MLKL-IN-3

别名: MLKL-IN-3; MLKL-IN 3; CHEMBL5188408; SCHEMBL27384351; MLKL-IN3; 3031406-27-3;
目录号: V80790 纯度: ≥98%
MLKL-IN-3(化合物 66)是 MLKL(混合谱系激酶结构域样蛋白)的有效抑制剂。
MLKL-IN-3 CAS号: 3031406-27-3
产品类别: Mixed Lineage Kinase
产品仅用于科学研究,不针对患者销售
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产品描述
MLKL-IN-3(化合物 66)是 MLKL(混合谱系激酶结构域样蛋白)的有效抑制剂。 MLKL-IN-3 可抑制 HT-29 细胞的坏死性凋亡,作用于 MLKL 磷酸化下游,EC50 为 31 nM。 MLKL-IN-3 是一种点击化学试剂。它含有炔基,可以与带有叠氮基的化合物发生 CuAAc(铜催化叠氮-炔环加成反应)。
生物活性&实验参考方法
靶点
MLKL-IN-3 (compound 66): Human MLKL (Cysteine86); no inhibition on human RIPK1 and RIPK3 kinases (10 μM concentration shows no kinase activity inhibition) [1]
体外研究 (In Vitro)
1. MLKL-IN-3 (compound 66)是人源MLKL的共价抑制剂,在TSZ诱导的HT-29细胞中具有强效抗坏死性凋亡活性,EC₅₀为31 nM [1]
2. MLKL-IN-3 (compound 66)共价结合于人源MLKL的Cys86残基,经LC-MS/MS分析和基于活性的蛋白谱(ABPP)竞争实验证实;它能有效竞争MLKL靶向探针TC13136与MLKL的结合 [1]
3. MLKL-IN-3 (compound 66)在体外对RIPK1和RIPK3激酶活性无抑制作用(10 μM浓度下无明显抑制效果),且不影响TSZ诱导的HT-29细胞中RIPK1和MLKL的磷酸化状态 [1]
4. MLKL-IN-3 (compound 66)在HeLa细胞中不抑制外源性凋亡(TNFα + CHX、TNFα + Smac模拟物)、内源性凋亡(ABT737 + S63845)及铁死亡(PACMA31 + Regorafenib),表明其抗坏死性凋亡活性具有特异性 [1]
5. MLKL-IN-3 (compound 66)在TSZ诱导的HT-29细胞中可部分抑制MLKL寡聚化,但抑制效果弱于TC13172;它能显著抑制MLKL向细胞膜的转运,经可溶性和膜组分的western blot分析及p-MLKL的免疫荧光染色证实 [1]
6. MLKL-IN-3 (compound 66)在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中无抗坏死性凋亡活性,因小鼠MLKL缺乏该化合物靶向的Cys86残基 [1]
7. 在转染MLKL C86S突变体的HT-29 MLKL敲除(KO)细胞中,MLKL-IN-3 (compound 66)的抗坏死性凋亡活性完全丧失,而在转染MLKL F148A或K157A突变体的细胞中仍保留活性 [1]
8. MLKL-IN-3 (compound 66)与谷胱甘肽(GSH)的反应速率显著低于TC13172(低150倍以上),表明其化学稳定性更好,潜在脱靶效应更低 [1]
9. 在无TSZ诱导的情况下,高浓度的MLKL-IN-3 (compound 66)不影响HT-29细胞的存活和增殖 [1]
在 HT-29 细胞中,MLKL-IN-3(化合物 66)(1 μM,24 小时)可防止 MLKL 转位到细胞膜上[1]。 MLKL 和 RIPK1 的磷酸化状态不受 MLKL-IN-3 的影响[1]。
体内研究 (In Vivo)
化合物 66,MLKL-IN-3,在 48 小时内表现出 T1/2,并且与谷胱甘肽 (GSH) 的反应率降低了 150 倍以上,这可能减轻其细胞毒性作用和脱靶后果[1]。
酶活实验
1. MLKL-IN-3 (compound 66)的RIPK1激酶活性检测实验:使用纯化的RIPK1激酶在合适的孔板中进行实验,反应体系包含ATP和底物蛋白,通过荧光素酶监测生成的ADP量来评估激酶活性。化合物测试浓度为1 μM和10 μM,以Ponatinib为阳性对照,结果显示对RIPK1激酶活性无抑制作用 [1]
2. MLKL-IN-3 (compound 66)的RIPK3激酶活性检测实验:采用与RIPK1激酶检测类似的实验设置,以纯化的全长RIPK3激酶为靶标,化合物测试浓度为1 μM和10 μM,经ADP生成检测后,未观察到对RIPK3激酶活性的抑制作用 [1]
细胞实验
1. MLKL-IN-3 (compound 66)的TSZ诱导坏死性凋亡抑制实验:将HT-29细胞以每孔2×10⁴个细胞的密度接种到96孔板中,37℃、5% CO₂条件下培养过夜;将系列浓度的化合物与TSZ(TNFα 20 ng/mL、Smac模拟物LCL-161 1 μM、ZVAD-FMK 20 μM)共同处理细胞24小时;采用发光法细胞活力检测试剂通过ATP定量测定细胞活力,用酶标仪记录发光值并计算EC₅₀值 [1]
2. MLKL-IN-3 (compound 66)的MLKL共价结合验证实验(ABPP):将HT-29细胞用10 μM该化合物预孵育2小时,再加入10 μM MLKL探针TC13136继续孵育2小时;细胞裂解液与Biotin-C₂H₄-N₃、TBTA、CuSO₄和抗坏血酸钠进行2小时点击反应;富集生物素修饰的蛋白,通过MLKL抗体的western blot分析验证竞争性结合 [1]
3. MLKL-IN-3 (compound 66)的MLKL寡聚化及膜转运实验:HT-29细胞在1 μM化合物存在下用TSZ处理6-8小时;寡聚化检测时,细胞裂解液经western blot分析,与DMSO对照组比较寡聚化MLKL的水平;膜转运检测时,将细胞分离为可溶性组分和膜组分,通过western blot检测各组分中MLKL的水平(以GAPDH为可溶性组分对照,COXIV为膜组分对照),同时采用抗pMLKL抗体进行免疫荧光染色,观察p-MLKL的细胞定位 [1]
4. MLKL-IN-3 (compound 66)的MLKL突变体细胞实验:将野生型MLKL或MLKL突变体(C86S、F148A、K157A)转染至HT-29 MLKL KO细胞中;转染后的细胞用TSZ和该化合物处理24小时,通过ATP定量检测细胞活力,评估化合物活性对特定MLKL残基的依赖性 [1]
5. MLKL-IN-3 (compound 66)的细胞死亡特异性实验:在化合物存在下,HeLa细胞分别被诱导发生外源性凋亡(TNFα 50 ng/mL + CHX或Smac模拟物10 μM)、内源性凋亡(ABT737 5 μM + S63845 2 μM)或铁死亡(PACMA31 1 μM + Regorafenib 10 μM);孵育24小时后通过ATP水平评估细胞活力,验证化合物对坏死性凋亡的特异性 [1]
6. MLKL-IN-3 (compound 66)的跨物种抗坏死性凋亡实验:将小鼠MEF细胞接种到96孔板中,用TSZ和该化合物处理24小时;通过ATP水平测定细胞活力,评估化合物在小鼠细胞中的活性 [1]
参考文献

[1]. Discovery of a New Class of Uracil Derivatives as Potential Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein (MLKL) Inhibitors. J Med Chem. 2022 Oct 13;65(19):12747-12780.

*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C31H29CLN4O6
分子量
589.04
精确质量
588.17756
CAS号
3031406-27-3
PubChem CID
168279716
外观&性状
Typically exists as solid at room temperature
LogP
3.5
tPSA
119 Ų
氢键供体(HBD)数目
2
氢键受体(HBA)数目
6
可旋转键数目(RBC)
9
重原子数目
42
分子复杂度/Complexity
1240
定义原子立体中心数目
0
SMILES
CC1=CC=C(C=C1)CCC(=O)NC2=C(N(C(=O)N(C2=O)C)CC#CC3=CC(=C(C=C3)O)CN4C=CC=C(C4=O)OC)Cl
InChi Key
MWDOKDNDKHXYHZ-UHFFFAOYSA-N
InChi Code
InChI=1S/C31H29ClN4O6/c1-20-8-10-21(11-9-20)13-15-26(38)33-27-28(32)36(31(41)34(2)30(27)40)17-4-6-22-12-14-24(37)23(18-22)19-35-16-5-7-25(42-3)29(35)39/h5,7-12,14,16,18,37H,13,15,17,19H2,1-3H3,(H,33,38)
化学名
N-[6-chloro-1-[3-[4-hydroxy-3-[(3-methoxy-2-oxo-1-pyridinyl)methyl]phenyl]prop-2-ynyl]-3-methyl-2,4-dioxopyrimidin-5-yl]-3-(4-methylphenyl)propanamide
别名
MLKL-IN-3; MLKL-IN 3; CHEMBL5188408; SCHEMBL27384351; MLKL-IN3; 3031406-27-3;
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
溶解度 (体内实验)
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方,主要用于溶解难溶或不溶于水的产品(水溶度<1 mg/mL)。 建议您先取少量样品进行尝试,如该配方可行,再根据实验需求增加样品量。

注射用配方
(IP/IV/IM/SC等)
注射用配方1: DMSO : Tween 80: Saline = 10 : 5 : 85 (如: 100 μL DMSO 50 μL Tween 80 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备:将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中,得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL DMSO 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL DMSO 900 μL Corn oil)
示例: 注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液,加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。
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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如:100 μL DMSO 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备(4°C,储存1周):将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中,得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如: 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精) 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如: 50 μL DMSO 100 μL PEG300 200 μL Castor oil 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10: 10 : 80 (如: 100 μL Ethanol 100 μL Cremophor 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL EtOH 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL EtOH 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)


口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中,得到0.5%CMC-Na澄清溶液;然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中,得到悬浮液。
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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合


注意: 以上为较为常见方法,仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型,对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物,需通过前期实验来确定(建议先取少量样品进行尝试),包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案:
1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL;

3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用!
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 1.6977 mL 8.4884 mL 16.9768 mL
5 mM 0.3395 mL 1.6977 mL 3.3954 mL
10 mM 0.1698 mL 0.8488 mL 1.6977 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);

4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。

计算器

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度,具体如下:

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示:
假如化合物的分子量为350.26 g/mol,在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少?
  • 在分子量(MW)框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在“体积”框中输入5,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式,您可以计算体积和浓度。

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如,可以输入C1、C2和V2来计算V1,具体如下:

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液?
使用方程式C1V1=C2V2,其中C1=10mM,C2=25μM,V2=25 ml,V1未知:
  • 在C1框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在C2框中输入25,然后选择正确的单位(μM)
  • 在V2框中输入25,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL(0.1 ml)出现在V1框中
g/mol

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成,具体如下:

注:化学分子式大小写敏感:C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量(分子量)的说明:
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量),请输入化学/分子式,然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义:
  • 分子质量(或分子量)是一种物质的一个分子的质量,用统一的原子质量单位(u)表示。(1u等于碳-12中一个原子质量的1/12)
  • 摩尔质量(摩尔重量)是一摩尔物质的质量,以g/mol表示。
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配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器(澄清溶液)
第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量)
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶/难溶于水的化合物),不同的产品和批次配方组成不同,如对配方有疑问,可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外,请注意这只是一个配方计算器,而不是特定产品的确切配方。
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计算结果:

工作液浓度 mg/mL;

DMSO母液配制方法 mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。

体内配方配制方法μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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