P2Y11 (pEC50 = 6.27)
NF546 hydrate selectively targets and activates the P2Y11 receptor, a GPCR that couples primarily to Gs proteins. Activation of P2Y11 leads to an increase in intracellular cyclic AMP (cAMP) levels via the activation of adenylyl cyclase. It also mobilizes intracellular calcium (Ca2+) via a Gq-mediated pathway. In a comprehensive selectivity screening, NF546 was found to be relatively selective for P2Y11 over the other P2Y receptors (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y12) and P2X receptors (P2X1, P2X2, P2X2-X3). The compound interacts with the same binding site as the non-hydrolyzable ATP analog ATPgammaS, as confirmed by Schild analysis (pA2 of NF340 antagonist was 8.04 against NF546). This demonstrated that NF546 and ATPgammaS are competitive antagonists. The pEC50 for activation is 6.27. NF546 activates P2Y11 in both recombinant systems and in physiologically relevant cells.

与 P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y12、P2X1、P2X2 和 P2X2-X3 相比，NF546(水合物) 对 P2Y11 的选择性更高。在人单核细胞来源的树突状细胞中，NF546(水合物)(100 μM；24 小时) 诱导 TSP-1 释放和抑制 LPS 触发的 IL-12p70 释放的效果相当[1]。\n
\nG 蛋白偶联受体 P2Y(11) 参与免疫系统调节。然而，由于缺乏选择性强且高效的配体，对其进行深入的生理学评估受到阻碍。通过筛选在重组表达于人1321N1星形胶质细胞中的P2Y(11)受体上的磺酸和膦酸衍生物库（钙和cAMP测定），鉴定出选择性非核苷酸类P2Y(11)激动剂NF546[4,4'-(羰基双(亚氨基-3,1-亚苯基-羰基亚氨基-3,1-(4-甲基亚苯基)羰基亚氨基))-双(1,3-二甲苯-α,α'-二膦酸)四钠盐]。NF546的pEC(50)为6.27，并且对P2Y(11)的选择性高于P2Y(1)、P2Y(2)、P2Y(4)、P2Y(6)、P2Y(12)、P2X(1)、P2X(2)和P2X(2)-X(3)。腺苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸 (ATPγS) 是生理性 P2Y(11) 激动剂 ATP 的非水解类似物，分子建模研究表明，ATPγS 与 NF546 使用共同的结合位点，并且 Schild 分析显示，它们对纳摩尔级效价拮抗剂 NF340 [4,4'-(羰基双(亚氨基-3,1-(4-甲基亚苯基)羰基亚氨基))双(萘-2,6-二磺酸)四钠盐] 具有竞争性拮抗作用。NF340 对 ATPγS 的 pA(2) 值为 8.02，对 NF546 的 pA(2) 值为 8.04（钙离子测定）。此外，还测试了 NF546 在单核细胞来源的树突状细胞中 P2Y(11) 介导的作用。与ATPγS类似，NF546可促进血小板反应蛋白-1的分泌并抑制脂多糖刺激的白细胞介素-12释放，而NF340则抑制这些作用。此外，我们首次发现ATPγS或NF546刺激可促进树突状细胞释放白细胞介素-8（IL-8），而NF340可抑制这一过程。总之，我们描述了首个选择性非核苷酸类P2Y11受体激动剂NF546，该激动剂在重组和生理表达系统中均有效，并证实其可刺激P2Y11受体释放IL-8，进一步支持了P2Y11受体的免疫调节作用[1]。

---

\n\n在本研究中，我们探讨了P2Y11R信号通路在血管功能障碍中的作用。使用药理学激动剂NF546和拮抗剂NF340调节P2Y11R活性。将大鼠主动脉环暴露于血管紧张素II (AngII) 中，并评估其血管舒缩反应。P2Y11R激动剂NF546通过增加一氧化氮 (NO) 的生物利用度并减少AngII诱导的H2O2释放，促进内皮细胞依赖性血管舒张，从而减轻AngII诱导的血管功能障碍；而P2Y11R拮抗剂NF340则阻断了这些作用。在体外，对人血管平滑肌细胞 (SMC) 和内皮细胞 (EC) 进行AngII或缺氧/复氧 (H/R) 模拟。P2Y11R激动剂调节人EC中的血管活性因子，即内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 和内皮素-1，减少SMC增殖并阻止其向合成表型转变。缺血/再灌注 (H/R) 和血管紧张素II (AngII) 可增加内皮细胞 (EC) 分泌组诱导的平滑肌细胞 (SMC) 增殖，而 P2Y11R 激活可阻止这种效应。因此，我们的数据表明，P2Y11R 激活可能保护血管免受 H/R/AngII 诱导的损伤，并减少血管功能障碍。这些结果为新的血管保护干预措施开辟了道路。[2]

---

\n\n在此，研究人员发现，在动脉肌细胞中，A 激酶锚定蛋白 5 (AKAP5) 功能的破坏会阻断葡萄糖升高和选择性 P2Y11 激动剂 NF546 诱导的 cAMP 合成。在 AKAP5 敲除的动脉肌细胞/动脉中，葡萄糖和 NF546 诱导的 L 型 Ca2+ 通道增强、血管收缩和血流量减少均被阻止。这些反应的起始是通过AKAP5依赖性的P2Y11/P2Y11样受体、AC5、PKA和CaV1.2在人和小鼠动脉肌细胞质膜上聚集形成纳米复合物。因此，数据揭示了一个AKAP5信号模块，该模块在高血糖条件下调节L型Ca2+通道活性和血管反应性。这种AKAP5锚定的纳米复合物可能导致糖尿病高血糖期间的血管并发症[3]。

---

体外研究已阐明了NF546水合物的药理活性。在重组表达P2Y11受体的1321N1人星形胶质细胞中，NF546可刺激GTPγS结合，增加细胞内钙离子浓度和cAMP浓度。这些功能反应的pEC50值为6.27。NF546对P2Y11受体具有选择性，而对其他P2受体则无选择性。在人单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）中，NF546（100 uM；24小时）与ATPγS在诱导血小板反应蛋白-1（TSP-1）分泌和抑制脂多糖（LPS）诱导的IL-12p70释放方面具有相同的效力。此外，NF546还能促进moDCs释放白细胞介素-8（IL-8），IL-8是一种参与中性粒细胞募集的关键趋化因子。选择性 P2Y11 拮抗剂 NF340 可以阻断这些效应，证实这些效应是由 P2Y11 介导的。

搜索结果中没有关于NF546水合物的具体体内数据。然而，可以使用原代人细胞或在表达人P2Y11受体的动物模型中（因为啮齿动物的P2Y11受体并非直系同源物）进行体外研究。该化合物主要用作研究工具，用于了解P2Y11信号通路在免疫细胞功能中的作用，而非用于治疗。将NF546与拮抗剂NF340联合使用的研究有助于解析P2Y11激活对树突状细胞成熟、细胞因子分泌（IL-12、IL-8、TSP-1）和T细胞极化的具体贡献。该化合物分子量大且极性强，表明其不太可能穿过细胞膜或血脑屏障，因此其应用仅限于体外或离体研究。它是一种非核苷酸激动剂，pEC50值为6.27。 NF546 可刺激单核细胞衍生树突状细胞 (moDC) 释放 IL-8。它是研究 P2Y11 生物学的重要工具，而 P2Y11 参与免疫调节。

ROS 测定 [2]
使用 PeroxiDetect 试剂盒，按照制造商说明，通过亚铁二甲酚橙氧化 (FOX) 法评估主动脉环释放的 H2O2。在有或无 AngII 的情况下进行 30 分钟的孵育。两组同时分别与 NF546、NF340 或两者一起孵育。

---

无细胞GTPγS结合试验可用于检测P2Y11的激活。本试验使用表达重组P2Y11的1321N1人星形胶质细胞的膜制备物。试验缓冲液包含50 mM HEPES（pH 7.4）、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.5% BSA和10 uM GDP。将10 ug膜蛋白加入96孔板的每个孔中。向孔中加入NF546水合物（0.001-100 uM），随后加入0.1 nM [3⁵S]GTPγS。将孔板在30℃下孵育60分钟。反应通过GF/B滤膜快速过滤终止，随后用冰冷的缓冲液洗涤。将滤膜干燥后，使用液体闪烁计数器或TopCount计数结合的放射性。pEC50 (6.27) 定义为引起[3⁵S]GTPγS结合最大刺激50%的NF546浓度。在10 uM未标记的GTPγS存在下测定非特异性结合。计算相对于基础水平的刺激倍数。

细胞培养和试剂 [2]
人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和人冠状动脉平滑肌细胞 (HCASMC) 及其相应的培养基（内皮细胞生长培养基 2 和平滑肌细胞生长培养基 2）均购自 Promocell 公司，并按照制造商的说明进行培养。实验中使用的是传代 3 至 6 代的细胞。
在缺氧/复氧 (H/R) 实验中，HUVEC 和 HCASMC 在缺氧箱中接受 5 小时的缺氧处理（1% O2，5% CO2，含 CaMg 的 DPBS）。DPBS 在实验前过夜平衡。根据实验和细胞类型，使用不同时间的复氧处理（DMEM/F12，5% CO2，21% O2）。缺氧和复氧时间的设定基于我们课题组之前的研究结果。所有调节剂均在复氧开始时加入。同时，通过 AngII (100 nM) 诱导应激环境模拟。使用 P2Y11R 激动剂 NF546 (10 µM) 和拮抗剂 NF340 (10 µM) 对其进行调节；最大浓度效应的选择依据 Meis 等人 [2] 的研究。

---

钙动员实验在96孔黑色壁透明底板中进行。将表达P2Y11的1321N1细胞以每孔30,000个细胞的密度接种，并使其贴壁24小时。然后，将细胞置于含有2 uM Fluo-4 AM和0.02% Pluronic F-127的Hanks平衡盐溶液（HBSS，含钙镁离子）中，于37℃孵育60分钟，随后进行30分钟的脱酯化处理。之后，将孔板置于荧光酶标仪（例如FlexStation 3）中。首先测量20秒的基线荧光强度（激发波长494 nm，发射波长516 nm）。随后，仪器自动加入不同浓度的NF546水合物（0.1 nM至100 uM），并继续监测120秒的荧光强度。计算高于基线的荧光峰值增幅，并以阳性对照（例如，10 uM ATP）进行标准化。钙动员的 EC50 值由浓度-反应曲线确定。钙的 pEC50 值也约为 6.27。该检测证实了 P2Y11 受体的功能性激动作用。

血管功能分析[2]
将大鼠主动脉环固定在器官浴槽内的等长力传感器（Myograph DMT 620M）上。该浴槽内含有5 mL Krebs溶液，该溶液在37 °C下用氧气平衡30分钟，并加入10 µM双氯芬酸以阻断前列腺素的生成，此时主要血管舒张剂为NO。随后，将主动脉环拉伸至2 g张力（等长张力）并达到平衡。使用80 mM KCl溶液评估其最大收缩水平。洗涤和平衡后，将主动脉环暴露于血管紧张素II（AngII）（100 nM）或溶剂（对照组）中30分钟。对照组和AngII处理组均同时孵育，分别加入或不加入NF546（10 µM）、NF340（10 µM）或二者联用。NF546和NF340分别是P2Y11R的特异性激动剂和拮抗剂。采用去氧肾上腺素评估收缩反应，并调整去氧肾上腺素剂量，使收缩反应达到KCl诱导收缩反应的80%。采用累积剂量乙酰胆碱评估舒张反应。

---

一种常用的体外实验方案使用人单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）。首先，通过Ficoll-Paque密度梯度离心法从人外周血白细胞层中分离外周血单核细胞（PBMCs）。然后，利用磁珠阳性选择法（MACS）从PBMCs中分离CD14+单核细胞。将单核细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、50 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和20 ng/mL白细胞介素-4（IL-4）的RPMI-1640培养基中培养6-7天，以生成未成熟的moDCs。第6天，收集未成熟的moDCs，并以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中。最后，用NF546水合物（100 μM）处理细胞24小时。为抑制该反应，部分孔在加入 NF546 前，先用 P2Y11 拮抗剂 NF340 (10 μM) 预孵育 30 分钟。24 小时后，收集细胞培养上清液，并根据制造商的说明，使用人细胞因子 ELISA 试剂盒检测 IL-8、IL-12p70 和 TSP-1 的水平。细胞沉淀可用于 RNA 提取和 qRT-PCR，以检测基因表达的变化。该体外实验方案证明了 P2Y11 激活在人树突状细胞中的免疫调节作用。

该化合物以水合物形式供应，水合物是一种稳定的晶体形式。它具有较大的高极性分子结构（分子量约为1424.01）。四钠盐形式使其极易溶于水，也溶于二甲基亚砜（DMSO）。该化合物应以冻干粉末形式储存于-20℃避光保存，在此条件下可稳定保存长达3年。溶液储存时，应在-80℃下保存长达6个月。由于其高极性，预计其口服生物利用度低，且难以有效穿过细胞膜；其作用主要在无细胞或全细胞系统中进行研究，在这些系统中，它可以作用于细胞外受体。

[1]. NF546 [4,4'-(carbonylbis(imino-3,1-phenylene-carbonylimino-3,1-(4-methyl-phenylene)-carbonylimino))-bis(1,3-xylene-alpha,alpha'-diphosphonic acid) tetrasodium salt] is a non-nucleotide P2Y11 agonist and stimulates release of interleukin-8 from human monocyte-derived dendritic cells. J Pharmacol Exp Ther. 2010 Jan;332(1):238-47.

[2]. P2Y11 Agonism Prevents Hypoxia/Reoxygenation- and Angiotensin II-Induced Vascular Dysfunction and Intimal Hyperplasia Development. Int J Mol Sci. 2021 Jan 16;22(2):855.

[3]. AKAP5 complex facilitates purinergic modulation of vascular L-type Ca2+ channel CaV1.2. Nat Commun. 2020 Oct 20;11(1):5303.

L型钙通道CaV1.2对动脉肌细胞的兴奋性、基因表达和收缩至关重要。细胞外葡萄糖水平升高（高血糖）可通过蛋白激酶A（PKA）增强血管L型钙通道的活性，但其潜在机制尚不清楚。本研究发现，动脉肌细胞中A激酶锚定蛋白5（AKAP5）功能受损可阻断选择性P2Y11受体激动剂NF546诱导的葡萄糖水平升高和cAMP合成。在AKAP5敲除的动脉肌细胞/动脉中，葡萄糖和NF546诱导的L型钙通道活性增强、血管收缩和血流量减少均受到抑制。这些反应依赖于AKAP5依赖的P2Y11/P2Y11样受体、AC5、PKA和CaV1.2在人和小鼠动脉肌细胞质膜上的聚集，形成纳米复合物。因此，数据揭示了一个AKAP5信号模块，该模块在血糖升高的情况下调节L型Ca2+通道活性和血管反应性。这种AKAP5锚定的纳米复合物可能导致糖尿病高血糖期间的血管并发症。[3]心血管疾病中的血管功能障碍包括血管舒缩反应受损、内皮细胞（EC）活化以及平滑肌细胞（SMC）增殖和迁移至内膜。这会导致内膜增生和血管衰竭。我们之前报道过，人树突状细胞、心肌细胞和心肌细胞中P2Y11受体（P2Y11R）的激活可以保护细胞免受缺氧/复氧（HR）损伤。本研究探讨了P2Y11R信号通路在血管功能障碍中的作用。我们使用P2Y11R激动剂NF546和拮抗剂NF340来调节P2Y11R的活性。在大鼠主动脉环暴露于血管紧张素II（AngII）后，我们评估了血管舒缩反应。P2Y11R激动剂NF546通过增加一氧化氮（NO）的生物利用度并减少AngII诱导的H₂O₂释放，促进内皮细胞（EC）依赖性血管舒张，从而减轻AngII诱导的血管功能障碍；相反，P2Y11R拮抗剂NF340则阻断了这些作用。在体外实验中，我们用AngII或缺氧/复氧（H/R）刺激人血管平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞（EC）。 P2Y11R激动剂可调节人内皮细胞（ECs）中的血管活性因子，即内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和内皮素-1，从而减少平滑肌细胞（SMC）增殖并阻止其向合成表型转化。缺血/再灌注（H/R）和血管紧张素II（AngII）均可增加内皮细胞分泌诱导的SMC增殖，而P2Y11R激活可阻断这种效应。因此，我们的数据表明，P2Y11R激活可能保护血管免受H/R/AngII诱导的损伤并减少血管功能障碍。这些结果为新型血管保护干预措施的开发铺平了道路。[2]

---

本产品仅供研究使用，不可用于人体治疗。目前尚无该化合物的具体毒性数据。请遵循标准安全预防措施。该化合物是一种高选择性的P2Y11激动剂。pEC50：6.27。该化合物对P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y12、P2X1、P2X2和P2X2-X3受体具有选择性。它能刺激IL-8和TSP-1的表达，并抑制IL-12p70的表达。该化合物为非核苷酸类化合物。它是研究P2Y11信号通路的重要工具。

C47H44N6NA4O17P4.13.5H2O

1424.01

907547-55-1 (free acid); 1006028-37-0 (sodium)

White to yellow solid powder

399

GSMUPMANKNAMAS-UHFFFAOYSA-J

InChI=1S/C47H48N6O17P4.4Na/c1-27-9-13-33(45(56)50-39-15-11-29(23-71(59,60)61)17-35(39)25-73(65,66)67)21-41(27)52-43(54)31-5-3-7-37(19-31)48-47(58)49-38-8-4-6-32(20-38)44(55)53-42-22-34(14-10-28(42)2)46(57)51-40-16-12-30(24-72(62,63)64)18-36(40)26-74(68,69)70;;;;/h3-22H,23-26H2,1-2H3,(H,50,56)(H,51,57)(H,52,54)(H,53,55)(H2,48,49,58)(H2,59,60,61)(H2,62,63,64)(H2,65,66,67)(H2,68,69,70);;;;/q;4*+1/p-4

tetrasodium;[2-[[3-[[3-[[3-[[5-[[2,4-bis[[hydroxy(oxido)phosphoryl]methyl]phenyl]carbamoyl]-2-methylphenyl]carbamoyl]phenyl]carbamoylamino]benzoyl]amino]-4-methylbenzoyl]amino]-5-[[hydroxy(oxido)phosphoryl]methyl]phenyl]methyl-hydroxyphosphinate hydrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。