PB succiniMidyl ester (Ocean Blue, SE)   中文名称: 3-羧基-6,8-二氟-7-羟基香豆素

Fluorescent Dye

活细胞成像允许以高时空分辨率对生理过程的亚细胞定位动力学进行体内分析。然而，迄今为止，只有少数荧光染料被定制设计用于促进丝状真菌中物种特异性活细胞成像方法。因此，我们通过对铁载体三乙酰镰刀菌素C（TAFC）进行化学修饰，开发了基于烟曲霉复杂铁获取系统的荧光染料偶联物。各种荧光团（FITC、NBD、PB琥珀酰亚胺酯（海蓝，SE）、BODIPY 630/650、SiR、TAMRA和Cy5）与二乙酰镰刀菌素C（DAFC）结合。镓-68标记能够进行体外和体内表征。对不同曲霉属物种进行了LogD、摄取测定和生长测定，并辅以活细胞成像。铁结合物被TAFC转运蛋白MirB特异性识别，并在生长测定中用作铁源。荧光显微镜揭示了真菌菌丝内所有化合物的吸收动力学和不同的亚细胞积累模式。[Fe]DAFC-NBD和-海洋蓝在液泡中积累，而[Fe]DAQ-BODIPY、-SiR和-Cy5定位于线粒体。[Fe]DAFC-FITC显示出均匀的细胞质分布，而[Fe]DAFC-TAMRA根本没有内化。与市售荧光染料的共染色实验证实了这些发现。总体而言，我们开发了一类新的荧光染料，其细胞内真菌靶向性各不相同，从而为烟曲霉的活细胞成像应用提供了新的工具[1]。

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68Ga铁载体的体外摄取[1]
图2总结了烟曲霉菌丝的吸收试验和竞争研究。值分别归一化为每种镓-68标记的铁载体缀合物的摄取量。在与[Fe]TAFC竞争或在铁充足的培养基中，MirB对DAFC荧光团偶联物的摄取应该减少，这会导致铁载体摄取的转录抑制22。[68Ga]Ga DAFC NBD和-PB琥珀酰亚胺酯（海蓝，SE）就是这种情况，表明MirB依赖性摄取。然而，[68Ga]Ga-DAFC BODIPY、-SiR、-Cy5和-TAMRA的情况并非如此，表明缺乏对菌丝表面的摄取或非特异性结合。此外，在这些阻断实验中，[68Ga]Ga-DAFC-FITC仅显示出细胞积累的轻微减少。

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ΔsidA/ftrAA.fumigatus对铁载体偶联物的利用[1]
利用实验已经表明，[Fe]TAFC（对照）在0.1µM时具有生长诱导作用，在10µM时产生孢子（图3）。[Fe]DAFC-FITC、-PB琥珀酰亚胺酯（海蓝，SE）和-NBD导致相似的生长速率和相应的孢子形成。[Fe]DAFC-BODIPY和-SiR支持1µM的生长，但即使可用性提高到50µM，也不会诱导孢子形成。[Fe]DAFC-Cy5在1μM时促进了一些生长，但在50μM以上导致完全生长停滞，表明存在浓度依赖性抑制作用18。有趣的是，即使在最高可能浓度下，[Fe]DAFC-TAMRA也不支持明显的生长。综上所述，这些数据表明，除[Fe]DAFC-TAMRA外，所有铁载体结合物都可以被烟曲霉有效地用作铁载体
除了[Fe]DAFC-TAMRA在所有测试条件下都保持在体外外，所有荧光偶联物都被烟曲霉芽胞有效内化，并显示出不同的亚细胞定位模式。[Fe]DAFC-BDIPY、-Cy5和-SiR积累到类似真菌线粒体的纵向结构中。[Fe]DAQ-NBD和-PB琥珀酰亚胺酯（海蓝，SE）定位到大的圆形结构中，最有可能是液泡。[Fe]DAFC-FITC均匀分布在细胞质中，但也以环状结构积累。对A.terreus的对照实验证实，有效的吸收需要MirB，因为七种铁载体结合物中有六种没有被该物种的幼苗内化。只有[Fe]DAFC SiR产生微弱的细胞内信号，表明通过未知的被动机制进行非特异性摄取。单独应用荧光染料表明，FITC、海蓝、NBD和TAMRA确实穿透了细胞壁基质，但在观察期间没有进入细胞。相比之下，未结合的BODIPY、SiR和Cy5迅速内化，很可能是通过跨质膜的内吞作用。A.fumigatus和A.terreus之间没有明显的区别。例如，NaN3和[Fe]TAFC阻断了[Fe]DAFC海洋蓝的细胞积累，表明膜转运蛋白（最有可能是MirB）的能量依赖性摄取（图S3）。
使用细胞器特异性荧光染料的共染色来确认内化[Fe]DAFC偶联物的定位。例如，亲脂性质膜标记物FM1-43随着时间的推移被内吞并分布到线粒体和液泡膜中3。丝状真菌的线粒体是纵向细胞器，倾向于在活跃生长的菌丝尖端附近积累，以支持“Spitzenkorper”的高代谢活性3,23。FM1-43共染色证实了[Fe]DAFC-Cy5、-BODIPY和-SiR在线粒体上的疑似定位（图5）。荧光液泡标记DFFDA与[Fe]DAFC-PB琥珀酰亚胺酯（海蓝，SE）的亚细胞定位完全一致，证实了其在液泡中的积累（图5）。

摄取和竞争分析[1]
如前所述进行摄取试验17,18。简而言之，将180μL烟曲霉在贫铁和富铁培养基中分别加入96孔多孔滤膜HTS（1μm玻璃纤维过滤器）中，并在37°C下用PBS或[Fe]TAFC（阻断溶液）预孵育15分钟。随后，在37°C下继续孵育45分钟之前，加入放射性标记的化合物（终浓度约为90 nM）。此后，用冰冷的TRIS缓冲液（15mM TRIS（羟甲基）-氨基甲烷）洗涤菌丝两次，并在γ计数器中测量干燥过滤器。以相同的方式进行竞争试验，除了真菌培养物与铁标记的荧光团偶联物预孵育15分钟，并测定[68Ga]Ga-TAFC在菌丝中的摄取值，以证明与MirB转运蛋白的特异性相互作用。

生长促进试验[1]
如前所述，使用烟曲霉的突变株（ΔsidA/ΔftrA）进行了生长促进试验17,22，该突变株缺乏具有铁载体产生和还原铁同化功能的sidA和ftrA。孢子在24孔平板上进行点接种（104个分生孢子），平板含有0.5 mL曲霉最低培养基琼脂和0.1-50μM的铁载体。将板在37°C的湿度室中孵育48小时，并进行目视评估18。在不补充铁载体的情况下，没有观察到这种突变菌株的生长。

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活细胞成像[1]
荧光显微镜在Leica TCS SP5 II倒置共聚焦激光扫描显微镜上进行，该显微镜配备了8条405至633 nm的激发激光线、一个四通道无滤光片AOBS和三个光电倍增管以及一个Leica HyD探测器。[1]
在μSlide 8井室盖玻片中制备真菌萌发的液体培养物。每个孔在200μL最低培养基中接种5×103个孢子，并在37°C的加湿室中孵育。将A.fumigatus（ATCC 46645）培养14小时，将A.terreus（ATCC 3633）培养48小时，以获得发育良好的芽和年轻菌丝，而没有广泛的细胞融合。对于显微镜观察，使用终浓度为10μM的荧光染料并孵育5-20分钟。对于共染色实验，将FM1-43（10µM）、CFW（10µM）或DFFDA（10μM）与铁载体偶联物同时加入。通过在加入荧光团缀合物之前将阻断物质预孵育15分钟，进行NaN3（终浓度为1 mM）和[Fe]TAFC（终浓度1 mM）的阻断实验。图像采集期间的激发激光强度保持在最低水平，以减少对细胞的光漂白和光毒性作用，同时仍能实现良好的信噪比。表S1中显示了每个共轭物的精确图像采集设置。图像的最大分辨率为1024×1024像素，并保存为PNG格式。Z堆栈采集在图像描述中进行了说明（如适用）。除了使用ImageJ 1.52a开源软件平台进行亮度和对比度调整和裁剪外，图像没有经过进一步的处理。

[1]. Live-cell imaging with Aspergillus fumigatus-specific fluorescent siderophore conjugates. Sci Rep. 2020 Sep 23;10(1):15519.

太平洋蓝琥珀酰亚胺酯是一种N-羟基琥珀酰亚胺酯，由6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-羧酸（太平洋蓝）衍生而来。它是一种荧光染料，激发波长为403 nm，发射波长为455 nm，用作荧光染料。它是一种羟基香豆素、有机氟化合物和N-羟基琥珀酰亚胺酯。其功能与太平洋蓝相关。[68Ga]Ga-DAFC-FITC、-NBD和-PB琥珀酰亚胺酯（海洋蓝，SE）均表现出一定的吸收，且这些吸收可被阻断，并在竞争性实验中导致[68Ga]Ga-TAFC吸收减少。利用实验进一步证实了这些发现，除[Fe]DAFC-TAMRA外，所有化合物均表现出类似的促进生长作用。活细胞成像显示，除[Fe]DAFC-TAMRA外，所有铁载体缀合物均被烟曲霉(A. fumigatus)内化。“单独染料”对照实验表明，Cy5、BODIPY和SiR能够被动进入细胞，这进一步证实了[Fe]DAFC-FITC、-PB琥珀酰亚胺酯（Ocean Blue，SE）和-NBD的内化依赖于主动转运。与缺乏MirB转运蛋白的土曲霉(A. terreus)的直接比较表明，[Fe]DAFC缀合物对烟曲霉具有特异性。除[Fe]DAFC-SiR外，所有其他荧光缀合物均未被土曲霉幼苗检测到。[Fe]DAFC-SiR在缀合态和非缀合态下均表现出普遍的非特异性摄取。在烟曲霉（A. fumigatus）中，不同的铁载体缀合物表现出异质性的亚细胞积累。[Fe]DAFC-BODIPY、-SiR 和 -Cy5 定位于质膜，并且主要分布于线粒体，这已通过 FM1-43 共染色证实。[Fe]DAFC-NBD 和 -PB 琥珀酰亚胺酯（海洋蓝，SE）则完全积累于液泡中，这已通过 DFFDA 共染色证实，而 [Fe]DAFC-FITC 则保留在细胞质中。

C14H7F2NO7

339.204691171646

339.019

215868-33-0

56927770

Typically exists as solid at room temperature

0.935

114.12

1

9

3

24

633

0

FC1C(=C(F)C=C2C=C(C(=O)ON3C(CCC3=O)=O)C(=O)OC=12)O

NZYXABPVYJRICY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H7F2NO7/c15-7-4-5-3-6(13(21)23-12(5)10(16)11(7)20)14(22)24-17-8(18)1-2-9(17)19/h3-4,20H,1-2H2

(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6,8-difluoro-7-hydroxy-2-oxochromene-3-carboxylate

Pacific Blue succinimidyl ester; 215868-33-0; PB succiniMidyl ester; pacific blue N-hydroxysuccinimidyl ester; (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6,8-difluoro-7-hydroxy-2-oxochromene-3-carboxylate; CHEBI:63240; 3-Carboxy-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin succinimidyl ester; 6,8-difluoro-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid succinimidyl ester;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples.

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。