λ-Carrageenan (Carrageenan)   中文名称: λ-角叉胶

Natural seaweed polysaccharide; Biochemical reagent
Natural seaweed polysaccharide; used as a biochemical reagent. Its primary targets are the immune system components it modulates, such as Th17 cells and proinflammatory cytokines like IL17A and TNF-α.

λ-卡拉胶对B16-F10和4T1细胞体外活力的影响[1]
由于瘤内注射λ-卡拉胶在小鼠体内具有显著的抗肿瘤作用，我们进一步研究了肿瘤生长抑制是否由λ-卡拉胶的直接细胞毒性所致。将肿瘤细胞与λ-卡拉胶体外孵育后，通过显微镜记录细胞形态，并用台盼蓝排除法评估细胞活力。B16-F10和4T1细胞与浓度为0.25–1.0 mg/ml的λ-卡拉胶孵育24小时，细胞形态正常（图2A）。台盼蓝排除试验表明，即使在1.0 mg/ml的高浓度下，细胞活力仍保持在80%以上（图2B），这表明λ-卡拉胶对肿瘤细胞的细胞毒性较低。此外，MTT细胞增殖试验的结果也与之类似（图2C）。肿瘤细胞与λ-卡拉胶孵育24小时后，细胞增殖未受影响。暴露于λ-卡拉胶48小时后，随着λ-卡拉胶浓度的增加，细胞相对活力略有下降。因此，结果表明λ-卡拉胶在体外对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性。

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λ-角叉菜胶处理可增加IL-17A和TNF-α的表达[1]
我们还通过流式细胞术和qRT-PCR检测了小鼠脾脏中T辅助细胞17 (Th17)的比例，并分析了细胞内IL-17A的表达。Th17可募集并激活中性粒细胞，在针对真菌和细胞外病原体的免疫反应中发挥重要作用。我们发现，瘤内注射λ-角叉菜胶可导致脾脏淋巴细胞中Th17细胞数量增加和IL-17A分泌增加（图4A），这可能有助于λ-角叉菜胶处理后荷瘤小鼠免疫反应的增强。

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体外实验表明，λ-角叉菜胶对肿瘤细胞（B16-F10和4T1）的细胞毒性较低。即使在 1.0 mg/ml 的高浓度下，处理 24 小时后细胞活力仍保持在 80% 以上。MTT 增殖实验表明，24 小时后细胞增殖未受影响，48 小时后仅略有下降。该化合物可增加脾淋巴细胞中 IL-17A 和 TNF-α 的表达。

λ-卡拉胶（50 mg/kg，每两天一次；瘤内注射）可抑制荷瘤小鼠（B16-F10 和 4T1）的肿瘤形成[1]。λ-卡拉胶通过增加免疫刺激细胞的浸润和促炎细胞因子的产生，显著增强肿瘤免疫反应，瘤内注射后具有显著的抗癌作用[1]。λ-卡拉胶是一种海藻多糖，通常被用作基础研究中的促炎剂，然而，λ-卡拉胶的免疫调节活性如何影响肿瘤微环境仍不清楚。本研究发现，瘤内注射λ-卡拉胶可抑制荷瘤小鼠（B16-F10和4T1）的肿瘤生长，并通过增加肿瘤浸润的M1型巨噬细胞、树突状细胞（DC）以及脾脏中活化的CD4⁺CD8⁺ T淋巴细胞的数量来增强肿瘤免疫反应。此外，λ-卡拉胶可增强脾脏中IL-17A的分泌，并显著提高肿瘤中TNF-α的水平，其中大部分由浸润的巨噬细胞分泌。而且，λ-卡拉胶在基于卵清蛋白（OVA）的癌症预防和治疗疫苗中表现出有效的佐剂作用，可显著增强抗OVA抗体的产生。毒性分析表明，λ-卡拉胶具有良好的安全性。因此，λ-卡拉胶可能既是一种强效的抗肿瘤剂，又是一种有效的癌症免疫疗法佐剂[1]。

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λ-卡拉胶抑制荷瘤小鼠（B16-F10 和 4T1）的肿瘤生长[1]
为了研究瘤内注射 λ-卡拉胶如何影响肿瘤微环境，我们选择了黑色素瘤 B16-F10 和乳腺癌 4T1 作为模型。将 B16-F10 细胞（5 × 10⁵ 个细胞/只小鼠）皮下注射到小鼠体内（图 1A），将 4T1 细胞（1 × 10⁶ 个细胞/只小鼠）皮下注射到小鼠右侧背部（图 1B）或皮下注射到小鼠乳腺脂肪垫（图 1C）以建立肿瘤模型。当肿瘤平均体积达到 30–40 mm³ 后开始给药。每隔两天瘤内注射 λ-角叉菜胶，剂量为 50 mg/kg，并记录肿瘤体积。与生理盐水组相比，在三种肿瘤模型中，瘤内注射 λ-角叉菜胶均显著缩小了肿瘤体积（图 1）。我们注意到，在 4T1 模型中，λ-角叉菜胶的抗肿瘤效果与阿霉素相当（图 1C）。根据方法部分 (1) 中的公式计算，在 B16-F10 和 4T1 模型中，肿瘤抑制率分别为 56.8%、39% 和 42.7%。此外，我们注意到λ-卡拉胶在B16-F10肿瘤模型中具有更强的抗肿瘤作用，因此，我们选择B16-F10肿瘤作为模型，进一步研究λ-卡拉胶如何影响肿瘤微环境。

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瘤内注射λ-卡拉胶可刺激肿瘤免疫反应[1]
由于λ-卡拉胶在体外与肿瘤细胞孵育后显示出较低的细胞毒性，我们接下来研究了λ-卡拉胶在小鼠体内瘤内注射后如何影响肿瘤微环境。肿瘤微环境包含许多不同的细胞类型，其中免疫细胞发挥着至关重要的作用，例如F4/80+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞，它们分别在启动免疫反应和抗原呈递过程中发挥重要作用。我们采用流式细胞术评估了瘤内注射λ-角叉菜胶后肿瘤微环境中的免疫细胞。如图3A（左）所示，与对照组相比，λ-角叉菜胶处理后F4/80low巨噬细胞的比例显著增加了10倍。此外，肿瘤组织中CD11c+树突状细胞（DC）的比例也从0.6%增加到2.4%（图3A，右）。这些结果表明，λ-角叉菜胶注射后，大量F4/80low巨噬细胞和树突状细胞浸润到肿瘤组织中。

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λ-角叉菜胶作为佐剂增强OVA疫苗效力[1]
我们评估了λ-角叉菜胶作为佐剂在小鼠预防性疫苗和治疗性疫苗中的有效性。在癌症预防疫苗的评估中，小鼠接种三次含或不含λ-卡拉胶的OVA疫苗，然后用E.G7-OVA细胞（3 × 10⁶个细胞/只小鼠）进行攻击。记录肿瘤体积。结果表明，与生理盐水组和OVA组相比，添加λ-卡拉胶作为佐剂的疫苗显著抑制了肿瘤生长（图5A）。在治疗性疫苗方面，与对照组相比，注射OVA未显示出治疗效果；相反，与其它组相比，注射OVA/λ-卡拉胶在一定程度上抑制了肿瘤生长（图5B）。用含λ-卡拉胶的预防性疫苗免疫小鼠后，10只小鼠中有6只在肿瘤接种后40天以上未见肿瘤，而生理盐水组和OVA组的所有小鼠均出现肿瘤（图5C）。小鼠完成最后一次免疫一周后，收集小鼠血清，并用ELISA法检测总抗OVA IgG水平。如图5D所示，与另外两组相比，OVA/λ-卡拉胶免疫小鼠产生的抗体显著增加。OVA组和OVA/λ-卡拉胶组样本的吸光度值分别为0.35和0.78，表明OVA/λ-卡拉胶组的抗体滴度是OVA组的四倍（从2000增至8000）。

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λ-卡拉胶以50 mg/kg的剂量每两天瘤内注射一次，可抑制携带B16-F10和4T1细胞的小鼠肿瘤的进展。它通过促进免疫刺激细胞的浸润和增强促炎细胞因子的产生来增强肿瘤内的免疫反应。

TUNEL 检测 [1]
为了检测 B16-F10 肿瘤细胞在瘤内注射 λ-角叉菜胶后的死亡情况，我们使用市售的 TUNEL 试剂盒（Promega，美国威斯康星州麦迪逊市）按照制造商的说明，对肿瘤组织标本的石蜡切片进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端标记 (TUNEL) 染色。在 DM 2500 荧光显微镜下观察样本。

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为了评估体外细胞毒性，将肿瘤细胞（例如 B16-F10、4T1）与 λ-角叉菜胶（0.25-1.0 mg/mL）孵育 24-48 小时。使用台盼蓝排除法和 MTT 增殖试验检测细胞活力。同时，在显微镜下观察并记录细胞形态。

体外细胞活力检测[1]
采用台盼蓝排除法和MTT法检测细胞活力。将B16-F10和4T1细胞分别接种于96孔板中，培养过夜以促进细胞黏附。然后用不同浓度（0.25、0.5、1、2.5 mg/mL）的λ-卡拉胶处理细胞。处理24小时和48小时后，更换培养基，加入含MTT（0.5 mg/mL）的新鲜培养基，孵育4小时直至出现紫色沉淀。移除MTT溶液，加入150 μL DMSO溶解沉淀。使用酶标仪在570 nm处测定吸光度。每个浓度设置6个复孔。同时设置空白组和对照组。台盼蓝排除法的细胞处理方法与MTT法相同。经λ-卡拉胶处理后，首先通过显微镜评估细胞状态。然后收集细胞，取10 μl细胞悬液与10 μl 0.4%台盼蓝溶液混合，孵育3分钟，并使用Countstar全自动细胞计数仪对未染色（活细胞）和染色（死细胞）的细胞进行计数。

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流式细胞术分析[1]
经λ-卡拉胶处理后，从脾脏和肿瘤中制备的免疫细胞用PE或PerCP-CD4、FITC-CD8、PE-CD69、FITC或PerCP-CD11b、PE-F4/80、PE-CD11c、FITC-IL17A和FITC-TNF-α进行染色。所有荧光染料标记的抗体和同型对照单克隆抗体均购自BD Pharmingen公司。将肿瘤组织剪成小块，并在无血清RPMI 1640培养基中用1 mg/mL I型胶原酶消化2小时。将所得细胞悬液离心，用PBS洗涤，并通过BD Falcon™ 70 μm尼龙细胞筛网过滤以去除细胞团块和碎片。细胞表面染色时，将细胞与抗体在冰上避光孵育30分钟；细胞内细胞因子染色时，用多聚甲醛和Triton-X100固定/透化细胞，然后与细胞内抗体孵育过夜。使用FACS Calibur流式细胞仪进行分析，并使用FlowJo软件分析数据。体内疗效研究中，将已建立B16-F10或4T1肿瘤的小鼠每两天进行一次瘤内注射λ-角叉菜胶（50 mg/kg）。通过测量肿瘤体积监测肿瘤生长情况。通过流式细胞术和 qRT-PCR 分析肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和细胞因子水平。

肿瘤模型和λ-角叉菜胶治疗 λ-角叉菜胶购自Sigma-Aldrich公司（货号22049）。将B16-F10细胞（5×10⁵个细胞/只小鼠）皮下注射至C57BL/6小鼠右侧背部。将4T1细胞（1×10⁶个细胞/只小鼠）皮下注射至BALB/c小鼠右侧背部或乳腺脂肪垫，以建立肿瘤模型。待肿瘤平均体积达到30-40 mm³后开始给药。将溶于生理盐水的1% λ-角叉菜胶溶液以100 μL的体积每两天瘤内注射一次，阴性对照组注射100 μL生理盐水（NS）。阿霉素（大连美隆药业有限公司，中国）用作阳性对照抗肿瘤药物。小鼠每三天腹腔注射一次阿霉素（5 mg/kg）。每三天用游标卡尺测量肿瘤直径以评估肿瘤生长情况，肿瘤体积计算公式为（长径）×（短径）²×0.5²。末次给药两天后处死小鼠，取出肿瘤和器官，称重后用4%多聚甲醛固定，用于组织化学染色；另一部分肿瘤组织保存在液氮中备用。抑制率按以下公式计算：抑制率（%）= [(A−B)/A]×100，其中A代表阴性对照组的平均肿瘤重量，B代表λ-角叉菜胶处理组的平均肿瘤重量。

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OVA和λ-卡拉胶的抗肿瘤免疫实验 在预防性肿瘤疫苗实验中，C57BL/6小鼠（每组n=8）左侧背部皮下注射5 μg OVA蛋白或OVA蛋白加100 μg λ-卡拉胶佐剂（总体积100 μL生理盐水），共注射3次（分别于0、2和3周）。末次免疫一周后，小鼠接受EG7-OVA细胞攻击。将肿瘤细胞（3 × 10⁶）皮下注射至小鼠右侧背部。每三天测量一次皮下肿瘤体积，并每日观察小鼠的肿瘤形成率。在治疗性抗肿瘤疫苗实验中，将EG7-OVA细胞皮下注射至C57BL/6小鼠右侧背部。当肿瘤肿块可触及（长度约 3 mm）时，对荷瘤小鼠进行治疗，在左侧背部每隔一周注射一次疫苗，共注射 3 次。皮下肿瘤体积的测量方法如上所述。

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由于 λ-角叉菜胶通常用作生物试剂而非药物，因此其药代动力学数据通常不详述。作为一种大分子多糖，预计其口服生物利用度较低，通常采用局部给药（例如，瘤内注射）。其分布和清除取决于其分子量和结构。

λ-卡拉胶的急性毒性被认为较低。它常用作食品添加剂，并在许多地区被普遍认为是安全的（GRAS）。然而，作为一种促炎剂，高剂量或特定给药途径可诱发局部炎症和疼痛，这也是其研究应用的一部分。

肿瘤组织病理学研究及毒性评价[1]
本研究采用苏木精-伊红染色法研究了λ-角叉菜胶治疗后肿瘤的形态学变化。如图6A所示，λ-角叉菜胶瘤内注射组的B16-F10肿瘤组织出现部分细胞坏死，且免疫细胞浸润显著增加。而生理盐水处理组小鼠的肿瘤组织切片形态正常。我们还进行了TUNEL检测和cleaved caspase-3染色以评估肿瘤组织切片中的细胞死亡情况。如图6B所示，瘤内注射λ-角叉菜胶后，TUNEL阳性细胞和cleaved caspase-3阳性细胞均显著增加，这可能有助于解释λ-角叉菜胶显著的抗肿瘤作用。图6C显示了接种或未接种治疗性疫苗的E.G7-OVA荷瘤小鼠的肿瘤组织切片。用OVA/λ-卡拉胶免疫的小鼠也表现出肿瘤细胞死亡增加和免疫细胞浸润增加。此外，为了检测λ-卡拉胶的潜在毒性，我们收集了λ-卡拉胶处理小鼠的重要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏），并进行H&E染色以进行组织病理学研究。如图6D所示，λ-卡拉胶处理小鼠未发现明显的病理变化。此外，通过观察小鼠的外观、体重、粪便和尿液排泄情况，也未观察到明显的毒性反应。[1] λ-卡拉胶是生物医学研究中一种用途广泛的工具。除了用作促炎剂（例如，在啮齿动物后爪水肿模型中）和抗肿瘤剂外，它还可以通过对巨噬细胞的选择性细胞病变作用来抑制免疫反应。它是研究炎症、免疫调节和癌症免疫疗法的标准试剂。

[1]. Antitumor and Adjuvant Activity of λ-carrageenan by Stimulating Immune Response in Cancer Immunotherapy. Sci Rep. 2015;5:11062. Published 2015 Jun 22.

此外，瘤内注射λ-卡拉胶可导致促炎细胞因子IL-17A（图4A）的增加，IL-17A由一类辅助性T细胞（Th17细胞）分泌。大多数Th17细胞能够产生高水平的效应细胞因子，例如TNF-α，并通过诱导促炎免疫效应细胞的募集来促进抗肿瘤免疫反应。这也支持了我们关于瘤内注射λ-卡拉胶可增强肿瘤免疫反应的结论。此外，Mallley等人报道了IL-17A在肺炎球菌疫苗接种过程中的免疫反应中的作用。佐剂诱导的Th17细胞增加可能显著提高疫苗效力。在本研究中，我们也使用λ-卡拉胶作为佐剂用于预防性和治疗性癌症疫苗。在表达卵清蛋白（OVA）的EG7淋巴瘤模型中，λ-卡拉胶可作为OVA疫苗的有效佐剂。此外，λ-卡拉胶还能增强免疫小鼠体内抗OVA抗体的产生。这表明，以λ-卡拉胶作为佐剂免疫的小鼠表现出强烈的体液免疫反应，该反应可能由B淋巴细胞产生的抗体介导。[1] 总之，本文探讨了λ-卡拉胶作为抗肿瘤药物和疫苗佐剂在癌症治疗中的作用。瘤内注射λ-卡拉胶显示出显著的抗肿瘤作用，并显著增强了肿瘤免疫反应，表现为免疫刺激细胞浸润增加和促炎细胞因子产生增加。作为疫苗佐剂，λ-卡拉胶显著提高了预防性和治疗性癌症疫苗的疗效。此外，注射λ-卡拉胶并未对试验小鼠的重要器官造成毒性。因此，我们得出结论，λ-卡拉胶是一种有效的抗肿瘤剂和佐剂，可进一步用于癌症治疗以增强肿瘤免疫反应。[1]

1139.92

9064-57-7

91972149

White to off-white solid powder

-6.1

675.31

5

20

7

35

969

0

S(=O)(=O)([O-])OC1([H])C([H])(C([H])(C([H])(C([H])([H])O[H])OC1([H])OC1([H])C([H])(C([H])([H])OS(=O)(=O)[O-])OC([H])(C([H])(C1([H])O[H])OS(=O)(=O)[O-])O[H])O[H])O[H]

UWPXLSAITSWCRB-UHFFFAOYSA-K

InChI=1S/C12H22O20S3/c13-1-3-5(14)6(15)10(32-35(24,25)26)12(29-3)30-8-4(2-27-33(18,19)20)28-11(17)9(7(8)16)31-34(21,22)23/h3-17H,1-2H2,(H,18,19,20)(H,21,22,23)(H,24,25,26)/p-3

[5-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-2,4-dihydroxy-6-(sulfonatooxymethyl)oxan-3-yl] sulfate

9064-57-7; UWPXLSAITSWCRB-UHFFFAOYSA-K; YC41782;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O: 25 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。