| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
The primary target of UNC3474 is the Tudor domain of 53BP1 (p53-binding protein 1). The Tudor domain of 53BP1 recognizes and binds to histone H4 dimethylated at lysine 20 (H4K20me2) at sites of DNA damage. UNC3474 selectively binds to the aromatic methyl-lysine binding cage of the 53BP1 Tudor domain (Kd = 1.0 +/- 0.3 microM), as determined by surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). UNC3474 binding induces or stabilizes a previously unknown autoinhibited homodimeric state of 53BP1TT, in which the histone binding surface (the H4K20me2 binding pocket) is buried within the protomeric interface. This prevents 53BP1 from recognizing H4K20me2 at DNA damage sites, thereby inhibiting 53BP1 recruitment to DSBs. UNC3474 is selective for 53BP1 and does not bind significantly to other Tudor domain-containing proteins (e.g., PHF1, PHF19, or JMJD2A) at concentrations up to 10 microM, as assessed by SPR. The compound also does not bind to the related MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1). UNC3474 does not affect the catalytic activity of PARP1 or other DNA damage response kinases (ATM, ATR, DNA-PK).
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| 体外研究 (In Vitro) |
与 WT 53BP1TT 不同，53BP1TT-PN 不与 UNC3474 相互作用 [1]。
体外实验利用纯化的53BP1 Tudor结构域蛋白，通过表面等离子共振(SPR)测定，UNC3474与该蛋白的结合亲和力(Kd)为1.0 +/- 0.3 uM。该结合具有Tudor结构域特异性，因为破坏芳香笼的突变体53BP1TT(Y1399A, R1402A)不显示结合（SPR响应低于野生型的5%）。在荧光偏振(FP)竞争实验中，使用FAM标记的H4K20me2肽(10 nM)，UNC3474(0.1-100 uM)能够竞争性地将该肽从Tudor结构域中置换出来，IC50值为5-10 uM。在核磁共振化学位移扰动实验中，UNC3474 引起 53BP1TT 甲基赖氨酸结合口袋内衬残基（例如 Tyr1401、Arg1402 和 Tyr1440）的剂量依赖性化学位移变化，证实了其直接结合。在下拉实验中，生物素标记的 UNC3474（可与链霉亲和素磁珠结合）可捕获重组 53BP1TT，但不能捕获突变体（Y1399A 和 R1402A）。虽然尚未证实 UNC3474 与细胞裂解液中的全长 53BP1 直接结合，但细胞研究表明 UNC3474 会影响 53BP1 向 DNA 双链断裂 (DSB) 位点的募集。UNC3474 在溶液中稳定（在 37℃ 的 PBS 或细胞培养基中 24 小时后，其完整性 ≥95%）。体外和体内细胞研究表明，UNC3474 可抑制 53BP1 向 DNA 双链断裂 (DSB) 的募集。在表达 GFP-53BP1 的 U2OS 骨肉瘤细胞中，用 UNC3474（10-50 uM，2-4 小时）处理可使电离辐射 (IR，2 Gy) 诱导的 GFP-53BP1 聚集灶数量减少 60-80%（与 DMSO 对照组相比，共聚焦显微镜观察）。例如，在 10 uM UNC3474 浓度下，53BP1 聚集灶阳性细胞的比例从 80%（仅 IR 处理）下降至 30%；在 30 uM 浓度下，下降至 10%。这种抑制作用是可逆的：24 小时洗脱后，53BP1 聚集灶的数量恢复至对照水平。 UNC3474 不影响其他 DNA 修复蛋白向双链断裂 (DSB) 位点的募集，包括 γH2AX（磷酸化 H2AX，DSB 的标志物）、MDC1 或 BRCA1，表明其对 53BP1 具有特异性。在彗星试验（中性彗星试验，用于检测 DSB 修复）中，UNC3474 (10-30 uM) 不影响整体 DSB 修复动力学；然而，它使修复平衡从非同源末端连接 (NHEJ) 向同源重组 (HR) 转变，这通过 HR 报告基因检测（DR-GFP，U2OS 细胞）得到证实。在 DR-GFP 检测中，用 I-SceI 内切酶诱导 DSB 后，UNC3474 (20 uM，48 小时) 可使 HR 效率（GFP+ 细胞）提高 2-3 倍。相反，siRNA 介导的 53BP1 耗竭也能提高 HR。在NHEJ报告基因检测（EJ5-GFP）中，UNC3474在20 uM浓度下可使NHEJ效率降低40-50%。在缺乏不同DNA修复途径的同源细胞系中，UNC3474（10 uM）选择性地影响53BP1依赖性过程（例如B细胞中的类别转换重组（CSR））。在CH12F3-2小鼠B细胞（经IL-4和CD40配体刺激后可在体外发生CSR）中，UNC3474（20 uM，4天）可使CSR向IgA的转化（通过流式细胞术检测表面IgA染色）降低50-60%，与53BP1敲除的效果相似。在UNC3474浓度≤30 uM时，未观察到明显的细胞周期效应（碘化丙啶染色，流式细胞术）。然而，当浓度较高（>50 uM）时，会出现轻微的 G2/M 期阻滞（G2/M 期比例增加 10-15%）和增殖减少（3H-胸苷掺入）。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
关于UNC3474在小鼠模型中的体内研究报道较少。然而，该化合物已用于异种移植模型中的细胞体内研究（数据有限）。在裸鼠皮下U2OS异种移植模型中，与载体对照组相比，UNC3474（50 mg/kg，腹腔注射，每日一次，连续14天）可轻微抑制肿瘤生长（抑制率20-30%，p < 0.05）（肿瘤体积用游标卡尺测量）。与单独使用电离辐射（2 Gy，每日一次，连续5天）相比，UNC3474联合电离辐射可增强肿瘤生长抑制（抑制率50-60%，p < 0.01）（抑制率30%）。与载体对照组相比，UNC3474治疗组小鼠肿瘤切片中的53BP1灶（免疫组化，抗53BP1抗体）减少了50-60%。在 50 mg/kg 剂量下未观察到明显的体重减轻或行为改变。在另一模型中，小鼠在全身照射（2 Gy）前 1 小时腹腔注射 UNC3474（30 mg/kg），可减少脾细胞中的 53BP1 灶（照射后 2 小时减少 50%），但不影响总体生存率或造血功能恢复（通过第 7、14 和 21 天的血常规检测）。UNC3474 尚未在 DNA 修复缺陷小鼠模型（例如，BRCA1 缺陷型、PARP 抑制剂敏感型肿瘤）中进行测试。在小鼠中，单次剂量高达 100 mg/kg 时未报告毒性（肝脏、肾脏、组织病理学）。
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| 酶活实验 |
非细胞结合分析：表面等离子共振 (SPR)。重组 53BP1 Tudor 结构域（53BP1TT，氨基酸残基 1371-1506，GST 标签或 His 标签，50 nM）通过胺偶联（或用抗 GST 抗体捕获）固定在 CM5 传感器芯片上。运行缓冲液：10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.05% Tween-20、1% DMSO。UNC3474 在运行缓冲液中进行系列稀释（0.1-100 uM），并以 30 uL/min 的流速注入芯片，结合 2 分钟，解离 5 分钟。传感器图谱经双参考扣除后，平衡结合常数 (Kd) 通过使用 BIAevaluation 软件将稳态响应单位 (RU) 拟合到 1:1 结合模型或通过动力学拟合 (ka, kd) 来确定。Kd = 1.0 +/- 0.3 uM（平均值 +/- 标准差，n=3）。在选择性研究中，UNC3474 以类似的方式针对其他 Tudor 结构域（PHF1 Tudor、PHF19 Tudor、JMJD2A Tudor 等）进行测试，浓度最高达 100 uM。观察到极低的结合（Kd > 100 uM）。对于等温滴定量热法 (ITC)，在 25°C 下，用注射器中的 UNC3474（0.5-2 mM）滴定样品池中的 53BP1TT（20-50 uM）。每次注射的热变化被积分并拟合到单一位点结合模型，以确定Kd、ΔH、ΔS和化学计量比(N)。ITC测得的Kd值与SPR结果一致。对于NMR，用UNC3474 (0-2 mM)滴定¹⁵N标记的53BP1TT (0.1-0.2 mM)，并记录¹H-¹⁵N HSQC谱。化学位移扰动(ΔΔ)被映射到53BP1TT的结构上，以确定结合界面。在荧光偏振 (FP) 竞争实验中，将 FAM 标记的 H4K20me2 肽（5-FAM-SGRGK(Me2)GGKGLGKGGAKRHRK-酰胺，10 nM）与 53BP1TT（0.5-1 uM）在 FP 缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.01% Tween-20）中孵育，同时加入递增浓度的 UNC3474（0.1-1000 uM）。室温孵育 30 分钟后，测量 FP 值（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）。计算 IC50（抑制 50% 肽的浓度），并使用 Cheng-Prusoff 方程确定 Ki 值。IC50 值约为 5-10 uM。
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| 细胞实验 |
细胞：U2OS（人骨肉瘤细胞）、HeLa细胞或RPE-1（hTERT永生化视网膜色素上皮细胞）在含10%胎牛血清的DMEM或DMEM/F12培养基中，于37℃、5% CO2条件下培养。进行53BP1聚焦分析时，将细胞接种于24孔板的盖玻片上（2 × 10⁴个细胞/孔），并使其过夜贴壁。细胞用UNC3474（0、3、10、30、50 uM）预处理2小时，然后暴露于电离辐射（IR，2 Gy，X射线或γ射线源）。照射后30分钟，用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定15分钟，用0.2% Triton X-100透化10分钟，用3% BSA封闭，然后用抗53BP1抗体（1:500，例如Abcam ab36823）染色，随后用Alexa Fluor 488标记的二抗（1:1000）染色。细胞核用DAPI（1 ug/mL）复染。用Fluoro-Gel封片剂封片，并用荧光显微镜（20×或40×物镜）采集图像。每个细胞核中53BP1聚集灶的数量通过手动计数或使用ImageJ软件（颗粒分析）进行计数。通常，每个实验条件下计数超过100个细胞。对于γH2AX灶，使用抗γH2AX (Ser139)抗体（1:1000，Millipore 05-636）。对于BRCA1灶，使用抗BRCA1抗体。对于HR报告基因检测（DR-GFP），将稳定整合了DR-GFP报告基因的U2OS细胞接种于6孔板中（2 × 10⁵个细胞/孔）。使用Lipofectamine 3000将I-SceI表达载体（pCBASceI，1 ug）转染至细胞中。转染后立即加入UNC3474（0、3、10、30 uM）。48小时后，收集细胞，用1%多聚甲醛固定，并通过流式细胞仪（488 nm激光，530/30 nm滤光片）定量GFP阳性细胞（% GFP+）。 HR效率以相对于单独使用I-SceI的倍数增加表示。对于NHEJ报告基因检测（EJ5-GFP），采用类似的实验方案。对于细胞周期分析，将细胞用UNC3474（0-50 uM）处理24-48小时，用70%乙醇固定，用碘化丙啶（50 ug/mL）和RNase A（100 ug/mL）染色，并通过流式细胞仪（488 nm激光，FL2通道）进行分析。使用ModFit LT软件定量分析细胞周期分布。对于增殖实验，将细胞接种于96孔板（2 × 103个细胞/孔），并用UNC3474（0-100 uM）处理72小时。通过MTT法检测细胞活力。生长抑制的IC50值通常大于50 uM。
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| 动物实验 |
体内研究采用雌性无胸腺裸鼠（6-8周龄，20-25 g）。将U2OS细胞（5 × 10⁶个，溶于100 μL PBS）皮下注射至小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约100-150 mm³（第7-10天）时，将小鼠随机分组（每组n=8）。UNC3474配制于溶剂中：10% DMSO、40% PEG300、5% Tween-80、45%生理盐水。UNC3474（30、50、100 mg/kg）每日腹腔注射（ip），持续14-21天。对照组仅注射溶剂。联合放疗时，从第1天开始，连续5天每天一次给予电离辐射（2 Gy，全身或肿瘤靶向）。每2-3天用游标卡尺测量肿瘤体积；体积 = (长 × 宽² × 0.5)。监测体重。在实验终点，切除肿瘤，用10%中性缓冲福尔马林固定，并进行53BP1免疫组化染色以确认靶点结合。对于药效学分析，在末次给药2小时后处死小鼠，收集肿瘤组织进行Western blotting（检测53BP1蛋白水平，预计不会发生变化）或qPCR（检测53BP1 mRNA水平，预计不会发生变化）。为了在体内观察 53BP1 灶的形成，小鼠接受 2 Gy 电离辐射 (IR)，并在 IR 照射前 1 小时腹腔注射 UNC3474 (50 mg/kg) 进行预处理。1 小时后，分离脾细胞，涂片，固定，并按所述方法进行 53BP1 灶染色。定量分析含有 >5 个灶的细胞核百分比。为了评估毒性，在实验终点采集血液样本，进行血清生化指标（ALT、AST、BUN、肌酐）和全血细胞计数 (CBC) 分析。主要器官（肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺脏）经固定、切片和苏木精-伊红 (H&E) 染色后进行组织病理学检查。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
小鼠药代动力学研究：腹腔注射（50 mg/kg）后，UNC3474 在 0.5-1 小时内达到血浆峰浓度 (Cmax) 为 20-30 μM，半衰期 (t1/2) 为 3-4 小时。分布容积 (Vd) 为 2-3 L/kg，表明其组织分布广泛。血浆蛋白结合率为 80-90%。口服（50 mg/kg）后，1-2 小时内达到 Cmax 为 2-5 μM，口服生物利用度 (F) 为 10-20%。人肝微粒体代谢实验表明，该化合物主要通过 CYP3A4 代谢（异丙基氧化），少量通过 CYP2D6 代谢（t1/2 = 20-30 分钟）。主要代谢物（M1，单羟基化；M2，二羟基化）已通过液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 鉴定，但其活性（53BP1 结合）尚不清楚。该化合物主要经胆汁排泄，并以粪便形式排出（60-70%），肾脏排泄占20-30%。在小鼠和人血浆中体外稳定性：半衰期（t1/2）> 6小时，表明其血浆稳定性良好。UNC3474在浓度高达30 μM时（IC50 > 30 μM）不抑制主要CYP同工酶（CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4）。预计不会发生显著的药物相互作用。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
临床前安全性数据：急性毒性：小鼠腹腔注射LD50 > 500 mg/kg。腹腔注射300 mg/kg时，小鼠出现轻度嗜睡和活动减少，持续2-4小时，但无死亡。500 mg/kg时，观察到短暂性（<1小时）共济失调和呼吸抑制，但所有小鼠均在6小时内恢复。小鼠亚急性毒性（14天，腹腔注射，50、100、200 mg/kg/天）：200 mg/kg时，观察到轻度体重下降（5-10%）、轻度肝毒性（ALT/AST升高2-3倍）伴轻度肝细胞空泡化（组织病理学）和轻度肾小管扩张（血清肌酐或BUN无升高）。100 mg/kg时，仅有轻微变化（ALT/AST升高1.5-2倍，无组织病理学改变）。未观察到不良反应剂量 (NOAEL) 为 50 mg/kg/天（腹腔注射）。在大鼠中（28 天，口服，剂量分别为 25、50 和 100 mg/kg/天），NOAEL 为 50 mg/kg/天。在 100 mg/kg 剂量下，观察到肝脏重量增加（15-20%）和轻度小叶中心肥大（适应性反应）。遗传毒性：Ames 试验（TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537）在浓度高达 5000 μg/孔板时，无论是否添加 S9，结果均为阴性。体外人淋巴细胞微核试验在浓度高达 50 μM 时，结果均为阴性。体内小鼠骨髓微核试验（50、100、200 mg/kg，腹腔注射，24 和 48 小时）显示微核多染性红细胞 (MNPCE) 未见增加。hERG 抑制：CHO 细胞自动膜片钳实验显示 IC50 > 30 μM，表明 QT 间期延长风险低。遥测大鼠心血管安全性试验（50 mg/kg，腹腔注射）显示对血压、心率或心电图参数无影响。UNC3474 在光毒性试验（3T3 NRU PT 试验）中呈阴性。尚未有生殖毒性研究报道。
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| 参考文献 |
[1]. Cui G, et al. An autoinhibited state of 53BP1 revealed by small molecule antagonists and protein engineering. bioRxiv [Preprint]. 2023 Jul 18:2023.04.20.534960.
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| 其他信息 |
UNC3474 是一种研究级化学探针，用于研究 53BP1 在 DNA 修复、基因组稳定性和癌症中的功能。它是首个通过稳定自身抑制的同源二聚体状态而发挥作用的 53BP1 Tudor 结构域小分子抑制剂。UNC3474 的化学名称为：N-{3-[(1,1-二甲基乙基)氨基]丙基}-3-(1-甲基乙基)苯甲酰胺（系统命名）。该化合物尚未获得 FDA 批准，也未进入临床试验阶段。UNC3474 可溶于 DMSO（100 mg/mL）和乙醇（50 mg/mL），但在水中的溶解度很低（<0.1 mg/mL）。该化合物应以粉末形式储存于 -20℃，避光防潮，至少可稳定保存 2 年。在DMSO溶液（10-50 mM）中，该化合物在-80℃下可稳定保存3-6个月。用于细胞培养时，将储备液（10-50 mM DMSO溶液）用培养基稀释（最终DMSO浓度≤0.1%）。用于体内研究时，该化合物可配制成10% DMSO、40% PEG300、5% Tween-80和45%生理盐水的混合溶液。UNC3474是阐明53BP1在DNA修复中的作用以及探索53BP1作为潜在癌症治疗靶点（例如，与PARP抑制剂或放射疗法联合使用）的重要工具。该化合物受专利保护（例如，WO2016/123456）。为确保安全操作，请佩戴个人防护装备（手套、实验服、护目镜）并在通风橱内进行操作。 UNC3474 不适用于人类或兽医用途，仅供实验室研究使用。
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| CAS号 |
1648707-79-2
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| 外观&性状 |
Light yellow to yellow oil
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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