Fmoc-MMAF-OMe

Tubulin; tubulin polymerization; microtubule

子宫内膜癌症细胞对MEDI-547的体外敏感性[1]
接下来，我们测试了MEDI-547对EphA2阳性Hec-1A和Ishikawa细胞体外存活率的影响。在10至50000 ng/mL的剂量范围内测试了MEDI-547的效果。在Hec-1A细胞中，与对照组（1C1或对照组IgG-mcMMAF）相比，MEDI-547以剂量依赖的方式显著抑制了生长（图2A）。石川细胞也观察到了类似的结果（图S1A）。但对EPhA2阴性SPEC-2细胞没有影响（图S2）。鉴于治疗后细胞存活率的降低，我们接下来问这些影响是否本质上是凋亡。与对照组相比，MEDI-547治疗显示Hec-1A（P<0.05，图2B）和Ishikawa（P<0.05，见图S1B）细胞的凋亡显著增加。

MEDI-547治疗子宫内膜癌的体内肿瘤生长抑制[1]
基于观察到的对子宫内膜癌症细胞的细胞毒性和凋亡的影响，我们接下来使用癌症原位小鼠模型进行了几项体内实验，以检查MEDI-547的潜在治疗效果。注射Hec-1A或Ishikawa的小鼠被分配到四组中的一组（每组n=10只小鼠）：1）PBS；2） 1C1，3mg/kg，每周一次；3） 对照组IgG-mcMMAF，3mg/kg，每周一次；或4）MEDI-547，3mg/kg，每周一次。治疗5-6周后，处死小鼠并进行尸检。图4B显示，子宫内膜癌的原发肿瘤确实在子宫腔内发展，并转移到卵巢。与对照组（PBS）、1C1或对照组IgG-mcMMAF相比，延长MEDI-547治疗导致Hec-1A和Ishikawa模型的肿瘤生长显著减少（分别为P<0.01，图3A和B）。我们接下来询问MEDI-547是否在体内具有抗血管生成作用，因为它也识别小鼠EphA2（18）。为了解决这个问题，我们使用了EphA2阴性的SPEC-2细胞（图1A）。已知与正常内皮细胞相比，肿瘤血管系统表达更高的EphA2水平（18）。尽管MEDI-547治疗组的平均肿瘤重量低于其他组，但差异没有达到统计学意义（图3C）。在治疗组中没有观察到明显的毒性迹象（即体重减轻）[1]。

抗体内化[1]
如前所述，在Hec-1A和Ishikawa细胞中用MEDI-547处理后进行抗体内化的程序。简而言之，将活细胞（0.5×106）等分到100μl生长培养基中96孔板的孔中。将细胞在1500 RPM下离心5分钟，通过在含有5μg MEDI-547或对照IgG-mcMMAF的100μl PBS中重新悬浮，用一抗药物偶联物标记，并在4°C下孵育30分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，通过将细胞重新悬浮在100μl生长培养基中，并在37°C/5%CO2下孵育30分钟或在冰上作为阴性对照，使细胞表面结合的一抗药物偶联物内化。内化后，将细胞固定（4%多聚甲醛，室温下20分钟），渗透（0.5%Triton X-100，室温下5分钟）。然后，通过将细胞重新悬浮在100μl PBS+含有1 ug二次抗体的2%FBS中，用二次AlexaFluor 488山羊抗人IgG Ab标记细胞，并在4°C下孵育30分钟。

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细胞毒性试验[1]
如前所述，通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑摄取（MTT）试验测定1C1、对照IgG-mcMMAF和MEDI-547的细胞毒性作用。

The antibody drug conjugate was dosed at weekly 3 mg/kg i.p. injections (14). Therapy experiments were designed using human endometrial cancer cell lines, Hec-1A, Ishikawa, and SPEC-2. Following cell line injection, mice were randomized into four treatment groups: (a) control, 200 μL PBS (i.p., once a week); (b) 1C1, 3 mg/kg in 200 μL PBS (i.p., once a week); (c) control IgG-mcMMAF, 3 mg/kg in 200 μL PBS (i.p., once a week); and (d) MEDI-547, 3 mg/kg in 200 μL PBS (i.p., once a week). Therapy was initiated 2 weeks following cell line injection. Mice were monitored for adverse effects and sacrificed by cervical dislocation 6 to 7 weeks following initiation of treatment.

[1]. EphA2 targeted chemotherapy using an antibody drug conjugate in endometrial carcinoma. Clin Cancer Res. 2010 May 1;16(9):2562-70.

Purpose: EphA2 overexpression is frequently observed in endometrial cancers and is predictive of poor clinical outcome. Here, we use an antibody drug conjugate (MEDI-547) composed of a fully human monoclonal antibody against both human and murine EphA2 (1C1) and the tubulin polymerization inhibitor monomethylauristatin F. Experimental design: EphA2 expression was examined in endometrial cancer cell lines by Western blot. Specificity of MEDI-547 was examined by antibody degradation and internalization assays. Viability and apoptosis were investigated in endometrial cancer cell lines and orthotopic tumor models. Results: EphA2 was expressed in the Hec-1A and Ishikawa cells but was absent in the SPEC-2 cells. Antibody degradation and internalization assays showed that the antibody drug conjugate decreased EphA2 protein levels and was internalized in EphA2-positive cells (Hec-1A and Ishikawa). Moreover, in vitro cytotoxicity and apoptosis assays showed that the antibody drug conjugate decreased viability and increased apoptosis of Hec-1A and Ishikawa cells. In vivo therapy experiments in mouse orthotopic models with this antibody drug conjugate resulted in 86% to 88% growth inhibition (P < 0.001) in the orthotopic Hec-1A and Ishikawa models compared with controls. Moreover, the mice treated with this antibody drug conjugate had a lower incidence of distant metastasis compared with controls. The antitumor effects of the therapy were related to decreased proliferation and increased apoptosis of tumor and associated endothelial cells. Conclusions: The preclinical data for endometrial cancer treatment using MEDI-547 show substantial antitumor activity. [1]

C55H77N5O10

968.23

967.567

863971-38-4

118704820

Light yellow to yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

1029.7±65.0 °C at 760 mmHg

576.5±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.550

9.14

173

2

10

25

70

1700

9

C(C1C2=CC=CC=C2C2C=CC=CC1=2)OC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1C=CC=CC=1)=O

MDJMZQUALDTONI-OVPIWJPHSA-N

InChI=1S/C55H77N5O10/c1-13-35(6)49(45(67-10)31-46(61)60-29-21-28-44(60)50(68-11)36(7)51(62)56-43(54(65)69-12)30-37-22-15-14-16-23-37)58(8)53(64)47(33(2)3)57-52(63)48(34(4)5)59(9)55(66)70-32-42-40-26-19-17-24-38(40)39-25-18-20-27-41(39)42/h14-20,22-27,33-36,42-45,47-50H,13,21,28-32H2,1-12H3,(H,56,62)(H,57,63)/t35-,36+,43-,44-,45+,47-,48-,49-,50+/m0/s1

methyl (2S)-2-[[(2R,3R)-3-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]-methylamino]-3-methoxy-5-methylheptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-3-methoxy-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoate

863971-38-4; L-Phenylalanine, N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-N-methyl-L-valyl-L-valyl-(3R,4S,5S)-3-methoxy-5-methyl-4-(methylamino)heptanoyl-(alphaR,betaR,2S)-beta-methoxy-alpha-methyl-2-pyrrolidinepropanoyl-, methyl ester; Fmoc-MMAF-OMe; methyl (2S)-2-[[(2R,3R)-3-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]-methylamino]-3-methoxy-5-methylheptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-3-methoxy-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoate; (2R,3R)methyl-2-(N-((2S,3R)-3-((9S)-9-((S)-2-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)-3-methylbutanamido)-3-methoxy-5,10-dimethyl-4-(methylamino)-8-oxoundecanoyl)pyrrolidin-2-yl)propionamido)-3-methoxy-2-methyl-3-phenylpropanoate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。