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MLKL-IN-6

别名: MLKL-IN-6; MLKL-IN 6; MLKL-IN6; MLKL inhibitor P28; TP prodrug CX-23; Triptolide prodrug CX-23; MLKL-IN-P28;
目录号: V79876 纯度: ≥98%
COA 产品数据 产品说明书 SDS
MLKL-IN-6（化合物 P28）是一种混合谱系激酶抑制剂，靶向混合谱系激酶结构域样 (MLKL)。
MLKL-IN-6 产品类别: Mixed Lineage Kinase
产品仅用于科学研究，不针对患者销售
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产品描述
MLKL-IN-6（化合物 P28）是一种混合谱系激酶抑制剂，靶向混合谱系激酶结构域样 (MLKL)。 MLKL-IN-6 抑制细胞坏死。 MLKL-IN-6 抑制细胞坏死过程中的 MLKL 磷酸化和寡聚化，抑制免疫细胞死亡，并减少粘附因子的表达。 MLKL-IN-6具有低细胞毒性作用，抑制肝星状细胞活化，降低肝纤维化标志物水平，具有抗纤维化作用。
生物活性&实验参考方法
靶点
P28 targets Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein (MLKL).
It covalently modifies the cysteine residue in the FSNRSNICRFLTASQDK peptide at the N-terminus of human MLKL. The EC50 of MLKL binding to P28 is 10.3 μM, as determined by spectral shift dose-response curves. [1]
体外研究 (In Vitro)
在FADD敲除的Jurkat T细胞中，P28 通过细胞活力测定显示，其对TNF-α诱导的坏死性凋亡具有强效抑制作用，IC50 < 1 μM。[1]
在0.1 μM浓度下，通过LDH释放测定，P28在防止坏死性凋亡刺激后的细胞死亡方面显示出比necrosulfonamide（NSA）更强的效力。[1]
使用Annexin V/PI染色的流式细胞术分析显示，P28处理（1、3和10 μM）减少了晚期凋亡和细胞死亡，Annexin V⁺PI⁺细胞的比例分别为23.25%、2.52%和1.1%，而坏死性凋亡诱导对照组为39.04%。[1]
在HT-29细胞中，P28处理（3 μM）可降低TSZ诱导的坏死性凋亡后位于质膜上的MLKL磷酸化水平，通过免疫荧光和质膜组分分析证实。[1]
透射电子显微镜分析显示，P28（3 μM）可逆转HT-29细胞中TSZ诱导的质膜破裂和通透性改变。[1]
在非还原SDS-PAGE条件下，P28（3 μM）显著降低了TSZ诱导的HT-29细胞中MLKL寡聚化。[1]
在肝星状细胞（LX-2）中，通过定量RT-PCR测定，P28处理（3 μM）抑制了坏死性凋亡刺激诱导的纤维化标志物（α-SMA、胶原蛋白-1）、趋化因子（CXCL1、CXCL2）、MLKL和粘附分子（ICAM1）的mRNA表达。[1]
免疫荧光染色显示，P28（3 μM）在坏死性凋亡条件下降低了LX-2细胞中α-SMA的表达。[1]
在U937单核细胞中，通过定量RT-PCR测定，P28处理（1、3和10 μM）以剂量依赖性方式抑制TSZ诱导的细胞因子（TNF-α、CCL2）、趋化因子（CXCL1、CXCL2）和粘附分子（ICAM1）的表达。[1]
流式细胞术分析显示，P28处理（1、3和10 μM）以剂量依赖性方式降低TSZ处理的U937细胞中CCR2的表达。[1]
LC-MS/MS分析证实，P28共价修饰人MLKL N端FSNRSNICRFLTASQDK肽段上的半胱氨酸残基。[1]
与NSA相比，在FADD敲除的Jurkat T细胞中，10 μM P28显示出更低的细胞毒性。[1]
酶活实验
酶学实验： 使用光谱位移分析评估了P28与重组MLKL的结合相互作用。保持荧光标记的MLKL浓度恒定，同时将P28浓度从24 nM变化至100 μM。生成剂量反应曲线并计算EC50值。MLKL与P28结合的半数有效浓度（EC50）测定为10.3 μM。[1]
通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定了P28在MLKL上的共价结合位点。将重组MLKL蛋白与P28处理，随后进行酶切消化。使用配备纳电喷雾源的Orbitrap Exploris 480质谱仪分析所得肽段片段。样品上样至C18捕集柱，脱盐，然后在C18分析柱上分离。流动相为水和乙腈，均含0.1%甲酸。LC梯度随着时间增加乙腈浓度运行。质谱以数据依赖模式运行，在MS1和MS2扫描之间切换。全扫描MS1谱图在Orbitrap中采集，MS2谱图使用高能碰撞解离（HCD）采集。分析来自肽段FSNRSNICRFLTASQDK的所得片段离子（b8至b16和y10至y16）。未修饰肽段和P28修饰肽段的m/z值相差P28的质量（+1电荷为394.1288，+2电荷为197.0644），证实了半胱氨酸残基的共价修饰。[1]
细胞实验
对于细胞增殖和细胞毒性测定，将细胞接种于96孔板并孵育24小时。药物处理后，使用Cell Counting Kit-8评估增殖，在450 nm处测量吸光度。使用CellTiter-Glo 2.0测定法评估细胞ATP含量，并测量发光值。对于LDH释放测定，将细胞接种于96孔板并孵育24小时，然后使用LDH细胞毒性检测试剂盒评估细胞毒性。[1]
对于基于流式细胞术的细胞死亡分析，将细胞（1 × 10⁶个细胞/孔）接种于100 mm培养皿中并处理24小时。收集细胞并与Annexin V（2 μg/mL）和碘化丙啶（PI，10 μg/mL）孵育。根据细胞形态（肿胀、脱壁、膜破裂）和Annexin V/PI染色评估坏死性凋亡。[1]
对于免疫荧光染色，将细胞接种于八孔腔室载玻片上，用4%多聚甲醛固定，用0.2% Triton X-100透化，并用10%正常山羊血清和1% BSA封闭。细胞与一抗在4°C孵育过夜，然后与荧光二抗在室温孵育1小时，并用含DAPI的封片剂封片。[1]
对于RNA提取和定量RT-PCR，使用TRIzol试剂提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒转化为互补DNA。使用LightCycler 480系统和SYBRGreen I Mastermix进行聚合酶链反应。[1]
对于非还原SDS-PAGE，样品在不含2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的缓冲液中制备，以保留二硫键。[1]
对于胞浆和核组分提取，使用细胞分级分离试剂盒通过缓冲液提取处理细胞。[1]
对于质膜蛋白提取，将细胞在缓冲液混合物中裂解，使用注射器匀浆，并在700g离心10分钟。将上清液进一步在10,000g离心30分钟，所得上清液收集为胞浆组分。[1]
对于透射电子显微镜，将细胞在含0.1 M PBS的2.5%戊二醛缓冲液中固定8小时，在1%四氧化锇中后固定，在梯度乙醇中脱水，并包埋在树脂中。使用超薄切片机切割切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，并成像。[1]
参考文献

[1]. Novel Inhibitor of Mixed-Lineage Kinase Domain-Like Protein: The Antifibrotic Effects of a Necroptosis Antagonist. ACS Pharmacology & Translational Science, 2023 Sep 11;6(10):1471-1479.

*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C20H18N4O5
分子量
394.38
精确质量
394.1277196
外观&性状
White to off-white solid powder
LogP
1.4
tPSA
105 Ų
氢键供体(HBD)数目
1
氢键受体(HBA)数目
6
可旋转键数目(RBC)
5
重原子数目
29
分子复杂度/Complexity
769
定义原子立体中心数目
0
SMILES
CN1C(=NC2=C1C(=O)N(C(=O)N2CC#CC3=CC(=CC=C3)O)C)/C=C/C(=O)OC
InChi Key
PURCTTCEAJLVTC-MDZDMXLPSA-N
InChi Code
InChI=1S/C20H18N4O5/c1-22-15(9-10-16(26)29-3)21-18-17(22)19(27)23(2)20(28)24(18)11-5-7-13-6-4-8-14(25)12-13/h4,6,8-10,12,25H,11H2,1-3H3/b10-9+
化学名
methyl (E)-3-[3-[3-(3-hydroxyphenyl)prop-2-ynyl]-1,7-dimethyl-2,6-dioxopurin-8-yl]prop-2-enoate
别名
MLKL-IN-6; MLKL-IN 6; MLKL-IN6; MLKL inhibitor P28; TP prodrug CX-23; Triptolide prodrug CX-23; MLKL-IN-P28;
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month
运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO: 100 mg/mL (253.6 mM)
溶解度 (体内实验)
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
(IP/IV/IM/SC等)
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。
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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。
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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。
请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 2.5356 mL 12.6781 mL 25.3563 mL
5 mM 0.5071 mL 2.5356 mL 5.0713 mL
10 mM 0.2536 mL 1.2678 mL 2.5356 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器
计算 重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？
  • 在分子量（MW）框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。
计算 重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：
  • 在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
  • 在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中
g/mol
计算 重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：
  • 分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
  • 摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。
/
计算 重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器（澄清溶液）
第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）
第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。
+
+
+
计算 重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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