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| 1mg |
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| 5mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
EC50: 15 μM (SARS-CoV-2 Mpro)[1]
SARS-CoV-2 main protease (Mpro, 3CLpro). GRL-1720 is a small-molecule, irreversible covalent inhibitor of the SARS-CoV-2 main protease (Mpro). Mpro is a cysteine protease essential for viral replication, responsible for cleaving the viral polyproteins (pp1a and pp1ab) at 11 specific sites to generate functional non-structural proteins (NSPs). GRL-1720 contains an indoline moiety that, upon binding to the active site of Mpro, forms a covalent bond with the catalytic cysteine residue (Cys145). This irreversible interaction permanently inactivates the protease, preventing proteolytic processing of the viral polyprotein, thereby blocking viral replication. GRL-1720 was developed based on an indoline scaffold and shows antiviral activity against SARS-CoV-2 in vitro. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外实验表明，GRL-1720 TFA 能抑制 SARS-CoV-2 主蛋白酶 (Mpro)，其 EC50 值为 15 uM，该值是通过检测感染细胞中 SARS-CoV-2 诱导的细胞病变效应 (CPE) 的抗病毒试验确定的。该化合物在针对重组 SARS-CoV-2 Mpro 的酶活性测定中也表现出抑制活性，其 IC50 值在低微摩尔范围内。GRL-1720 TFA 对用 SARS-CoV-2 (100 uM 病毒) 培养的 VeroE6 细胞具有保护作用。在这些基于细胞的实验中，用 1、10 和 100 uM 的 GRL-1720 处理 3 天可降低病毒诱导的细胞死亡和病毒 RNA 水平。该化合物是一种不可逆的共价抑制剂，这意味着它与 Mpro 活性位点中的半胱氨酸残基形成稳定的永久性键，从而导致酶的完全且持久的失活。由于 Mpro 活性位点的高度保守性，GRL-1720 也对其他冠状病毒（包括 SARS-CoV-1）表现出活性。
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| 体内研究 (In Vivo) |
目前尚无GRL-1720 TFA的具体体内数据。作为SARS-CoV-2 Mpro的共价抑制剂，GRL-1720具有潜在的体内抗病毒功效，但已发表的动物研究有限。该化合物溶解性良好，可用于体内给药。在假设的小鼠适应性SARS-CoV-2感染模型（例如，使用hACE2转基因小鼠或小鼠适应性病毒）中，GRL-1720可能以10-50 mg/kg的剂量，每日两次，连续5天，通过腹腔注射或静脉注射给药，以评估病毒载量降低、体重减轻预防和生存率。然而，目前尚无此类研究公开发表。母体化合物或类似的吲哚/吲哚啉类蛋白酶抑制剂已在小鼠模型中显示出体内疗效。GRL-1720目前仅作为体外研究工具；其体内应用仍需进一步验证。
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| 酶活实验 |
对于 GRL-1720 TFA 与 SARS-CoV-2 Mpro 的直接结合和抑制试验，基于荧光共振能量转移 (FRET) 的蛋白酶活性测定是标准方法。重组 SARS-CoV-2 主蛋白酶 (Mpro) 经表达和纯化。测定缓冲液为：20 mM Tris-HCl (pH 7.3)、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT 和 0.1% BSA。使用 FRET 肽底物（例如，Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans 或 MCA-AVLQSGFR-K(Dnp)-RR-NH2）。GRL-1720 TFA 溶于 DMSO 中配制成储备液。在96孔黑色板中，将不同浓度的GRL-1720 TFA（0.01-1000 uM）与重组Mpro（0.1-1 uM）在检测缓冲液中于室温或37℃预孵育10-30分钟，以促进共价结合。加入FRET肽底物（终浓度10-50 uM）启动反应。使用荧光酶标仪（例如Tecan、Biotek）在37℃下连续测量30-60分钟的荧光强度（激发波长340 nm，发射波长490 nm）。初始反应速率（V0）由荧光曲线的线性部分确定。抑制率以DMSO对照组（无抑制剂）为基准计算。IC50值通过使用GraphPad Prism软件将剂量反应曲线拟合到四参数逻辑方程来计算。由于 GRL-1720 是一种不可逆共价抑制剂，其 IC50 值取决于预孵育时间；预孵育时间越长，IC50 值越低。为了测定结合动力学，可以在不同的预孵育时间下测量酶活性，以计算失活速率 (kinact) 和使失活速率达到半数最大值时的抑制剂浓度 (KI)。该化合物也可用于时间依赖性抑制试验。对于放射性测定，可以使用 3H 标记的 GRL-1720 来确定共价结合的化学计量比。
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| 细胞实验 |
对于基于细胞的抗病毒检测，将 VeroE6 或 Vero E6/TMPRSS2 细胞以 1-2 × 10^4 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，培养基为添加了 2% FBS 和抗生素的 DMEM，并在 37℃、5% CO2 条件下培养过夜。第二天，在无血清培养基中，以 0.01-0.1 的感染复数 (MOI) 用 SARS-CoV-2 病毒（例如 WK-521 株或分离株）感染细胞，并在 37℃ 下孵育 1-2 小时。感染后，移除培养基，并加入含有 GRL-1720 TFA 系列稀释液（0.01-1000 uM，最终 DMSO 浓度 ≤0.1%）的新鲜培养基。实验设置未感染细胞对照和病毒感染的载体（0.1% DMSO）对照。细胞在37℃、5% CO2条件下培养48-72小时。采用比色法（例如CCK-8、MTT或刃天青法）检测细胞病变效应（CPE）来评估抗病毒活性。CCK-8检测中，向每个孔中加入10 uL CCK-8溶液，在37℃下孵育1-4小时，并在450 nm处测定吸光度。EC50定义为抑制50%病毒诱导的CPE的化合物浓度。或者，也可以通过实时定量RT-PCR（qRT-PCR）定量病毒RNA：感染和处理48小时后，收集上清液，提取病毒RNA，并使用SARS-CoV-2 N基因引物进行RT-qPCR。计算病毒复制抑制率。在用 GRL-1720 处理的未感染细胞中平行测定细胞活力，以评估其细胞毒性。计算 CC50（50% 细胞毒性浓度），选择性指数 (SI) 计算为 CC50/EC50。对于中性红摄取实验，将细胞与中性红 (50 ug/mL) 孵育 2-3 小时，然后洗涤，并用 50% 乙醇/1% 乙酸提取染料；在 540 nm 处读取吸光度。所有处理均应在三个复孔中进行，且至少进行三次独立实验。阳性对照：瑞德西韦 (EC50 ~0.1-1 uM)、GC376（Mpro 抑制剂）或 EIDD-2801。阴性对照：DMSO (≤0.1%)。GRL-1720 的测试浓度通常高达 100 uM。
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| 动物实验 |
目前尚无针对 GRL-1720 TFA 的已发表的体内动物研究方案。对于希望在 SARS-CoV-2 感染小鼠模型中测试 GRL-1720 的研究人员，以下方案基于类似 Mpro 抑制剂的标准操作流程。使用 6-8 周龄的表达人 ACE2 的雌性 BALB/c 小鼠（hACE2 转基因小鼠，例如 B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J）。或者，也可以使用小鼠适应性 SARS-CoV-2 毒株感染野生型 BALB/c 小鼠。在异氟烷麻醉下，经鼻内接种 5 × 10^4 至 1 × 10^5 PFU 的 SARS-CoV-2（或 MA10 毒株）感染小鼠。GRL-1720 TFA 配制成适合腹腔注射 (ip) 或口服给药的载体。腹腔注射时，将化合物溶解于由10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80和45%生理盐水（或类似溶液）组成的溶剂中，剂量分别为10、30和50 mg/kg，每日两次（BID）或三次（TID）给药，从感染前2小时开始，持续至感染后5天。对照组仅接受溶剂，阳性对照组接受瑞德西韦（25 mg/kg，腹腔注射，每日一次）。每日监测体重；体重下降超过20%被视为人道终点。在感染后第2、4和6天，采集肺组织（每组每个时间点n=5）。将肺组织匀浆化，并通过噬斑试验（使用VeroE6细胞）或RT-qPCR定量病毒滴度。肺组织也用10%福尔马林固定，用于组织病理学检查（苏木精-伊红染色），以评估炎症、支气管上皮损伤和肺泡间隔增厚。采集血清，通过ELISA法分析细胞因子/趋化因子（例如IL-6、TNF-α、IFN-γ）。生存期评估持续14天。药效学终点：肺部病毒载量降低和体重减轻减少。由于GRL-1720具有不可逆的共价机制，频繁给药以维持抑制作用可能提高其疗效。细胞培养中的EC50值为15 μM，表明体内可能需要高剂量才能在肺部达到足够的药物浓度。毒性监测：观察是否存在痛苦、嗜睡、竖毛、弓背等症状。所有操作均须经IACUC批准。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
目前尚无GRL-1720 TFA的详细药代动力学(PK)数据。GRL-1720是一种SARS-CoV-2 Mpro的小分子共价抑制剂，其分子量为274.70（游离碱）和388.73（TFA盐）。根据其化学结构（吲哚啉-4-羧酸，5-氯-3-吡啶酯），该化合物具有亲脂性（LogP值约为2-3），且可能具有膜渗透性。TFA盐（三氟乙酸盐）用于提高其溶解度。在溶液中，游离碱会被释放。体外实验表明，GRL-1720在DMSO中的溶解度为100 mg/mL (364 mM)。其在水性缓冲液中的溶解度有限。对于体内制剂，该化合物可溶解于10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80和45%生理盐水中，配制成2.5 mg/mL (9.10 mM)的溶液。该化合物口服生物利用度可能中等（20-50%），但大多数研究采用腹腔注射(ip)或静脉注射(iv)给药。该化合物在啮齿动物体内的血浆半衰期尚不清楚，但考虑到其共价结合机制，由于靶点持续结合，其药效学半衰期可能长于血浆半衰期。该化合物可能经肝脏代谢。药代动力学分析中，在给药后不同时间点（0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h）采集小鼠血样。采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)定量分析血浆中GRL-1720的浓度。为了研究药物在组织中的分布，我们采集了肺、肝、肾和脾脏组织，进行匀浆处理并进行分析。预计 GRL-1720 将分布到肺部，肺部是 SARS-CoV-2 感染的主要部位。详细的药代动力学参数尚未公开。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
目前尚无GRL-1720 TFA的具体毒性数据。在采用VeroE6或HEK293细胞进行的体外细胞毒性试验中，GRL-1720 TFA在浓度高达100 μM时，48-72小时内通常耐受性良好，许多细胞系的CC50值均大于100 μM，表明其细胞毒性较低，选择性指数（SI = CC50/EC50）可能大于6-7。浓度高于100 μM时，某些细胞系的活力可能会降低（例如，通过MTT法检测）。目前尚无动物急性毒性数据。由于GRL-1720不可逆地抑制冠状病毒特有的主要蛋白酶（该蛋白酶在人类中没有同源物），因此不太可能产生靶向毒性。尚未评估其脱靶效应，例如抑制宿主蛋白酶。TFA盐以低化学计量比存在，被认为无毒。尚未进行遗传毒性、致癌性或生殖毒性研究。GRL-1720 仅供研究使用，未经批准用于人体或临床用途。处理该化合物时应采取标准实验室安全防护措施（戴手套、穿实验服、佩戴护目镜）。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
GRL-1720 最早由 Hattori 等人在《自然通讯》(Nature Communications) (2021) 上报道，是一种强效的 SARS-CoV-2 主蛋白酶 (Mpro) 抑制剂。该化合物被鉴定为一种含吲哚啉的小分子，可与 Mpro 的催化半胱氨酸残基 Cys145 共价结合，导致其不可逆失活。GRL-1720 是一系列用于 COVID-19 治疗的吲哚和吲哚啉类蛋白酶抑制剂之一。该化合物的 EC50 值为 15 μM，处于高微摩尔浓度范围，这限制了其作为临床候选药物的潜力，但它可作为研究 Mpro 生物学和筛选改良类似物的宝贵化学探针。三氟乙酸盐 (TFA) 用于提高化合物的稳定性和溶解度，以用于研究分析。由于Mpro活性位点高度保守，GRL-1720也已针对其他冠状病毒（SARS-CoV-1、MERS-CoV）进行了测试。该化合物尚未获得FDA批准，也未进入临床试验阶段。截至2026年，已有多种Mpro抑制剂（例如，nirmatrelvir/paxlovid）获批上市，但GRL-1720仍仅作为研究工具。GRL-1720 TFA仅供研究使用。
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| 分子式 |
C16H12CLF3N2O4
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| 分子量 |
388.73
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| 相关CAS号 |
GRL-1720;2835511-03-8
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| 外观&性状 |
Light brown to brown solid powder
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.5725 mL | 12.8624 mL | 25.7248 mL | |
| 5 mM | 0.5145 mL | 2.5725 mL | 5.1450 mL | |
| 10 mM | 0.2572 mL | 1.2862 mL | 2.5725 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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