。它于2016年获得FDA批准，用于治疗儿童和成人脊髓性肌萎缩症。该药物采用鞘内注射给药，先给予一系列负荷剂量，然后每4-6个月给予维持剂量。Nusinersen通过解决脊髓性肌萎缩症（SMA）的根本遗传病因，彻底改变了SMA的治疗方式，并在临床试验中显示出显著改善运动发育里程碑。其UNII标识符为5Z9SP3X666。

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7127.1942691803

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131801471

White to off-white solid powder

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176

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19100

72

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2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

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                  -20°C    1 month

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Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。