PBTZ169

Decaprenyl-phosphoribose-epimerase (DprE1)

PBTZ169（也称为 Macozinone，一种 8-硝基苯并噻嗪酮 (BTZ) 类似物）是一种新型十异丙烯基磷酸核糖差向异构酶 (DprE1) 抑制剂，在体外对结核分枝杆菌具有纳摩尔级杀菌活性。 DprE1 是参与棒状杆菌亚科细胞壁生物合成的必需酶。构效关系（SAR）研究表明，BTZ 支架的 8-硝基对于作用机制至关重要，涉及与 DprE1 活性位点的 Cys387 形成半巯基键。当针对 30 个巴西诺卡氏菌分离株进行测试时，PBTZ169 的 MIC50 和 MIC90 值分别为 0.0075 和 0.03 μg/mL。由于诺卡氏菌是一种潜在的胞内细菌，因此用巴西诺卡氏菌 HUJEG-1 感染 THP-1 巨噬细胞单层，然后用 PBTZ169 处理，导致浓度为 0.25X 时菌落形成单位 (CFU) 数量减少体外值。在右后食物垫感染雌性 BALB/c 小鼠后评估体内活性。 6 周后，开始使用 PBTZ169 治疗，并将其活性与第一代化合物 BTZ043 进行比较。两种BTZ化合物均以100mg/kg的剂量每天两次通过管饲法施用，并且磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT)以100mg/kg的磺胺甲恶唑用作阳性对照。治疗 22 周后，只有 PBTZ169 和 SXT 显示出统计学上显着的活性。

在右后食物垫感染雌性 BALB/c 小鼠后评估体内活性。 6 周后，开始使用 PBTZ169 治疗，并将其活性与第一代化合物 BTZ043 进行比较。两种BTZ化合物均以100mg/kg的剂量每天两次通过管饲法施用，并且磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT)以100mg/kg的磺胺甲恶唑用作阳性对照。治疗 22 周后，只有 PBTZ169 和 SXT 显示出统计学上显着的活性。 PBTZ169 可以悬浮在 0.25% 羟丙基甲基纤维素中。 PBTZ169的给药剂量为100mg/kg，通过管饲法。 MIC50 和 MIC90 值分别为 0.0075 和 0.030 μg/mL。 PBTZ169 对巴西烟草 HUJEG-1 的 MIC 为 0.0037 μg/mL。

---

BTZ在足菌瘤动物模型中的作用[1]
当PBTZ169和BTZ043以100mg/kg的剂量每天两次通过强饲法给药时（图4），与生理盐水对照组相比，只有前者显示出统计学上的显著效果（P=0.017）。BTZ043治疗组无显著性差异（P=0.667）。与对照组相比，接受SXT治疗的小鼠组显示出统计学上的显著差异（P=0.007）。

---

苯并噻嗪酮是治疗结核病和其他放线菌感染的强效候选药物。由于苯并噻嗪酮的纳摩尔活性，我们预期其具有优异的体内活性。在100mg/kg的剂量下，每天两次，我们观察到了治疗效果，但仅限于PBTZ169。在结核分枝杆菌中，一种比巴西猪笼草细胞壁更厚、更疏水的微生物BTZ043，每天一次50mg/kg，可显著降低肺和脾脏的细菌负荷。PBTZ169是一种更有效的药物，在小鼠感染模型中，与BTZ043[1]相比，每天一次25mg/kg的剂量显著降低了杆菌的数量。

---

PBTZ169对斑马鱼中海洋分枝杆菌的疗效[3]
为了确定BTZ衍生物是否有可能治愈其他分枝杆菌感染，我们使用斑马鱼胚胎模型测试了它们对海洋分枝杆菌的疗效，因为这已被证明是评估结核病药物效果的有力工具（Davis等人，2002；Adams等人，2011）。该模型同时评估化合物对宿主存活、宿主病理和细菌负荷的影响。用海洋分枝杆菌E11或M菌株感染胚胎，产生荧光蛋白mCherry，并通过荧光显微镜观察。用浓度增加的PBTZ169或BTZ043处理感染的斑马鱼胚胎，5天后细菌负荷减少，如胚胎中存在的荧光像素量所示（图4A）。尽管海洋分枝杆菌M感染（或E11数据未显示）导致大量细菌聚集（图4B，C），但当感染的斑马鱼胚胎用25或50 nM PBTZ169或BTZ043处理时，几乎没有细菌存在（图4D，E，F）。用5 nM的任一化合物处理胚胎对感染没有显著影响（图4A，C）。

为了证实杀菌效果，斑马鱼胚胎感染了M.marinum菌株M和E11，然后分别在感染后0、1或2天暴露于25 nMPBTZ169中5、4或3天，并添加药物。测定每个胚胎的菌落形成单位（CFU）数量，并将其与荧光水平进行比较。与治疗持续时间无关，海洋分枝杆菌菌株M和E11的CFU数量分别减少了约3和2个对数单位（图5B，D）。细菌存活率的降低反映在荧光的急剧下降上，尽管在稍后的时间点观察到更多的散射（图5A，C）。

在检查用BTZ043处理的感染斑马鱼胚胎时，观察到该化合物影响胚胎发育（图6A-G），特别是在浓度高于25 nM时。受精后1天对胚胎施用BTZ043导致脊索发育缺陷和前后轴略微缩短（图6C，D），用25 nM BTZ043处理后60.4%（48个中有29个）的胚胎受到影响，用50 nM BTZ043处理后76.7%（30个中有23个）的胎儿受到影响（图6G）。当未感染的胚胎暴露于BTZ043时，也观察到了这些缺陷。然而，在相同浓度（比较图4E，F）甚至10μM的PBTZ169处理后，没有发现发育缺陷。

---

PBTZ衍生物在体内的比较疗效[3]
在BALB/c小鼠低剂量气溶胶感染和BTZ043推荐剂量50mg/kg治疗后，在慢性结核病小鼠模型中评估了PBTZ169和其他四种候选药物的体内疗效。与未治疗的对照组相比，BTZ043治疗的小鼠肺部和脾脏中的细菌负荷分别降低了0.6和1.7个对数（图7A）。所有五种PBTZ在两个器官中都有活性，不亚于BTZ043。令人惊讶的是，PBTZ169和PBTZ134比BTZ043减少了10倍的脾脏细菌负荷。此外，与相同剂量的BTZ043相比，PBTZ169在肺部具有显著更高的杀菌活性，使CFU数量减少了>0.5 log（图7A）。这种活性也与INH的活性相当，表明PBTZ169是体内所有BTZ中最有效的。

---

慢性结核病小鼠模型的联合研究[3]
如果PBTZ169要用于人类结核病治疗的新方案，重要的是在动物模型中证明适当药物组合的疗效。因此，我们评估了低剂量气溶胶感染后，在慢性结核病小鼠模型中发现的体外协同作用。PBTZ169单独测试（25mg/kg），与BDQ（25mmg/kg）和吡嗪酰胺（PZA；150mg/kg）联合测试，以及与这两种药物一起测试，以对抗结核分枝杆菌H37Rv。在治疗4周和8周后测量肺和脾脏中细菌负荷的减少，并将其与分别包含25、10和150mg/kg浓度的INH、RIF和PZA的标准三种药物治疗的结果进行比较。如图9所示，在治疗1个月后，PBTZ169和BDQ的组合在减少两个器官中的CFU数量方面比标准治疗更有效（肺的P值=0.004，脾的P值0.002），而添加PZA在这个阶段并没有进一步提高组合的效力（脾的P=0.003）。用实验组合治疗的小鼠肺部残留的细菌数量低于此时使用的检测限值（<200 CFU）。治疗2个月后（图9），只有三重组合的PBTZ、BDQ和PZA在肺部（P=0.046）和脾脏（P=0.015；补充表6）均明显优于RHZ。因此，在结核病慢性模型中，PBTZ、BDQ和PZA联合治疗的疗效优于标准三联疗法INH、RIF和PZA。

PBTZ169的MIC测定[1] 我们使用了基于我们之前描述的CLSI M24-A文件的肉汤微量稀释法。作为外部对照，我们使用了大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213。由于诺卡氏菌的高度敏感性，其浓度范围为0.125μg/mL至0.0002μg/mL。

---

PBTZ169 抑制十异戊二烯基磷酰基-β-d-核糖 2′-氧化酶 (DprE1)，并在体外对结核分枝杆菌表现出纳摩尔级杀菌活性。

---

药物敏感性试验。[2]
通过在96孔板中连续稀释工作细菌培养物中的化合物2倍（最终体积为100μl），用刃天青还原微孔板测定法（REMA）测量对所有分枝杆菌菌株的体外活性。对于结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌卡介苗，将平板在37°C下孵育1周；对于耻垢分枝杆菌菌株，孵育时间为24小时。通过加入无菌的刃天青（10μl，0.025%[wt/vol]），孵育混合物，并使用帝肯Infinite M200酶标仪通过荧光（激发波长560nm；发射波长590nm）测量刃天青的周转率来测定细菌存活率。

---

DprE1检测。[2]
C387G和C387S突变DprE1蛋白是使用pET28a-M.结核病DprE1质粒和QuikChange定点突变试剂盒（安捷伦）产生的，引物为5′-GGGCTGGAACATCGCGTCGACTTCCC-3′和3′-CCGACCTTGTAGCGCGCGCGAGGGG-5′（C387G）和5′-GGCTCGGAACATCACGTCGATCTCTCCCC-3′以及3′-CCGCTTGTCGCGCGCTGAGGG-5’（G387S）（突变碱基用下划线标出）。如别处所述，表达和纯化野生型结核分枝杆菌DprE1和突变酶。 DprE1的50%抑制浓度（IC50）如前所述（12），使用Amplex Red/辣根过氧化物酶偶联测定法，以法尼烷基磷酰-β-d-呋喃核糖（FPR）为底物。在30°C下，在Tecan M200阅读器上以动力学模式进行荧光测量（激发波长，560 nm；发射波长，590 nm）。使用不含抑制剂的阴性对照样品，从测量的速率中减去背景速率（未添加FPR）。使用Prism通过将抑制剂浓度（log[I]）和归一化反应（V）拟合到方程V=100/{10[（logIC50−log[I]h]}来确定IC50，其中h是DprE1的Hill系数。

---

体外代谢稳定性。[2]
使用小鼠和人肝微粒体测定化合物的固有清除率（CLint）。简而言之，将100μg小鼠（CD-1）或人肝微粒体（均来自Invitrogen）混合在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，该缓冲液含有1μl以100μg/ml溶解在DMSO中的化合物，最终体积为50μl。同时，在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备NADPH再生系统。在37°C下将两种溶液（每种溶液50μl；最终化合物浓度1μg/ml）混合，开始内在清除率评估之前，将溶液在37°C下预孵育10分钟。0、5、10、15、30和60分钟后，将100μl反应混合物转移到100μl乙腈中，并将混合物置于冰上30分钟，以使蛋白质完全沉淀，从而终止反应。然后将样品在12000×g下离心10分钟，将上清液注入高效液相色谱（HPLC）柱，以定量随时间推移残留的母体化合物的量。卡马西平（1μg/ml）用作低内在清除率的对照。

---

生物化学与结构生物学[3]
如前所述，在25°C下进行NfnB测定（Manina等人，2010）。简而言之，将化合物加入到含有NfnB（6μM）、NADH（150μM），50 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl和5%甘油的反应混合物中。结核分枝杆菌DprE1的纯化和结晶的全部细节在支持信息中给出。使用以Amplex Red为底物的过氧化物酶偶联试验，在与BTZ043或PBTZ169（0-20μM）孵育5分钟后评估DprE1抑制作用。酶（5μM）在30°C下与抑制剂和200μM FPR在50 mM甘氨酰甘氨酸pH 8.4、100 mM NaCl中孵育。孵育5分钟后取一份等分试样（5μL），稀释测定混合物（最终体积50μL）至终浓度为400μM FPR、0.2μM辣根过氧化物酶、50μM Amplex Red和0.5μM DprE1。然后通过连续测量激发/发射波长分别为560/590nm的荧光来评估过氧化物酶活性。如前所述，通过质谱分析DprE1-PBTZ169复合物，现在使用结核分枝杆菌DprE1（Neres等人，2012）。

当针对 30 个巴西诺卡氏菌分离株进行测试时，PBTZ169 的 MIC50 和 MIC90 值分别为 0.0075 和 0.03 μg/mL。由于诺卡氏菌是一种潜在的胞内细菌，因此用巴西诺卡氏菌 HUJEG-1 感染 THP-1 巨噬细胞单层，然后用 PBTZ169 处理，导致浓度为 0.25X 时菌落形成单位 (CFU) 数量减少体外值。

---

单细胞诺卡氏菌悬浮液的制备[1]
由于巴西猪笼草以丝状生长，因此按照之前发表的方法制备了单细胞悬浮液。巴西猪笼草HUJEG-1在沙氏琼脂上培养1周，然后在37°C的脑心浸液中在110 rpm的摇床中传代培养72小时。然后通过离心分离细菌团，用盐水洗涤四次。在Evelham-Potter装置中研磨后，将悬浮液以100×g离心两次；上清液为单细胞悬浮液。细菌浓度通过在含有5%羊血的BHI琼脂上平板测定，悬浮液在-70°C下储存在20%甘油中直至使用。

---

THP-1巨噬细胞测定[1]
将人单核细胞系THP-1维持在补充有10%胎牛血清（FCS；Gibco BRL）和1 mM丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中。为了将细胞转化为巨噬细胞，细胞在没有丙酮酸钠的情况下进行了四次传代培养。然后在血细胞计数器中测定细胞密度，并将细胞悬浮液按要求在补充了10%FCS和6.25 ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯的完全RPMI 1640中稀释，以获得4 x 105个细胞/mL的密度。将1 mL等分的细胞悬浮液接种到24孔微孔板的每个孔中，每48小时用RPMI 1640洗涤细胞培养物两次，持续时间不超过4天。

---

BTZ细胞内活性的测定[1]
所使用的技术之前已经发表过。简而言之，使用3:1的感染复数（MOI）来确定抗菌药物对诺卡氏菌细胞内生长的影响。感染单层两小时后，丢弃培养基，用pH 7.4的温PBS洗涤单层两次。在含有10%FCS的RPMI 1640中，以MIC的0.25X、1X、4X和16X添加PBTZ，并在37°C、5%CO2中孵育6小时。我们不能使用利福平作为细胞内活性对照，因为巴西猪笼草是一种天然耐药细菌。相反，我们使用了DA-7218，这是一种恶唑烷酮药物，以前对巴西猪笼草草具有良好的细胞内和体内活性。丢弃培养基，加入1 mL冷蒸馏水并孵育15分钟。为了释放细胞内细菌，通过上下移液数次破坏单层，并将悬浮液收集在1.5 mL Eppendorf管中。诺卡氏菌生长在BHI琼脂上定量。

---

结核分枝杆菌H37Ra细胞对十异戊二烯基磷酰-β-d-核糖的差向异构化。[2]
收获6ml结核分枝杆菌H37Ra培养物的等分试样，其在600nm下的光密度（OD600）为1.31，并用缓冲液A（50mM MOPS[吗啉丙磺酸][pH 7.9]、10mM MgCl2、5mM 2-巯基乙醇）洗涤。将细胞（约30mg）在冰上与50μl缓冲液A、16nmol NADH和16μg PyrBTZ01或PyrBTZ02或2μg BTZ043在5μl二甲亚砜（DMSO）中孵育15分钟，最终体积为80μl。反应开始时加入15000dpm的5-磷酸-[14C]核糖1-二磷酸（P[14C]RPP），其由[14C]葡萄糖制备（比活性，290mCi/mmol），如别处所述。在37°C下孵育2小时后，用1.5 ml CHCl3/CH3OH（2:1）停止反应，并进行两相Folch洗涤。将有机相干燥并溶解在40μl CHCl3/CH3OH/H2O/NH4OH（65:25:3.6:0.5[vol/vol]）中；在CHCl3/CH3OH/NH4OH/1M乙酸铵/H2O（180:140:9:9:23[vol/vol]）中，通过硅胶板薄层色谱法分离25%的样品，并通过放射自显影法（Biomax MR-1胶片；柯达）进行可视化。使用ImageJ软件（NIH）量化条带的强度。

---

细胞毒性研究。[2]
如前所述，测量化合物对两种人肝细胞系（HepG2和Huh7）、一种人肺上皮细胞系（A549）和一种人单核细胞系（THP-1）的细胞毒性。简而言之，在96孔微孔板中用化合物的连续稀释液（2倍稀释液；100至0.1μg/ml）孵育细胞（4000个细胞/孔）。在37°C下孵育3天后，通过在37°°C下加入刃天青4小时并使用帝肯Infinite M200酶标仪测量间苯二酚代谢物的荧光（激发波长为560 nm；发射波长为590 nm）来测定细胞存活率。对数据进行背景校正（无细胞对照），并表示为未处理细胞（仅细胞）值的百分比。

药物[1]
BTZ043 和PBTZ169悬浮于 0.25% 羟丙基甲基纤维素溶液中。

---

BTZ 类药物的血浆定量[1]
为了定量小鼠血浆中的药物浓度，我们通过灌胃法给 8-12 周龄的雌性 BALB/c 小鼠分别灌胃给予 BTZ043、PBTZ169 或 SXT，剂量均为 100 mg/kg。分别于 0、20、40、60、120、240、360、480 和 600 分钟采集眼眶周围静脉丛的血样。采用本实验室开发的高效液相色谱法分析 BTZ043、PBTZ169 和 SXT 的浓度。

---

小鼠疗效[1]
8～12周龄雌性BALB/c小鼠感染巴西尼氏线虫HUJEG-1株。实验性足菌肿的制备方法为：将20 mg（湿重）巴西尼氏线虫悬液注射至小鼠左后足垫，具体方法如前所述。四周后开始治疗。每组15只小鼠。一组小鼠灌胃生理盐水作为阴性对照。其余小鼠分别灌胃给予PBTZ169、BTZ043或SXT，剂量为100 mg/kg，每日两次，持续10周。SXT组作为实验治疗的阳性对照。休息两周后，继续给药6周。由一位不知晓分组情况的阅片者使用先前发表的评分标准评估药物对足菌肿病变发展的影响。采用方差分析法确定各组与接种生理盐水的对照组之间的潜在差异。

---

PBTZ 衍生物悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素溶液中，用于比较疗效研究。PBTZ169 和 BDQ 悬浮于 20% 羟丙基-β-环糊精溶液（pH = 3.0）中，用于体内联合用药研究。除 BDQ 每月配制一次并储存于 4°C 外，所有化合物的小鼠给药溶液均每周配制一次。PZA、INH 和 RIF 悬浮于水中。[3]

药物血浆浓度[1]
先前已发表过小鼠血浆中BTZ043的浓度数据。在100 mg/kg剂量下，其血浆浓度达到4.06 μg/mL（Tmax为40分钟），与我们观察到的血浆浓度非常相似（图2）。PBTZ169的Cmax为1.74 μg/mL，Tmax为40分钟（图3）。图3中还展示了SXT在100 mg/kg剂量下的血浆浓度，给药后40分钟达到最大浓度553.88 μg/mL。t½为1.66小时，AUC为1507.69 mg/L·h。

---

PyrBTZs 和 BTZ043 具有相似的吸收-分布-代谢-排泄/毒性 (ADME/T) 特性。[2]
PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 与 BTZ043 平行测试了其对四种人细胞系（肝癌 HepG2、肝癌 Huh7、肺上皮细胞 A549 和单核细胞 THP-1）的细胞毒性（50% 毒性剂量 [TD50]）（表 3）。两种化合物的细胞毒性均低于 BTZ043，其中 PyrBTZ02 的细胞毒性最低。BTZ043 由于其极低的最小抑菌浓度 (MIC) 而具有最高的选择性指数 (SI)，其次是 PyrBTZ02 和 PyrBTZ01（表 3）。如先前报道的 BTZ043 和 PBTZ169 一样，PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 在 SOS 染色体试验中均未表现出致突变性。
接下来，我们使用小鼠和人肝微粒体，平行评估了 PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 与 BTZ043、PBTZ169 和卡马西平（低 CLint 对照化合物）的体外代谢稳定性（固有清除率 [CLint]）。在小鼠和人肝微粒体存在下，PyrBTZ01 和 PyrBTZ02 的 CLint 值均处于中间水平（表 4），且与 BTZ043 和 PBTZ169 的 CLint 值相似，表明小鼠体内化合物暴露量合理。

---

剂量递增研究和比较药代动力学[3]
PBTZ169被选作进一步研究对象，并在慢性结核病模型中开展剂量递增研究，以比较其与BTZ043的体内疗效。PBTZ169的给药剂量分别为5、10、25、50和100 mg/kg，而BTZ043的给药剂量为50 mg/kg。BTZ043治疗4周后，肺和脾脏中的细菌负荷降低了1个对数单位（图7B）。PBTZ169在所有测试浓度下均具有活性，且在相同剂量下其杀菌活性显著高于BTZ043。降低 PBTZ169 的剂量会降低其活性，但 5 mg/kg PBTZ169 和 50 mg/kg BTZ043 治疗的小鼠肺部细菌负荷无显著差异。剂量高于 25 mg/kg 时，PBTZ169 在降低脾脏菌落形成单位 (CFU) 方面显著优于 BTZ043。25 mg/kg 的 PBTZ169 在小鼠肺和脾脏中均表现出与一线药物异烟肼 (INH) 相当的杀菌活性（图 7B）。[1] 为了探究体内 BTZ043 和 PBTZ169 疗效差异是否由暴露量不同所致，我们对口服 25 mg/kg 相应化合物的小鼠进行了药代动力学测定。 PBTZ169 的疗效更佳，但这不能归因于两种化合物的药代动力学差异，因为除了 PBTZ169 的吸收速度更快（补充图 4）之外，它们的行为方式相似（补充表 5）。

体外ADME/T表征[3]
使用HepG2人细胞系评估了BTZ043和PBTZ169的潜在细胞毒性（补充表4）。结果发现，与BTZ043（TD50为5 μg/ml）相比，PBTZ169的细胞毒性低10倍（TD50为58 μg/ml）。因此，两种化合物均具有优异的选择性指数（>10000）。与人或小鼠微粒体孵育后，BTZ043和PBTZ169均显示出中等清除率（补充表4）。

[1]. PLoS Negl Trop Dis.2015 Oct 16;9(10):e0004022.

[2]. Antimicrob Agents Chemother.2015 Aug;59(8):4446-52.

[3]. EMBO Mol Med. 2014 Mar;6(3):372-83..

Macozinone 正在临床试验 NCT03036163（PBTZ169 的 I 期研究）中进行研究。

---

背景：足菌肿是一种被忽视的慢性致畸性感染性疾病，由真菌和放线菌引起。在墨西哥，巴西诺卡氏菌是主要的致病菌。由于目前的药物治疗方案存在诸多不足，因此需要寻找替代疗法。苯并噻嗪酮类 (BTZ) 是一类新型候选药物，可抑制癸烯基磷酸核糖差向异构酶 (DprE1)，该酶是棒状杆菌细胞壁生物合成中的关键酶。
方法/主要发现：本研究测试了新一代 BTZ 类药物 PBTZ169 对 30 株巴西诺卡氏菌分离株的体外活性。 PBTZ169 的 MIC50 和 MIC90 值分别为 0.0075 和 0.03 μg/mL。由于诺卡氏菌是一种潜在的细胞内细菌，因此用巴西诺卡氏菌 HUJEG-1 感染 THP-1 巨噬细胞单层，然后用 PBTZ169 处理，结果显示，在浓度为体外检测值的 0.25 倍时，菌落形成单位 (CFU) 数量有所下降。在雌性 BALB/c 小鼠右后腿食垫感染后，评估了其体内活性。6 周后，开始用 PBTZ169 治疗，并将其活性与第一代化合物 BTZ043 进行比较。两种 BTZ 化合物均以 100 mg/kg 的剂量每日两次灌胃给药，磺胺甲噁唑/甲氧苄啶 (SXT) 以 100 mg/kg 的剂量作为阳性对照。治疗 22 周后，仅 PBTZ169 和 SXT 显示出统计学意义上的显著活性。
结论：这些结果表明，DprE1 抑制剂可能对诺卡氏菌感染的治疗有效，因此可能对其他放线菌病原体也有效。我们必须测试这些化合物与其他具有良好至优异体内活性的抗菌药物（例如利奈唑胺、替地唑胺或 SXT）的联合用药，以及能够达到更高血浆浓度的新型 DprE1 抑制剂。 [1] 8-硝基苯并噻嗪酮类化合物（BTZs），例如BTZ043和PBTZ169，能够抑制十异戊二烯磷酸-β-D-核糖2'-氧化酶（DprE1），并在体外对结核分枝杆菌表现出纳摩尔级的杀菌活性。构效关系（SAR）研究表明，BTZ骨架上的8-硝基对于其作用机制至关重要，该机制涉及与DprE1活性位点中的Cys387形成半巯基键。迄今为止，8-硝基的取代已导致抗分枝杆菌活性的显著丧失。本文报道了吡咯-苯并噻嗪酮类化合物PyrBTZ01和PyrBTZ02的合成与表征。这两种非硝基苯并噻嗪酮类化合物具有显著的抗分枝杆菌活性，对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为0.16 μg/ml。它们对DprE1的抑制浓度（IC50）均小于8 μM，并表现出良好的体外吸收-分布-代谢-排泄/毒性（ADME/T）特性和体内药代动力学特征。最有前景的化合物 PyrBTZ01 在急性结核病小鼠模型中未显示出疗效，这表明 BTZ 通过抑制 DprE1 发挥杀灭作用需要共价键的形成和化合物的效力共同作用。[2] 苯并噻嗪酮先导化合物 BTZ043 通过抑制必需的黄素酶 DprE1（十异戊二烯磷酸-β-D-核糖 2-差向异构酶）来杀灭结核分枝杆菌。在此，我们合成了一系列新的含哌嗪的苯并噻嗪酮 (PBTZ) 化合物，并证明与 BTZ043 类似，临床前候选化合物 PBTZ169 也与 DprE1 共价结合。DprE1-PBTZ169 复合物的晶体结构揭示了活性位点中 Cys387 形成半巯基加合物，并解释了该酶的不可逆失活。与BTZ043相比，PBTZ169在斑马鱼和小鼠结核病模型中表现出更高的效力、安全性和疗效。当与其他抗结核药物联合使用时，PBTZ169在体外对结核分枝杆菌表现出叠加活性，但与贝达喹啉（BDQ）联合使用时则观察到协同作用。在慢性结核病小鼠模型中，由PBTZ169、BDQ和吡嗪酰胺组成的新方案比标准的三药联合疗法更有效。因此，PBTZ169是一种极具吸引力的治疗人类结核病的候选药物。[3]

C20H23F3N4O3S

456.48

456.144

C, 52.62; H, 5.08; F, 12.49; N, 12.27; O, 10.51; S, 7.02

1377239-83-2

57331386

Solid powder

1.5±0.1 g/cm3

555.6±60.0 °C at 760 mmHg

289.8±32.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.660

3.83

107

0

8

3

31

715

0

O=C1C2=CC(C(F)(F)F)=CC([N+]([O-])=O)=C2SC(N3CCN(CC4CCCCC4)CC3)=N1

BJDZBXGJNBMCAV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H23F3N4O3S/c21-20(22,23)14-10-15-17(16(11-14)27(29)30)31-19(24-18(15)28)26-8-6-25(7-9-26)12-13-4-2-1-3-5-13/h10-11,13H,1-9,12H2

2-(4-(cyclohexylmethyl)piperazin-1-yl)-8-nitro-6-(trifluoromethyl)-4H-benzo[e][1,3]thiazin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 5~6.4 mg/mL ( 10.95~14.02 mM)
Water: <4 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。