P2Y11 (pEC50 = 6.27)

NF546（水合物）对 P2Y11 的选择性比 P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y12、P2X1、P2X2 和 P2X2-X3 更高。在人单核细胞衍生的树突状细胞中，NF546（水合物）（100 μM；24 小时）在诱导 TSP-1 释放和防止 LPS 触发的 IL-12p70 释放方面同样有效[1]。
G蛋白偶联的P2Y（11）受体参与免疫系统调节。然而，缺乏选择性和有效的配体阻碍了深入的生理评估。通过筛选在人1321N1星形细胞瘤细胞中重组表达的P2Y（11）受体上的磺酸和膦酸衍生物库（钙和cAMP测定），鉴定出选择性非核苷酸P2Y（1）激动剂NF546[4,4'-（羰基双（亚氨基-3,1-亚苯基羰基氨基-3,1-（4-甲基亚苯基）羰基氨基））-双（1,3-二甲苯-α，α'-二膦酸）四钠盐]。NF546的pEC（50）为6.27，对P2Y（11）的选择性相对高于P2Y（1）、P2Y（2）、P2X（2）和P2X（2-X）-X（3）。在Schild分析中，腺苷-5'-O-（3-硫代）三磷酸（ATPgammaS）是生理P2Y（11）激动剂ATP的不可水解类似物，NF546和NF546使用一个共同的结合位点，这是分子建模研究及其对纳摩尔效力拮抗剂NF340[4,4'-（羰基双（亚氨基-3,1-（4-甲基-苯撑）羰基氨基））双（萘-2,6-二磺酸）四钠盐]的竞争行为所表明的。NF340的pA（2）对ATPgammaS为8.02，对NF546为8.04（钙测定）。NF546在单核细胞衍生的树突状细胞中进一步测试了P2Y（11）介导的作用。与ATPgammaS类似，NF546导致凝血酶敏感蛋白-1的分泌和脂多糖刺激的白细胞介素-12释放的抑制，而NF340抑制了这些作用。此外，首次表明ATPgammaS或NF546刺激可促进树突状细胞释放白细胞介素8（IL-8），而NF340可以抑制这种释放。总之，我们已经描述了重组和生理表达系统中P2Y（11）受体的第一种选择性非核苷酸激动剂NF546，并且可以显示P2Y（1）刺激的IL-8释放，进一步支持P2Y（12）受体的免疫调节作用[1]

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在这项研究中，我们研究了P2Y11R信号在血管功能障碍中的作用。使用其药理学激动剂NF546和拮抗剂NF340调节P2Y11R活性。将大鼠主动脉环暴露于血管紧张素II（AngII），并评估其血管舒缩反应。P2Y11R激动剂NF546通过提高一氧化氮（NO）的生物利用度和减少AngII诱导的H2O2释放，促进EC依赖性血管舒张，从而减少AngII引起的血管功能障碍；这些作用通过使用P2Y11R拮抗剂NF340而被阻止。人血管平滑肌细胞和内皮细胞在体外接受AngII或H/R模拟。P2Y11R激动剂调节人内皮细胞中的血管活性因子，即内皮一氧化氮合酶（eNOS）和内皮素-1，减少SMC增殖并阻止向合成表型的转变。H/R和AngII增加了EC分泌组诱导的SMC增殖，这一作用被P2Y11R激活所阻止。因此，我们的数据表明，P2Y11R的激活可能保护血管免受HR-/AngII诱导的损伤，并减少血管功能障碍。这些结果为新的血管保护干预措施开辟了道路。[2]

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在这里，研究人员发现，动脉肌细胞中A激酶锚定蛋白5（AKAP5）功能的破坏阻断了cAMP合成对葡萄糖升高和选择性P2Y11激动剂NF546的反应。葡萄糖和NF546诱导的L型Ca2+通道增强、血管收缩和血流减少在AKAP5缺失的动脉肌细胞/动脉中得到了预防。这些反应是通过AKAP5依赖性的P2Y11/P2Y11样受体、AC5、PKA和CaV1.2在人和小鼠动脉肌细胞质膜上聚集成纳米复合物而形成的。因此，数据揭示了一个AKAP5信号模块，该模块在葡萄糖升高时调节L型Ca2+通道活性和血管反应性。这种AKAP5锚定的纳米复合物可能会导致糖尿病高血糖期间的血管并发症[3]。

ROS测量[2]
根据制造商的说明，使用PeroxiDetect试剂盒通过亚铁二甲酚橙氧化（FOX）试验评估主动脉环释放的H2O2。在AngII存在或不存在的情况下进行30分钟的孵育。两组还同时与NF546、NF340或两者一起孵育。

细胞培养和试剂[2]
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）及其相应的培养基（内皮细胞生长培养基2和平滑肌细胞生长培养基2）购自Promocell，并按照制造商的说明进行培养。将第3代至第6代的细胞用于实验程序。
对于H/R实验，HUVEC和HCASMC在缺氧室 中接受5小时的缺氧（1%O2，5%CO2，DPBS和CaMg）。DPBS在实验前过夜平衡。根据实验和细胞类型，使用了几个复氧持续时间（DMEM/F12，5%CO2，21%O2）。缺氧和复氧持续时间基于我们小组之前的观察。所有调节剂均在复氧开始时加入。
同时，AngII（100nM）诱导了应激环境的模拟。用其激动剂NF546>（10µM）和拮抗剂NF340（10µM）对P2Y11R进行调节；根据Meis等人选择最大浓度效应。

血管功能分析[2]
将大鼠主动脉环固定在器官浴槽内的等长力传感器（Myograph DMT 620M）上。该浴槽内含有5 mL Krebs溶液，该溶液在37 °C下用氧气平衡30分钟，并加入10 µM双氯芬酸以阻断前列腺素的生成，此时主要血管舒张剂为NO。随后，将主动脉环拉伸至2 g张力（等长张力）并达到平衡。使用80 mM KCl溶液评估其最大收缩水平。洗涤和平衡后，将主动脉环暴露于血管紧张素II（AngII）（100 nM）或溶剂（对照组）中30分钟。对照组和AngII处理组均同时孵育，分别加入或不加入NF546（10 µM）、NF340（10 µM）或二者联用。NF546和NF340分别是P2Y11R的特异性激动剂和拮抗剂。采用去氧肾上腺素评估收缩反应，并调整去氧肾上腺素剂量，使收缩反应达到KCl诱导收缩反应的80%。采用累积剂量乙酰胆碱评估舒张反应。

[1]. NF546 [4,4'-(carbonylbis(imino-3,1-phenylene-carbonylimino-3,1-(4-methyl-phenylene)-carbonylimino))-bis(1,3-xylene-alpha,alpha'-diphosphonic acid) tetrasodium salt] is a non-nucleotide P2Y11 agonist and stimulates release of interleukin-8 from human monocyte-derived dendritic cells. J Pharmacol Exp Ther. 2010 Jan;332(1):238-47.

[2]. P2Y11 Agonism Prevents Hypoxia/Reoxygenation- and Angiotensin II-Induced Vascular Dysfunction and Intimal Hyperplasia Development. Int J Mol Sci. 2021 Jan 16;22(2):855.

[3]. AKAP5 complex facilitates purinergic modulation of vascular L-type Ca2+ channel CaV1.2. Nat Commun. 2020 Oct 20;11(1):5303.

L型钙离子通道CaV1.2对动脉肌细胞的兴奋性、基因表达和收缩至关重要。细胞外葡萄糖水平升高（高血糖）可通过蛋白激酶A (PKA) 增强血管L型钙离子通道的活性，但其潜在机制尚不清楚。本研究发现，在动脉肌细胞中，A激酶锚定蛋白5 (AKAP5) 的功能受损会阻断葡萄糖水平升高和选择性P2Y11受体激动剂NF546诱导的cAMP合成。在AKAP5敲除的动脉肌细胞/动脉中，葡萄糖和NF546诱导的L型钙离子通道活性增强、血管收缩和血流量减少均被抑制。这些反应的发生依赖于AKAP5依赖性的P2Y11/P2Y11样受体、AC5、PKA和CaV1.2在人和小鼠动脉肌细胞质膜上聚集形成纳米复合物。因此，数据揭示了一个AKAP5信号模块，该模块在高血糖条件下调节L型Ca2+通道活性和血管反应性。这种AKAP5锚定的纳米复合物可能导致糖尿病高血糖期间的血管并发症。[3]

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心血管疾病中的血管功能障碍包括血管舒缩反应受损、内皮细胞（ECs）活化以及平滑肌细胞（SMCs）增殖和向内膜迁移。这会导致内膜增生和血管衰竭。我们之前报道过，激活人树突状细胞、心肌成纤维细胞和心肌细胞中的P2Y11受体（P2Y11R）可保护细胞免受缺氧/复氧（HR）损伤。在本研究中，我们探讨了P2Y11R信号在血管功能障碍中的作用。我们使用其药理学激动剂NF546和拮抗剂NF340来调节P2Y11R活性。将大鼠主动脉环暴露于血管紧张素II (AngII) 后，评估其血管舒缩反应。P2Y11R激动剂NF546通过增加一氧化氮(NO)生物利用度并减少AngII诱导的H2O2释放，促进内皮细胞(EC)依赖性血管舒张，从而减轻AngII诱导的血管功能障碍；而P2Y11R拮抗剂NF340则阻断了这些作用。体外实验中，将人血管平滑肌细胞(SMC)和内皮细胞(EC)暴露于AngII或缺氧/复氧(H/R)刺激下。P2Y11R激动剂调节人EC中的血管活性因子，即内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和内皮素-1，减少SMC增殖并阻止其向合成表型转变。H/R和AngII均能增加EC分泌组诱导的SMC增殖，而P2Y11R激活可阻断这种作用。因此，我们的数据表明，P2Y11R 激活可能保护血管免受 HR/AngII 诱导的损伤，并减少血管功能障碍。这些结果为新的血管保护干预措施开辟了道路。[2]

C47H44N6NA4O17P4.13.5H2O

1424.01

907547-55-1 (free acid); 1006028-37-0 (sodium)

White to yellow solid powder

399

GSMUPMANKNAMAS-UHFFFAOYSA-J

InChI=1S/C47H48N6O17P4.4Na/c1-27-9-13-33(45(56)50-39-15-11-29(23-71(59,60)61)17-35(39)25-73(65,66)67)21-41(27)52-43(54)31-5-3-7-37(19-31)48-47(58)49-38-8-4-6-32(20-38)44(55)53-42-22-34(14-10-28(42)2)46(57)51-40-16-12-30(24-72(62,63)64)18-36(40)26-74(68,69)70;;;;/h3-22H,23-26H2,1-2H3,(H,50,56)(H,51,57)(H,52,54)(H,53,55)(H2,48,49,58)(H2,59,60,61)(H2,62,63,64)(H2,65,66,67)(H2,68,69,70);;;;/q;4*+1/p-4

tetrasodium;[2-[[3-[[3-[[3-[[5-[[2,4-bis[[hydroxy(oxido)phosphoryl]methyl]phenyl]carbamoyl]-2-methylphenyl]carbamoyl]phenyl]carbamoylamino]benzoyl]amino]-4-methylbenzoyl]amino]-5-[[hydroxy(oxido)phosphoryl]methyl]phenyl]methyl-hydroxyphosphinate hydrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。