λ-Carrageenan (Carrageenan)   中文名称: λ-角叉胶

Natural seaweed polysaccharide; Biochemical reagent

λ-卡拉胶对B16-F10和4T1细胞体外存活率的影响[1]
由于瘤内注射λ-卡拉胶对小鼠具有显著的抗肿瘤作用，我们进一步研究了肿瘤生长抑制是否是由λ-卡拉金的直接细胞毒性引起的。在体外用λ-卡拉胶孵育肿瘤细胞后，通过显微镜记录细胞形态，并通过台盼蓝排斥试验评估细胞存活率。B16-F10和4T1细胞与浓度为0.25-1.0 mg/ml的λ-卡拉胶一起孵育24小时，细胞形态正常（图2A）。台盼蓝排斥试验表明，即使在1.0 mg/ml的高浓度下，细胞存活率也保持在80%以上（图2B），这表明λ-卡拉胶对肿瘤细胞的细胞毒性较低。此外，MTT细胞增殖试验的结果具有相似的结果（图2C）。λ-卡拉胶孵育肿瘤细胞24小时后，对细胞增殖没有影响。在暴露于λ-卡拉胶48小时后，随着λ-卡拉金浓度的增加，相对细胞存活率略有下降。因此，研究结果表明，λ-卡拉胶在体外对肿瘤细胞的细胞毒性较低。

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λ-卡拉胶处理可增加IL17A和TNF-α的表达[1]
我们还通过流式细胞术和qRT-PCR对细胞内IL17A进行染色，检测了小鼠脾脏中T辅助细胞17（Th17）的比例。Th17招募并激活中性粒细胞，在真菌和细胞外病原体的免疫反应中起着重要作用。我们发现，瘤内注射λ-卡拉胶导致Th17细胞增加，脾淋巴细胞中IL17A分泌增加（图4A），这可能有助于刺激λ-卡拉金治疗后荷瘤小鼠的免疫反应。

λ-卡拉胶（每两天 50 毫克/千克；瘤内注射）可抑制 B16-F10 和 4T1 小鼠的肿瘤形成[1]。 λ-卡拉胶通过增加免疫刺激细胞的浸润并产生更多的促炎细胞因子，显着增强肿瘤免疫反应，瘤内注射时具有显着的抗癌作用[1]。

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λ-卡拉胶是一种海藻多糖，在基础研究中通常用作促炎剂，然而，λ-卡拉菜胶的免疫调节活性如何影响肿瘤微环境尚不清楚。在这项研究中，我们发现瘤内注射λ-卡拉胶可以抑制B16-F10和4T1携带小鼠的肿瘤生长，并通过增加脾脏中浸润肿瘤的M1巨噬细胞、DC和更活化的CD4（+）CD8（+）T淋巴细胞的数量来增强肿瘤免疫反应。此外，λ-卡拉胶可以增强脾脏中IL17A的分泌，显著增加肿瘤中TNF-α的水平，其中大部分是由浸润的巨噬细胞分泌的。此外，λ-卡拉胶在基于OVA的癌症预防和治疗疫苗中表现出有效的辅助作用，显著提高了抗OVA抗体的产生。毒性分析表明，λ-卡拉胶具有良好的安全性。因此，λ-卡拉胶可以作为一种有效的抗肿瘤剂和癌症免疫疗法的有效佐剂[1]。

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λ-卡拉胶抑制B16-F10和4T1携带小鼠的肿瘤生长[1]
为了研究肿瘤内注射λ-卡拉胶对肿瘤微环境的影响，我们选择黑色素瘤B16-F10和乳腺癌症4T1作为模型。B16-F10 cells (5 × 105 cell/mice) were injected subcutaneously in mice (Fig. 1A) and 4T1 cells (1 × 106 细胞/小鼠）皮下注射到右背侧（图1B）或皮下注射到小鼠乳腺脂肪垫（图1C）以建立肿瘤模型。The administration started after the tumors reached the average volume of 30–40 mm3. λ-Carrageenan was injected every two days intratumoraly at a dose of 50 mg/kg，并记录肿瘤体积。在三种肿瘤模型中，与生理盐水组相比，瘤内注射λ-卡拉胶导致肿瘤体积显著减少（图1）。我们注意到，在4T1模型中，λ-卡拉胶的抗肿瘤作用与阿霉素相当（图1C）。根据方法（1）中的公式计算，B16-F10和4T1模型的肿瘤抑制率分别为56.8%、39%和42.7%。此外，我们注意到λ-卡拉胶在B16-F10肿瘤模型中具有更强的抗肿瘤作用，因此，我们选择B16-F10-肿瘤作为模型，进一步研究λ-卡拉菜胶如何影响肿瘤的微环境。

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瘤内注射λ-卡拉胶可刺激肿瘤免疫反应[1]
由于λ-卡拉胶在与肿瘤细胞孵育后在体外表现出较低的细胞毒性，我们接下来研究了λ-卡拉菜胶在小鼠肿瘤内注射后如何影响体内肿瘤微环境。肿瘤微环境包含许多不同的细胞类型，免疫细胞起着至关重要的作用，如F4/80+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞，它们分别在免疫反应的启动和抗原呈递过程中起着重要作用。我们通过流式细胞术评估了瘤内注射λ-卡拉胶后肿瘤微环境中的免疫细胞。如图3A（左）所示，与对照组相比，λ-卡拉胶处理后F4/80低巨噬细胞的比例急剧增加了10倍。此外，CD11c+DCs在肿瘤组织中也从0.6%增加到2.4%（图3A，右）。这些结果表明，大量F4/80低水平巨噬细胞和树突状细胞在λ-卡拉胶注射后浸润到肿瘤组织中。

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λ-卡拉胶作为佐剂增强基于OVA的疫苗效力[1]
我们评估了λ-卡拉胶作为佐剂在小鼠预防性疫苗和治疗性疫苗中的使用效率。在癌症预防性疫苗的评估中，小鼠用OVA接种三次，加入或不加入λ-卡拉胶，然后用E.G7-OVA细胞（3× 106 cell/mice). 记录肿瘤体积。结果显示，与生理盐水和OVA组相比，添加λ-卡拉胶作为佐剂的疫苗显著抑制了肿瘤生长（图5A）。当涉及到治疗性疫苗时，与对照组相比，注射OVA没有显示出治疗效果，与此相反，注射OVA/λ-卡拉胶在一定程度上抑制了肿瘤生长，而与其他组相比（图5B）。用λ-卡拉胶预防性疫苗免疫小鼠后，10只小鼠中有6只在接种肿瘤后40天以上没有肿瘤，而NS组和OVA组的所有小鼠都出现了肿瘤（图5C）。在小鼠最后一次免疫一周后，收集小鼠血清，通过ELISA检测总抗OVA IgG。如图5D所示，与其他两组相比，用OVA/λ-卡拉胶免疫的小鼠产生的抗体显著增加。OVA和OVA/λ-卡拉胶组样品的吸光度分别为0.35和0.78，与OVA组相比（从2000到8000），OVA/λ卡拉胶组的抗体滴度增加了四倍。

TUNEL检测[1]
为了检查B16-F10肿瘤在瘤内注射λ-卡拉胶后的细胞死亡情况，根据制造商的说明，使用市售的TUNEL试剂盒 用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸生物素缺口末端标记（TUNEL）对肿瘤组织标本的石蜡切片进行染色。在DM 2500荧光显微镜下观察样品

体外细胞活力测定[1]
使用台盼蓝排斥试验和MTT试验测量细胞存活率。将B16-F10和4T1细胞分别接种到96个多孔板中并培养过夜以实现细胞粘附。然后用不同浓度（0.25、0.5、1、2.5 mg/mL）的λ-carrageenan/λ-卡拉胶处理细胞。处理24小时和48小时后，我们用含有MTT（0.5mg/mL）的新培养基替换液体，并孵育4小时，直至可见紫色沉淀。去除MTT，加入150μL DMSO溶解沉淀。使用微孔板读数器在570nm处测量吸光度。每种浓度复制6个孔。同时设立空白组和对照组。对于台盼蓝排斥试验，将细胞作为MTT试验处理。经过λ-卡拉胶处理后，首先通过显微镜评估细胞的状态。然后收获细胞，将10μl细胞悬浮液与10μl 0.4%台盼蓝溶液混合3 通过Countstar自动细胞计数器对未染色（活）和染色（死）细胞进行计数。

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流式细胞术分析[1]
经λ-carrageenan/λ-卡拉胶处理后，用PE或PerCP-CD4、FITC-CD8、PE-CD69、FITC或PerCP-CD11b、PE-F4/80、PE-CD11c、FITC-IL17A、FITC-TNF-α对脾脏和肿瘤制备的免疫细胞进行染色。 将肿瘤切成小块，并在无血清RPMI 1640培养基中用1mg/mL胶原酶I分离2小时。将得到的细胞悬浮液离心，在PBS中洗涤，然后通过BD Falcon™70μm尼龙细胞过滤器去除细胞团块和碎片。对于细胞表面染色，细胞在黑暗中用抗体在冰上染色30分钟；对于细胞内细胞因子染色，用多聚甲醛和Triton-X100固定/渗透细胞，然后用细胞内抗体染色过夜。在FACS Calibur流式细胞仪上进行分析，并使用FlowJo软件分析数据。

肿瘤模型和λ-角叉菜胶治疗 λ-角叉菜胶购自Sigma-Aldrich公司（货号22049）。将B16-F10细胞（5×10⁵个细胞/只小鼠）皮下注射至C57BL/6小鼠右侧背部。将4T1细胞（1×10⁶个细胞/只小鼠）皮下注射至BALB/c小鼠右侧背部或乳腺脂肪垫，以建立肿瘤模型。待肿瘤平均体积达到30-40 mm³后开始给药。将溶于生理盐水的1% λ-角叉菜胶溶液以100 μL的体积每两天瘤内注射一次，阴性对照组注射100 μL生理盐水（NS）。阿霉素（大连美隆药业有限公司，中国）用作阳性对照抗肿瘤药物。小鼠每三天腹腔注射一次阿霉素（5 mg/kg）。每三天用游标卡尺测量肿瘤直径以评估肿瘤生长情况，肿瘤体积计算公式为（长径）×（短径）²×0.5²。末次给药两天后处死小鼠，取出肿瘤和器官，称重后用4%多聚甲醛固定，用于组织化学染色；另一部分肿瘤组织保存在液氮中备用。抑制率按以下公式计算：抑制率（%）= [(A−B)/A]×100，其中A代表阴性对照组的平均肿瘤重量，B代表λ-角叉菜胶处理组的平均肿瘤重量。

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OVA和λ-卡拉胶的抗肿瘤免疫实验 在预防性肿瘤疫苗实验中，C57BL/6小鼠（每组n=8）左侧背部皮下注射5 μg OVA蛋白或OVA蛋白加100 μg λ-卡拉胶佐剂（总体积100 μL生理盐水），共注射3次（分别于0、2和3周）。末次免疫一周后，小鼠接受EG7-OVA细胞攻击。将肿瘤细胞（3 × 10⁶）皮下注射至小鼠右侧背部。每三天测量一次皮下肿瘤体积，并每日观察小鼠的肿瘤形成率。在治疗性抗肿瘤疫苗实验中，将EG7-OVA细胞皮下注射至C57BL/6小鼠右侧背部。当肿瘤肿块可触及（长度约3毫米）时，对荷瘤小鼠进行治疗，在左侧背部每隔一周注射一次疫苗，共注射3次。皮下肿瘤体积的测量方法如上所述。

肿瘤组织病理学研究及毒性评价[1]
本研究采用苏木精-伊红染色法研究λ-角叉菜胶处理后肿瘤的形态学变化。如图6A所示，λ-角叉菜胶瘤内注射组的B16-F10肿瘤组织出现部分细胞坏死，且免疫细胞浸润显著增加。然而，生理盐水处理组小鼠的肿瘤组织切片形态正常。我们还进行了TUNEL检测和cleaved caspase-3染色，以评估肿瘤组织切片中的细胞死亡情况。如图6B所示，瘤内注射λ-角叉菜胶后，TUNEL阳性细胞和cleaved caspase-3阳性细胞均显著增加，这可能有助于解释λ-角叉菜胶显著的抗肿瘤作用。图6C展示了接种或未接种治疗性疫苗的E.G7-OVA荷瘤小鼠的肿瘤组织切片。用OVA/λ-卡拉胶免疫的小鼠也表现出肿瘤细胞死亡增加和免疫细胞浸润增多。此外，为了检测λ-卡拉胶的潜在毒性，我们收集了λ-卡拉胶处理小鼠的重要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏），并进行H&E染色切片，用于组织病理学研究。如图6D所示，λ-卡拉胶处理小鼠未发现明显的病理变化。此外，通过观察小鼠的外观、体重、粪便和尿液排泄情况，也未观察到明显的毒性反应。[1]

[1]. Antitumor and Adjuvant Activity of λ-carrageenan by Stimulating Immune Response in Cancer Immunotherapy. Sci Rep. 2015;5:11062. Published 2015 Jun 22.

此外，瘤内注射λ-卡拉胶导致促炎细胞因子IL-17A（图4A）的增加，IL-17A由一类辅助性T细胞（Th17细胞）分泌。大多数Th17细胞能够产生高水平的效应细胞因子，例如TNF-α，并通过诱导促炎性免疫效应细胞的募集来促进抗肿瘤免疫反应。这也支持了我们关于瘤内注射λ-卡拉胶可以增强肿瘤免疫反应的结论。此外，Malley等人报道了IL-17A在肺炎球菌疫苗接种过程中的免疫反应作用。添加佐剂诱导的Th17细胞增加可能显著提高疫苗的效力。在本研究中，我们也使用了λ-卡拉胶作为佐剂，用于预防性疫苗和癌症治疗性疫苗。在表达卵清蛋白（OVA）的EG7淋巴瘤模型中，λ-卡拉胶作为OVA疫苗的有效佐剂。此外，λ-卡拉胶还能增强小鼠免疫后抗OVA抗体的产生。这表明，以λ-卡拉胶为佐剂免疫的小鼠表现出强烈的体液免疫反应，这种反应可能由B淋巴细胞产生的抗体介导。[1] 总之，本文深入探讨了λ-卡拉胶在癌症治疗中作为抗肿瘤药物和疫苗佐剂的作用。瘤内注射λ-卡拉胶表现出显著的抗肿瘤效果，并显著增强了肿瘤免疫反应，表现为免疫刺激细胞浸润增加和促炎细胞因子产生增多。作为疫苗佐剂，λ-卡拉胶显著提高了预防性和治疗性癌症疫苗的疗效。此外，注射λ-卡拉胶未对受试小鼠的重要器官造成毒性。因此，我们得出结论，λ-卡拉胶是一种有效的抗肿瘤剂和佐剂，可进一步用于癌症治疗以增强肿瘤免疫反应。[1]

1139.92

9064-57-7

91972149

White to off-white solid powder

-6.1

675.31

5

20

7

35

969

0

S(=O)(=O)([O-])OC1([H])C([H])(C([H])(C([H])(C([H])([H])O[H])OC1([H])OC1([H])C([H])(C([H])([H])OS(=O)(=O)[O-])OC([H])(C([H])(C1([H])O[H])OS(=O)(=O)[O-])O[H])O[H])O[H]

UWPXLSAITSWCRB-UHFFFAOYSA-K

InChI=1S/C12H22O20S3/c13-1-3-5(14)6(15)10(32-35(24,25)26)12(29-3)30-8-4(2-27-33(18,19)20)28-11(17)9(7(8)16)31-34(21,22)23/h3-17H,1-2H2,(H,18,19,20)(H,21,22,23)(H,24,25,26)/p-3

[5-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-2,4-dihydroxy-6-(sulfonatooxymethyl)oxan-3-yl] sulfate

9064-57-7; UWPXLSAITSWCRB-UHFFFAOYSA-K; YC41782;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O: 25 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。