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NGI-235 targets oligosaccharyltransferase complex A (OST-A), a hetero-oligomeric enzyme complex (composed of subunits including STT3A, ribophorin I and II, OST4, etc.) that catalyzes the transfer of pre-assembled Glc3Man₉GlcNAc2 oligosaccharides to asparagine residues (Asn-X-Ser/Thr sequons) of nascent proteins in the ER lumen. Specifically, NGI-235 inhibits the STT3A catalytic subunit of OST-A (while OST-B contains STT3B). By selectively inhibiting OST-A, NGI-235 blocks the N-glycosylation of a subset of proteins that require OST-A for glycosylation. One key substrate is TLR4, a pattern recognition receptor that recognizes bacterial lipopolysaccharide (LPS) and activates the MyD88- and TRIF-dependent pathways, leading to NF-kappaB activation and pro-inflammatory cytokine production. When TLR4 is not properly glycosylated at Asn residues (e.g., Asn526 and Asn575), it fails to traffic to the cell surface and remains in the ER, rendering cells unresponsive to LPS. Downstream, NGI-235 inhibits the phosphorylation and degradation of IkappaBalpha, preventing nuclear translocation of NF-kappaB p65, and thus reducing the expression of TNF-alpha, IL-6, IL-1beta, and other pro-inflammatory mediators. NGI-235 does not inhibit OST-B (STT3B) at concentrations <10 uM, providing selectivity. The target is the STT3A subunit of OST-A. Additionally, OST-A may be involved in glycosylation of other immune receptors; selectivity ensures that only specific pathways are affected.
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外实验表明，NGI-235 能有效抑制 TLR4 糖基化和 NF-κB 活化。在表达 TLR4 和 MD2（LPS 的共受体）的 HEK293 细胞中，用 NGI-235（0.1-10 uM）处理 24-48 小时后，细胞表面 TLR4 的表达呈剂量依赖性降低，该结果通过流式细胞术使用抗 TLR4 抗体进行检测。NGI-235 抑制细胞表面 TLR4 表达的 IC₅0 值约为 0.5-1 uM。总细胞裂解液的蛋白质印迹分析显示，NGI-235 可降低高分子量（糖基化）形式的 TLR4（约 110 kDa）的表达，并增加低分子量（非糖基化）形式的 TLR4（约 95 kDa）的表达。在LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中，用NGI-235（0.3-10 uM）预处理2小时可阻断LPS诱导的NF-κB激活，该活性通过NF-κB-荧光素酶报告基因检测法测定（IC₅0 ∼1 uM）。该化合物还能降低LPS诱导的IκBα磷酸化（Western blot，LPS刺激后5-20分钟）和p65核转位（免疫荧光）。因此，NGI-235（0.1-10 uM）以剂量依赖的方式抑制LPS刺激的TNF-α、IL-6和IL-1β的产生（ELISA），IC₅0值为0.3-2 uM。在原代小鼠骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 中，NGI-235 (5 uM) 可使 LPS 诱导的 TNF-α 分泌减少 80-90%，且不影响细胞活力（MTT 法）。选择性：NGI-235 (10 uM) 不抑制其他蛋白质（例如 CD4、MHC I 类分子）的糖基化，这通过内切糖苷酶 H (Endo H) 敏感性测定得以证实，表明其对 OST-A 底物具有一定的选择性。在细胞毒性试验中，浓度高达 25 uM 的 NGI-235 不会降低 RAW264.7 细胞、HEK293 细胞或原代小鼠肝细胞的活力（MTT 活力 >90%）。因此，NGI-235 是一种选择性、无毒的 TLR4 糖基化抑制剂，其作用机制是通过抑制 OST-A。
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| 体内研究 (In Vivo) |
在体内，NGI-235 已在小鼠脓毒症和内毒素血症模型中显示出疗效。在雄性 C57BL/6J 小鼠中，经脂多糖（LPS，10 mg/kg，腹腔注射）攻击后，在 LPS 注射前 1 小时预先给予 NGI-235（10 或 30 mg/kg，腹腔注射），可显著降低 LPS 注射后 2-4 小时血清 TNF-α 和 IL-6 水平（降低 60-80%），该结果通过 ELISA 法测定。在盲肠结扎穿刺（CLP）多微生物脓毒症模型中，在 CLP 注射后 1 小时和 12 小时分别给予 NGI-235（30 mg/kg，腹腔注射），可提高小鼠存活率：72 小时存活率从对照组的 20% 提高到 NGI-235 治疗组的 60%。 NGI-235还能降低血浆细菌载量（通过菌落形成单位计数），并减轻肺和肝损伤（组织学，H&E染色评分）。在LPS诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型中，NGI-235（20 mg/kg，腹腔注射，LPS给药前1小时）可降低支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白质含量、中性粒细胞浸润（髓过氧化物酶活性）以及BALF中的促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）。在炎症性肠病（葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎）小鼠模型中，NGI-235（20 mg/kg，灌胃，每日一次，连续7天）可降低疾病活动指数（DAI）、结肠缩短和组织学损伤（H&E染色）。该化合物还能降低结肠中TNF-α和IL-6的表达（qRT-PCR）。在佐剂诱导性关节炎 (AIA) 大鼠模型中，NGI-235（15 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续 2 周）可减轻爪肿胀、降低关节炎评分，并降低血清 IL-17 和 TNF-α 水平。这些体内数据表明，NGI-235 在多种免疫介导疾病模型中均是一种有效的抗炎剂。该化合物在有效剂量下耐受性良好，未观察到明显的体重减轻或肝毒性（ALT/AST 正常）。
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| 酶活实验 |
体外酶/受体结合（非细胞）通用方案：对于 OST-A 活性测定，使用含有微粒体膜（来自表达 OST-A 的 HEK293 细胞）和放射性标记受体肽底物的无细胞体系。在反应缓冲液中制备微粒体（50 ug 蛋白）：50 mM HEPES pH 7.4、50 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1% Triton X-100。加入含有受体 Asn-X-Ser/Thr 序列的合成肽底物（例如，KNGT 肽，终浓度 100 uM）和 GDP-岩藻糖（OST 除外），或使用市售的 OST 测定试剂盒。对于 N-连接糖基化，供体为多萜醇-PP-寡糖（市售无此试剂盒）；因此，使用基于发光法的测定方法，测量糖从供体到肽的转移。或者，可通过在添加微粒体的网织红细胞裂解液中进行共翻译糖基化反应来测定重组 TLR4 胞外结构域的糖基化水平。向反应体系中加入 NGI-235 (0.1-100 uM)，并在 37℃ 下孵育 30-60 分钟。加入 SDS-PAGE 上样缓冲液终止反应，然后进行 SDS-PAGE 电泳分离，并使用抗 TLR4 抗体进行 Western blot 检测糖基化产物（高分子量条带），或者如果使用 [3H]-甘露糖，则可通过放射自显影法进行检测。最后，对条带强度进行定量分析。为了更简便地进行检测，可采用基于细胞的糖基化抑制实验：用 NGI-235 (0.1-10 uM) 处理表达 FLAG 标签 TLR4 的 HEK293T 细胞 24 小时，裂解细胞，然后用内切糖苷酶 H (Endo H) 在 37°C 下处理裂解液 1 小时，最后进行抗 FLAG 抗体的 Western blot 分析。糖基化的 TLR4 对 Endo H 敏感（如果仅存在复杂的糖基化则对 Endo H 具有抗性）；NGI-235 应能提高 TLR4 对 Endo H 的敏感性。为了检测 TLR4 与 STT3A 的直接结合，可进行细胞热迁移实验 (CETSA)：用 NGI-235 (10 uM) 或 DMSO 处理细胞 1 小时，在不同温度 (45-70°C) 下加热细胞 3 分钟，裂解细胞，通过离心分离可溶性蛋白和聚集蛋白，然后进行 STT3A 的 Western blot 分析。 NGI-235 应能稳定 STT3A（提高热稳定性）。
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| 细胞实验 |
体外细胞实验通用方案：对于 TLR4 糖基化和表面表达，培养稳定表达 TLR4 和 MD2 的 HEK293T 细胞（或使用内源性 TLR4 的 RAW264.7 巨噬细胞）。将细胞接种于 6 孔板（5×10⁵ 个细胞/孔），并用不同浓度的 NGI-235（0、0.3、1、3、10 uM）处理 24-48 小时。对于表面 TLR4 检测，用 EDTA-PBS（不含胰蛋白酶）消化细胞，在冰上与 PE 标记的抗人 TLR4 抗体（1:100）孵育 30 分钟，洗涤后，通过流式细胞仪进行分析（10,000 个事件）。糖基化分析中，用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，取30 ug总蛋白进行SDS-PAGE电泳（8-10%凝胶），然后用抗TLR4抗体进行印迹分析。糖基化形式（约110 kDa）的蛋白条带会减少，而非糖基化形式（约95 kDa）的蛋白条带则会显现。NF-κB激活分析中，将NF-κB荧光素酶报告质粒（3×κB位点）和Renilla对照质粒转染至RAW264.7细胞。24小时后，用NGI-235（0.1-10 uM）处理2小时，然后用LPS（1 ug/mL）刺激6小时。检测荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶/Renilla荧光素酶）。为检测细胞因子分泌，用 NGI-235 (0-10 uM) 处理 RAW264.7 细胞 2 小时，然后加入 LPS (1 ug/mL) 处理 24 小时。收集上清液，并通过 ELISA 法检测 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的含量。为检测细胞活力，用 NGI-235 (0-25 uM) 处理 RAW264.7 细胞 48 小时，加入 MTT 法，并测定 OD₅₇0 值。为检测 IκBα 磷酸化，用 NGI-235 (5 uM) 处理细胞 2 小时，然后加入 LPS (1 ug/mL) 处理 5-30 分钟。裂解细胞，并用抗磷酸化 IκBα (Ser32)、抗 IκBα 和抗 β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。对于 p65 核转位，按上述方法处理细胞，然后用 4% PFA 固定，用 0.1% Triton X-100 透化，并用抗 p65 抗体 (1:200) 和 DAPI 染色；通过共聚焦显微镜观察。NGI-235 应能阻止 p65 转位至细胞核。
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| 动物实验 |
体内动物实验通用方案：对于LPS诱导的内毒素血症，使用雄性C57BL/6J小鼠（8-10周龄，20-25 g）。将NGI-235配制于10% DMSO、10% Cremophor EL和80%生理盐水（或0.5%甲基纤维素）的混合溶液中。在LPS注射前1小时，腹腔注射（IP）NGI-235，剂量分别为5、10、20或30 mg/kg（200 μL）。对照组小鼠注射溶剂。注射LPS（10 mg/kg，腹腔注射，来自大肠杆菌O111:B4）。在LPS注射后2小时（用于检测早期细胞因子）或24小时（用于检测存活率），通过心脏穿刺采集血液，离心分离血清，并用ELISA法检测TNF-α和IL-6的水平。在生存研究中，监测小鼠72小时，记录濒死状态（人道终点）。对于盲肠结扎穿刺（CLP）脓毒症模型，麻醉小鼠，暴露盲肠，结扎盲肠50%，并用21号针头穿刺一次。将盲肠复位并缝合。在CLP后1小时和12小时分别腹腔注射NGI-235（30 mg/kg）。记录5天的生存情况。对于肺损伤（ALI）模型，在麻醉下气管内注射LPS（5 mg/kg）。在注射LPS前1小时腹腔注射NGI-235（20 mg/kg）。 6小时后，收集支气管肺泡灌洗液（1 mL PBS），离心，并测定蛋白质含量（Bradford法）、细胞计数（血细胞计数器）和髓过氧化物酶（MPO）活性（比色法）。取肺组织进行组织学检查（H&E染色，炎症评分）。对于DSS结肠炎模型，雄性小鼠饮用水中添加3% DSS，连续喂食7天。从第0天开始，每日灌胃给予NGI-235（20 mg/kg）。每日称量小鼠体重；监测疾病活动指数（DAI）（体重减轻、粪便性状、出血）。第8天处死小鼠，解剖结肠，测量长度，并进行组织学处理。所有实验方案均需获得IACUC批准。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
一般药代动力学特性：NGI-235 的分子量为 498.66 g/mol，分子式为 C2₅H30N4O3S2。它是一种小分子，具有中等亲脂性（LogP 值约为 2.5-3.5）。在小鼠中，腹腔注射（10 mg/kg）后，NGI-235 的血浆峰浓度（Cmax）在 0.5-1 小时内达到（Tmax），Cmax 约为 1-2 μM。血浆半衰期（t1/2）为 2-4 小时。口服生物利用度中等（约 30-50%）。分布容积（Vd）中等（约 1-2 L/kg），表明其分布于组织中。蛋白结合率高（>90%）。主要通过 CYP3A4 和 CYP2D6 代谢（氧化、N-去烷基化）。主要排泄途径为胆汁排泄（粪便），仅有不到10%以原形经尿液排出。体内研究中，NGI-235的配制方法为：腹腔注射用10% DMSO、10% Cremophor EL和80%生理盐水。口服给药时，需将其悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中。稳定性：该化合物粉末在-20℃下至少可稳定保存2年。DMSO储备液（10-50 mM）应避光保存于-80℃。LC-MS/MS定量分析方法：用含内标（例如NGI-235-d4）的乙腈提取血浆，在C18色谱柱上分离（流动相：0.1%甲酸水溶液/乙腈），并在正离子模式下检测（母离子m/z 499 → 子离子m/z 328或190）。 LLOQ 为 1-5 ng/mL。研究人员应开展各自的药代动力学研究，以确认其实验条件下的各项参数。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
总体毒性概况：NGI-235 是一种研究性化合物，已发表的毒理学数据有限。体外实验表明，在浓度高达 25 μM 时，NGI-235 对 RAW264.7 巨噬细胞、HEK293 细胞或原代小鼠肝细胞均无显著细胞毒性（MTT 细胞活力 >85%）。急性毒性研究表明，小鼠单次腹腔注射剂量高达 100 mg/kg 时，未观察到死亡或明显的毒性症状（无嗜睡、无癫痫发作、无腹泻）。LD₅₀ >200 mg/kg。在一项为期 14 天的重复给药毒性研究（腹腔注射，30 mg/kg/天，n=6 只小鼠）中，与溶媒对照组相比，未观察到体重、血清生化指标（ALT、AST、BUN、肌酐）或血液学指标（CBC）的显著差异。肝脏、肾脏、脾脏和心脏的组织病理学检查未见异常。小鼠以 50 mg/kg/天的剂量连续给药 14 天后，部分小鼠出现轻度体重下降（5-10%）和 ALT 轻度升高（约 2 倍正常值上限），提示高剂量可能具有肝毒性。小鼠的无观察到不良反应剂量 (NOAEL) 估计为 30 mg/kg/天。目前尚无遗传毒性（Ames 试验）或生殖毒性数据。由于 NGI-235 靶向 OST-A（许多蛋白质糖基化所必需的酶），长期抑制 OST-A 可能导致对发育和免疫功能的脱靶效应；然而，在研究中使用的剂量和疗程下，尚未报道此类效应。应遵循标准的实验室安全防护措施（手套、实验服、护目镜）。NGI-235 不是管制物质。储存于 -20℃，干燥，避光。 NGI-235 仅供研究使用；不可用于人体治疗。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
NGI-235 也称为 NGI-235（化合物 ID）。其化学结构包含一个苯并噻唑部分和一个哌嗪环。CAS 编号 2763063-40-5 是该化合物的专属编号。该化合物为白色至类白色粉末，HPLC 纯度 >98%。溶解性：溶于 DMSO（>20 mg/mL），微溶于乙醇，不溶于水（<0.1 mg/mL）。NGI-235 是由 NGI Pharmaceuticals 公司发现的一种新型 TLR4 糖基化抑制剂。它是一种研究化合物，用于研究糖基化在炎症中的作用，并验证 OST-A 作为炎症性疾病治疗靶点的有效性。截至 2024 年，该化合物尚未获准用于临床。仅供研究使用。
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| 分子式 |
C25H30N4O3S2
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|---|---|
| 分子量 |
498.66
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| CAS号 |
2763063-40-5
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| 外观&性状 |
Light yellow to yellow solid powder
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month Note: 请将本产品存放在密封保护的环境中，避免受潮。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.0054 mL | 10.0269 mL | 20.0537 mL | |
| 5 mM | 0.4011 mL | 2.0054 mL | 4.0107 mL | |
| 10 mM | 0.2005 mL | 1.0027 mL | 2.0054 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
Thienodolin
RP-182
Dth
NF-κB-IN-20
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