Fluorescent Dye

实验方案：基于AF488 NHS酯的IgG荧光标记及固相肽库筛选技术
[1] 荧光标记体系构建
① IgG溶解：取冻干IgG粉末（5 g/L）溶于50 mM磷酸钠缓冲液（含20 mM NaCl，pH 8.3）
② 标记反应：将AF488 NHS酯（1 mg/100 μL无水DMF）与IgG溶液（1 mL）混合，室温避光旋转反应1 h
③ 纯化：采用3 kDa超滤管（Amicon Ultra 0.5 mL）浓缩标记产物

[2] 肽库筛选流程
• 树脂预处理：用5倍体积PBS（50 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.4）洗涤脱保护肽库树脂3次
• 探针制备：标记IgG用含0.2% Tween-20的PBS稀释至1.3 mg/mL
• 结合反应：4℃孵育肽库与标记IgG过夜
• 洗涤检测：PBS-T（含0.1% Tween-20）洗涤后，96孔板单珠荧光成像（10×，Ex/Em=480/510 nm）

试剂保存规范
• AF488 NHS酯母液：20 mM DMF溶液，分装避光-20℃保存
（注：该荧光染料在488 nm激发时呈现稳定绿色荧光，适用于蛋白共价标记）

标记反应[1]
通过将适当体积的20 mM AF488/Alexa Fluor 488 NHS酯，10 mM DIEA、胺和溶剂。除非另有说明，否则反应物在黑暗中孵育过夜（16-24小时）。孵育后，将反应物在5℃下稀释到分离缓冲液中 : 100 除非另有说明。

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毛细管电泳[1]
毛细管电泳（CE）分离在配备488的Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳系统上进行 nm激光诱导荧光（LIF）检测。用分离缓冲液加压冲洗毛细管两（2）分钟，然后注射样品（加压）5秒。15时进行了分离 kV，持续15分钟。分离后，用纯水加压冲洗毛细管五分钟。毛细管调节使用1 根据需要进行5分钟的NaOH冲洗。测试的分离缓冲液包括10 mM碳酸盐（pH 10）和10 mM碳酸盐，含12 mM SDS（pH 10）。

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IgG和CHO-S HCP的荧光标记[2]
按照制造商的建议，HCP和IgG用Alexa Fluor NHS酯进行荧光标记[31]。简而言之，将野生型CHO-S澄清收获物浓缩至2.3 g蛋白/L（≈6倍），并使用Macrosep Advance 3-kDa MWCO离心装置渗滤至pH 8.3的50 mM磷酸钠、20 mM氯化钠中。将冻干的多克隆人IgG（雅典研究所）溶解在50 mM磷酸钠、20 mM NaCl、pH 8.3中，浓度为5 g/L。将1 mg Alexa Fluor 596 NHS酯（AF596）或Alexa Fluor 546 NHS酯孵育后，使用Amicon Ultra 0.5-mL离心过滤器单元和3-kDa MWCO过滤器将样品渗滤至pH 7.4的50mM磷酸钠、150mM氯化钠中，以去除未反应的Alexa Fluor染料。

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抗IgG和CHO-S HCPs固相肽库的荧光筛选[2]
将六聚体或四聚体脱保护文库在pH 7.4的50 mM磷酸钠、150 mM氯化钠（PBS）中以5倍于沉淀树脂体积洗涤三次以达到平衡。将HCP-AF596或HCP-AF546和IgG-AF488稀释在50 mM磷酸钠、150 mM氯化钠、0.2%吐温、pH 7.4中，使最终浓度≈1.3 mg/mL IgG-AF488,≈0.58 mg/mL HCP-AF546,HCP-AF596,50 mM磷酸钠，150 mM氯化钠盐，0.1%吐温20，并与洗涤、平衡的文库混合，在2-8°C下孵育过夜。孵育后，去除多余的蛋白质溶液，用50 mM磷酸钠、150 mM氯化钠、0.1%吐温20、pH 7.4（PBS-T）洗涤树脂珠。对于手动荧光筛选，树脂在40µL PBS-T的96孔板上每孔沉积1个珠，然后使用Leica DMi8倒置显微镜和Hamamatsu C13440数码相机以10倍放大倍数成像，并配备Lumencor光谱光引擎。根据Alexa Fluor 594荧光测量在630 nm处的最高观察到的发射强度，在560 nm处激发，在480 nm处激发510 nm的发射强度进行阈值处理后，选择候选铅珠进行Alexa Fluor 488 NHS酯荧光测量。

为了提高通量，ClonePix 2集落选择器用于荧光成像和HCP阳性和IgG阴性珠的高通量分选。菌落选择器被确定为提高产量的一种可能选择，因为（1）它能够快速成像和量化大量珠子的强度，以及（2）ChemMatrix珠子的尺寸范围，这与传统上使用ClonePix 2仪器拾取的菌落相似。在用荧光标记的蛋白质与文库孵育并如上所述洗涤后，将它们悬浮在半固体基质中以适应成像和拾取。半固体基质由两部分Molecular Devices CloneMatrix和三部分83.3 mM磷酸钠、250 mM NaCl、0.17%吐温20制备，以产生具有与所用蛋白质结合条件相似的缓冲条件的基质。将约5至10µL沉淀体积的孵育文库轻轻加入基质溶液中，然后在6孔板上均匀等分，以获得每孔≈100-200个珠的目标珠密度。然后将平板在37°C下孵育2-18小时以固化基质。使用ClonePix FITC（曝光800毫秒，128个LED强度）和Rhod（500毫秒，128 LED强度）激光线对平板进行成像，以分别监测Alexa Fluor 488 NHS Ester/Alexa Fluor 488 NHS酯和Alexa Fluor 546的存在。由于ChemMatrix珠在FITC滤光片下有轻微的自发荧光，因此根据FITC滤光片的荧光强度分配了珠的位置（即ClonePix 2运行“Prime Configuration”）。使用ClonePix 2根据以下特征挑选珠子进行进一步加工：FITC内部平均强度<2500，Rhod内部平均强度>100，半径0.05~0.25 mm。在悬浮模式下进行拾取，抽吸体积为20µL以拾取珠子，排出体积为60µL，其中抽吸液体上方的多余体积为水。

[1]. Amine Analysis Using AlexaFluor 488 Succinimidyl Ester and Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence. J Anal Methods Chem. 2015;2015:368362.

[2]. Targeted Capture of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins: Peptide Ligand Discovery. Int J Mol Sci. 2019 Apr 8;20(7):1729.

[3]. Long, processive enzymatic DNA synthesis using 100% dye-labeled terminal phosphate-linked nucleotides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 Sep;27(9):1072-83.

荧光探针能够通过高灵敏度的激光诱导荧光检测原本不发荧光的物质。有机胺大多不发荧光，但在农业和食品科学、生物医学应用以及生物战检测等领域具有重要的分析价值。Alexa Fluor 488 N-羟基琥珀酰亚胺酯（AF488 NHS-酯）是一种胺类特异性荧光探针。本文中，我们展示了该探针对长链（C9至C18）伯胺的低检测限，并优化了AF488对长链伯胺的衍生化反应。结果表明，该反应在所有研究的溶剂（二甲基亚砜、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺）中均具有相同的效率。虽然需要有机碱（N,N-二异丙基乙胺）才能使AF488 NHS-酯与具有较长疏水链的有机胺发生高效反应，但高浓度（>5 mM）的有机碱会导致空白样品中乙胺和丙胺的含量增加。最佳孵育时间在室温下为 12 小时以上。我们提出了一种初步的毛细管电泳分离分析方法，该方法使用简单的胶束电动色谱 (MEKC) 缓冲液，该缓冲液由 12 mM 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和 5 mM 碳酸盐组成，pH 值为 10。在优化的标记条件和这些分离条件下，检测限为 5-17 nM。本文提出的方法为可用于高灵敏度分析小分子有机物的荧光探针库增添了一种新的选择。[1]

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生物制造中质量源于设计 (QbD) 理念的日益普及，要求详细、定量地了解杂质谱及其对产品安全性和有效性的影响。尤其重要的是测定用于生产的重组细胞分泌的宿主细胞蛋白 (HCP) 的残留水平，这些蛋白与目标产物一起分泌。尽管通常被视为单一杂质，但宿主细胞蛋白 (HCP) 包含多种种类，其丰度、大小、功能和组成各不相同。由于细胞系间、产品间以及批次间的差异，清除这些杂质是一个复杂的问题。基于蛋白质组学方法的 HCP 监测技术的改进，使得人们能够识别出一部分“问题”HCP，这些 HCP 在产品捕获和精制步骤中都难以去除，即使浓度极低也会影响产品的稳定性和安全性。本文描述了合成肽配体的开发，该配体能够捕获多种中国仓鼠卵巢 (CHO) HCP，并结合多种肽类实现先进的混合模式结合。我们筛选了固相肽库，以鉴定和表征能够捕获 CHO HCP 且与人 IgG（本文用作模型产品）结合极少的肽。研究发现，具有多极性或疏水/带正电荷氨基酸组成的四聚体和六聚体配体最为有效。四聚体多极性配体表现出最高的靶向结合率（HCP清除率与IgG损失率之比），是工业界用于IgG纯化的商业混合模式和阴离子交换树脂的两倍以上。所有测试的肽树脂均表现出对HCP的优先结合，而非IgG，表明其在流通模式或弱分配模式色谱中具有潜在的应用价值。[2]

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我们展示了一种高效的DNA合成方法，该方法用带有荧光标记的核苷酸完全取代了四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物。一种适用于单分子荧光检测的不同光谱可分离荧光染料通过与末端磷酸基团的连接，分别与四种dNTP偶联。使用这些修饰的核苷酸，观察到phi 29 DNA聚合酶对DNA的合成具有持续性，可生成长度达数千个碱基的产物，标记核苷酸的亲和力和DNA聚合速率接近未修饰的dNTP水平。本文结果表明，这些核苷酸适用于单分子实时DNA测序应用。[3]

C31H32N4O13S2

732.73

732.1407294

AF488 NHS ester;1374019-99-4

168679754

Orange to red solid powder

293 Ų

4

15

9

50

1610

0

CCN(CC)CC.C1CC(=O)N(C1=O)OC(=O)C2=CC(=C(C=C2)C3=C4C=CC(=[NH2+])C(=C4OC5=C3C=CC(=C5S(=O)(=O)[O-])N)S(=O)(=O)O)C(=O)O

OQTDJZAVCSDIGF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H17N3O13S2.C6H15N/c26-15-5-3-12-19(11-2-1-10(9-14(11)24(31)32)25(33)41-28-17(29)7-8-18(28)30)13-4-6-16(27)23(43(37,38)39)21(13)40-20(12)22(15)42(34,35)36;1-4-7(5-2)6-3/h1-6,9,26H,7-8,27H2,(H,31,32)(H,34,35,36)(H,37,38,39);4-6H2,1-3H3

3-amino-6-azaniumylidene-9-[2-carboxy-4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonylphenyl]-5-sulfoxanthene-4-sulfonate;N,N-diethylethanamine

AF488 NHS ester (TEA); AF488 NHS ester TEA; Triethylamine 2-(3,6-diamino-4-sulfo-5-sulfonatoxanthylium-9-yl)-5-(((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)carbonyl)benzoate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O :~0.5 mg/mL (~0.68 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。