ABC99

IC50: 13 nM (Notum)[1]

ABC99（0.1~10 μM；2 小时；SW620 细胞）以浓度依赖性方式抑制 NOTUM[1]。当 NOTUM 存在时，ABC99 以浓度依赖性方式维持 Wnt-3A 活性[1]。
ABC99抑制NOTUM的IC50值为13 nM（图2B和表1），并在丝氨酸水解酶家族中表现出极好的选择性，初步通过SW620细胞可溶性和膜蛋白质组的凝胶基ABPP进行评估（图2C，D）。这些ABPP实验使用FP-Rh和ABC45探针进行，从而证实PPT1也没有与ABC99交叉反应（图2D）。接下来，我们利用基于定量质谱（MS）的ABPP技术评估了ABC99 （0.5 μM和10 μM）在CM和SW620原位处理细胞中的选择性。这些数据证实了NOTUM的抑制作用（图2E），与MS-ABPP量化的64个额外的丝氨酸水解酶几乎没有交叉反应性（图2E和补充图3和补充数据集1）。观察到ABHD6的部分浓度依赖性阻断，但在ABC99浓度（0.5 μM）完全阻断NOTUM时，该酶只有~ 50%被抑制。我们还注意到，与细胞（补充图3）相比，ABC99更完全地抑制了分泌的NOTUM（图2E），这可能反映了后者含有更大比例的未完全加工的NOTUM。[1]
使用对Wnt激活有反应的荧光素酶报告细胞系（HEK293T-STF） 25，我们发现，将细胞暴露于与ABC99或对照化合物ABC101和产wnt3a的l细胞CM预孵育的表达notum的CM组合中26，会导致在ABC99存在时Wnt信号的浓度依赖性保存，而不是ABC101（图2F）。abc99介导的Wnt3A活性保存的IC50值（图2F和表2）略高于ABPP测量的NOTUM抑制的IC50值（图2B和表1），这可能表明需要抑制超过50%的NOTUM来保护wnt介导的细胞信号。[1]

凝胶基ABPP [1]
体外和原位竞争性凝胶基ABPP的制备方法如上所述。3,6简单地说，在体外（30分钟，37°C）或原位（2小时，37°C）抑制剂或DMSO处理后，细胞裂解物在室温下用1µM fp -罗丹明（FP-Rh）探针处理30分钟。然后用4X SDS上样缓冲液淬灭样品，在10%丙烯酰胺凝胶上用SDS- page分离，并用ChemiDoc MP系统进行凝胶内荧光成像。

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PPT1活性分析[1]
凝胶法测定PPT1抑制作用如前所述。1简单地说，SW620细胞在6cm板中培养至~80%的融合度，然后用抑制剂或DMSO原位处理2小时。然后将细胞刮在冰上，用冷PBS洗涤一次，快速冷冻并保存在-80°C。然后将细胞颗粒在冰上解冻，重新悬浮在冷PBS中，并用探针超声仪裂解。裂解液预清（1,400g, 1 min），上清液超离心（100,000g, 45 min, 4°C）。收集可溶部分，调整样品浓度至2 mg/mL。然后将样品与1µM的PPT1探针ABC45在室温下孵育30分钟，在添加去糖基化酶PNGaseF后，在37℃下再孵育30分钟。rhodamineazide （Rh-N3）荧光基团报告子在先前报道的CuAAC条件下共轭到炔探针上。

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ABC99yne标记[1]
从SW620全细胞裂解液（1mg /mL）或SW620条件培养基（0.1 mg/mL）中提取的蛋白质组用不同浓度的ABC99yne在室温下处理30分钟，然后按上述条件点击荧光团报告罗丹明氮化肼（Rh-N3）进行PPT1活性分析。

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Wnt活性测定[1]
使用HEK293-STF细胞系检测Wnt活性，如前所述12，并进行了一些修改。将SW620细胞以5 × 106的浓度接种于10 cm板上。2天后，收集培养基，用22µm注射器过滤器无菌过滤，立即与抑制剂或DMSO在37°C下孵育1小时，然后与L或L- wnt3a细胞新收集的培养基1:1混合（每10 cm板2 × 106，处理方法与SW620细胞培养基相同）。37℃孵育2小时后，加入HEK293-STF（24小时前96孔板按3 × 104 /孔接种）。用80µL Bright-Glo试剂替换培养基，24小时后测量发光。每种情况下的发光测量一式四份。

Western Blot 分析[1]
细胞类型： SW620 细胞
测试浓度： 0.1~10 μM
孵育时间： 2 小时
实验结果： 以浓度依赖性方式抑制 NOTUM。

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Western Blotting [1]
SDS-PAGE后，将凝胶样品转移到硝化纤维素（50V， 2小时）上，用5%牛奶TBS-T（30分钟，RT）阻断印迹，然后用抗NOTUM抗体在4°C下孵育过夜。然后用TBS-T （3x）洗涤印迹，用二抗（Li-cor IRDye 800CW驴抗兔，1:5000在TBS-T和5%牛奶中）孵育2小时。然后再次冲洗（3次，TBS-T）并在Li-cor Odyssey上成像。

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质谱ABPP样品制备和数据分析[1]
定量质谱分析的样品按先前报道的方法制备和分析，并进行了如下规定的微小修改。8抑制剂和DMSO处理的SW620全细胞裂解物的蛋白质组（每种条件1 mg）或SW620条件培养基（每种条件0.5-0.75 mg）用4µM fp -生物素在室温下处理1小时。然后用氯仿/甲醇沉淀样品，用10 mM中性TCEP还原（30分钟，37℃），用40 mM碘乙酰胺烷基化（30分钟，室温），然后用pbs洗涤的链亲和素琼脂糖珠（100µL浆）富集，室温下端过端旋转1.5小时。然后用0.2% SDS （2 × 10 mL）洗涤样品，转移到Low-bind epppendorf管中，用3 × 1 mL PBS和3 × 1 mL DI H2O洗涤，然后用序列级胰蛋白酶（2µg）在2M尿素中消化过夜。然后使用还原二甲基化标记样品，如前所述。

[1]. Selective Irreversible Inhibitors of the Wnt-Deacylating Enzyme NOTUM Developed by Activity-Based Protein Profiling. ACS Med Chem Lett. 2018;9(6):563-568.

Wnt proteins are secreted morphogens that play critical roles in embryonic development and tissue remodeling in adult organisms. Aberrant Wnt signaling contributes to diseases such as cancer. Wnts are modified by an unusual O-fatty acylation event (O-linked palmitoleoylation of a conserved serine) that is required for binding to Frizzled receptors. O-Palmitoleoylation of Wnts is introduced by the porcupine (PORCN) acyltransferase and removed by the serine hydrolase NOTUM. PORCN inhibitors are under development for oncology, while NOTUM inhibitors have potential for treating degenerative diseases. Here, we describe the use of activity-based protein profiling (ABPP) to discover and advance a class of N-hydroxyhydantoin (NHH) carbamates that potently and selectively inhibit NOTUM. An optimized NHH carbamate inhibitor, ABC99, preserves Wnt-mediated cell signaling in the presence of NOTUM and was also converted into an ABPP probe for visualizing NOTUM in native biological systems. [1]

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Researchers have described, to our knowledge, the first potent and selective irreversible inhibitors of the Wnt-deacylating enzyme NOTUM. The most advanced compound, ABC99, blocks NOTUM activity with low-nanomolar potency (IC50 value = 13 nM) and excellent selectivity as assessed with serine hydrolase-directed ABPP probes and by global proteomic reactivity analysis using a clickable probe analogue (ABC99yne). Over the past decade, many studies have emphasized the important role that NOTUM plays as a negative regulator of Wnt signaling in diverse biological processes, but virtually all of these efforts have relied on molecular biology (e.g., genetic) methods to perturb NOTUM function. We believe that the covalent inhibitors and related chemical probes (inactive control and clickable probes) described herein will provide valuable complementary tools to the limited set of noncovalent inhibitors reported previously to characterize the biological effects of pharmacologically inactivating NOTUM in diverse physiological and disease processes. Future studies of interest include testing the proteome-wide reactivity of ABC99 using the ABC99yne probe combined with MS-based ABPP analysis; directly measuring Wnt palmitoleate modification following exposure of biological systems to ABC99; and assessing the effect of ABC99 on Wnt signaling in vivo. Related to the last objective, we note that NOTUM appears to have a restricted tissue distribution in vivo (http://www.humanproteomemap.org/), which may provide clues as to the specific areas of Wnt biology that are most strongly influenced by NOTUM-mediated deacylation.[1]

C22H21CLN4O5

456.88

456.12

C, 57.84; H, 4.63; Cl, 7.76; N, 12.26; O, 17.51

2331255-53-7

134817170

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

565.9±60.0 °C at 760 mmHg

296.1±32.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.710

2.24

82.6

0

6

4

32

746

0

O=C(N1C2=CC=CC=C2OCC1)ON(C3=O)C(N4C3CN(CC5=CC=C(Cl)C=C5)CC4)=O

OZPZCETZTBBQBO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H21ClN4O5/c23-16-7-5-15(6-8-16)13-24-9-10-25-18(14-24)20(28)27(21(25)29)32-22(30)26-11-12-31-19-4-2-1-3-17(19)26/h1-8,18H,9-14H2

[7-[(4-chlorophenyl)methyl]-1,3-dioxo-5,6,8,8a-tetrahydroimidazo[1,5-a]pyrazin-2-yl] 2,3-dihydro-1,4-benzoxazine-4-carboxylate

abc99; 2331255-53-7; 7-(4-chlorobenzyl)-1,3-dioxohexahydroimidazo[1,5-a]pyrazin-2(3H)-yl2,3-dihydro-4H-benzo[b][1,4]oxazine-4-carboxylate; [7-[(4-chlorophenyl)methyl]-1,3-dioxo-5,6,8,8a-tetrahydroimidazo[1,5-a]pyrazin-2-yl] 2,3-dihydro-1,4-benzoxazine-4-carboxylate; CHEMBL4174188; 7-(4-Chlorobenzyl)-1,3-dioxohexahydroimidazo[1,5-a]pyrazin-2(3H)-yl 2H-benzo[b][1,4]oxazine-4(3H)-carboxylate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 25 mg/mL (54.72 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。