18α-Glycyrrhizic acid   中文名称: 18α-Glycylrrhizin

Glycyrrhizic acid analog

通过对甘草酸的SAR分析，发现18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG)对lps诱导的RAW264.7细胞NO和IL-6的产生有较强的抑制作用。Western blotting和免疫荧光结果显示，在lps刺激的RAW264.7细胞中，18α-GAMG降低了iNOS、COX-2和MAPKs的表达以及NF-κB的活化。[1]

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为了评估甘草酸类似物的抗炎效果，使用Griess试剂检测了LPS诱导的RAW264.7细胞中NO释放的水平。NO的过量释放被认为是炎症反应中的一个重要因素。如图2所示，经过甘草酸类似物处理后，LPS诱导的RAW264.7细胞中NO释放的增加显著减轻。SAR分析表明：(i) 齐墩果烷型苷元18α-差向异构体的抗炎活性优于18β-差向异构体（18α-GA > 18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG)/18β-GA，18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸（18α-GAMG） > 18β-GAMG，18α-GCCS > 18β-GCCS）；(ii) C-3位葡萄糖醛酸的数量对抗炎活性有影响（单葡萄糖醛酸 > 苷元 > 双葡萄糖醛酸，例如18β-GAMG > 18β-GCCS > 18β-GA，18α-GAMG > 18α-GCCS > 18α-GA）。甘草酸类似物表现出较好的抗炎活性；其中，18α-GAMG的活性最强，在40 μM浓度下NO抑制率超过70%。[1]

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为了进一步评估甘草酸类似物对LPS诱导的IL-6产生的影响，我们在甘草酸类似物存在的情况下，用LPS （1 μg mL-1）培养RAW264.7细胞20 h，并通过ELISA检测上清中IL-6的水平。如图3所示，甘草酸类似物处理后，lps诱导的IL-6产量下降，并观察到抑制作用，得出以下结论：(i)对于IL-6的抑制作用，18α-epimer优于18β-epimer (18α-GA > 18β-GA, 18α-GAMG > 18β-GAMG, 18α-GCCS≈18β-GCCS)；（ii）葡萄糖醛酸的数量对抗炎活性（单葡糖醛酸>苷元>双葡糖醛酸，如18β-GAMG > 18β-GCCS > 18β-GA、18α-GAMG > 18α-GCCS > 18α-GA）有影响。因此，结合甘草酸类似物的抗炎活性和细胞毒性，选择18α-GAMG进一步探讨其抗炎作用的机制。［１］

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18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG)抑制NO和IL-6的产生最有效。因此，我们用它来研究炎症相关蛋白的表达。32,33在lps刺激的RAW264.7细胞中检测一氧化氮合酶（iNOS）和COX-2的表达。Western blotting结果显示，在LPS刺激的RAW264.7细胞中，18α-GAMG强烈减弱iNOS和COX-2的表达，并呈剂量依赖性（图4）。这些初步结果表明，18α-GAMG可能参与了巨噬细胞中LPS激活的信号通路。［１］

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NF-κB是一种众所周知的转录因子，在炎症刺激下积极调节炎症基因，如iNOS、COX-2和IL-6NF-κB活化是由NF-κB - 35的同源调控亚基i -κB -α的磷酸化和降解控制的因此，采用western blotting检测18α-甘草酸单lucuronide (18α-GAMG)对lps刺激的RAW264.7细胞NF-κB通路的影响。如图5A所示，LPS显著提高了磷酸化的NF-κB p65和i -κB α的水平，而18α-GAMG处理可以不同程度地减弱这些蛋白的活化。此外，我们还检测了lps刺激RAW264.7细胞中NF-κB的核易位。免疫荧光分析显示，18α-GAMG明显抑制NF-κB p65核从细胞质向细胞核的易位（图5B）。这些结果进一步证实了18α-GAMG可能通过抑制NF-κB信号通路调节促炎蛋白的表达。［１］

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在哺乳动物细胞中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）转导途径是由NF-κB激活的。36,37抑制MAPK的激活可以下调炎症介质的表达，从而改善实验性炎症疾病的结局。38,39为了确定18α-GAMG在lps刺激的RAW264.7细胞中调节MAPK激活的作用，我们检测了ERK、JNK和p38的表达。正如预期的那样（图6），在lps刺激处理30分钟后，p38、JNK和ERK的磷酸化水平升高。18α-GAMG剂量依赖性（10、20和30 μM）抑制lps诱导的ERK磷酸化，但对RAW264.7细胞中JNK或p38的磷酸化几乎没有影响。这些结果提示，18α-GAMG的抗炎活性可能与其对ERK激活的负作用有关。［１］

为进一步验证18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG)在体内的抗炎活性，本研究建立ccl4诱导的小鼠肝纤维化模型，研究其对肝纤维化的影响健康C57BL6小鼠（SPF，雄性，20±2 g）购自安徽医科大学实验动物中心。动物被安置在温度（22±2°C）和相对湿度（50%）控制的房间中，在12小时的明暗循环中，自由获取食物和水，并在使用前至少适应一周。所有动物实验均按照中国科学技术国家委员会颁布的《实验动物管理条例》进行。为了尽量减少动物的数量和它们的痛苦，人们做出了努力。动物的饲养按照《安徽医科大学发育生物学中心实验动物护理与使用指南》进行，所有实验均采用各机构动物护理小组委员会批准的方案。[1]
如图7所示，对照组肝脏结构清晰，肝细胞大小不变。肝小叶完整，无变性、坏死（图7A、F）。模型组蓝色胶原纤维数量明显增加。模型组脂肪变性明显，肝细胞呈球囊样变性（图7B、G）。秋水仙碱组（0.1 mg kg-1）、高剂量<18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG)组、低剂量18α-GAMG均显著降低肝脏炎症细胞浸润程度、蓝色胶原纤维和纤维化程度，且高剂量组优于低剂量组（图7C、D、E、H、p）。这些结果表明，18α-GAMG可以显著改善ccl4诱导的肝纤维化的病理改变。［１］

NO生成测定[1]
RAW264.7细胞以1×105细胞/孔接种于24孔板，培养20 h，然后用无血清培养基中制备的50µM化合物预处理2 h，然后用LPS（1µg/mL）刺激。LPS刺激24小时后。根据生产厂家的说明，用Griess试剂检测亚硝酸盐水平来测定NO的产量。然后在酶标仪上测量样品在540nm处的吸光度（OD540）。NO抑制率=[对照(OD540) -化合物（OD540）] /[对照(OD540) -空白（OD540）] × 100%。对照组：仅用LPS治疗。化合物：用脂多糖和化合物处理。空白：仅用新鲜培养基培养。[1]

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细胞毒性[1]
采用甲基噻唑四氮唑（MTT）法评价细胞毒性。RAW264.7细胞以每孔6 × 103个细胞接种于96孔板。细胞培养24 h后，用不同的化合物在DMEM中稀释24 h，然后在细胞中加入20µL 0.5 mg/mL的MTT试剂，孵育4 h， 4 h后，取出细胞，加入150µL DMSO溶解福马胶。在570 nm处测定光密度（OD570）。通过三个独立的实验计算细胞活力。空白组形成的甲醛密度设为100%存活率。细胞活力(%)=复方(OD570 /空白（OD570） × 100%空白：仅用新鲜培养基培养。化合物：用化合物或LPS处理。[1]

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测量IL-6 [1]
RAW264.7细胞（7 × 104个/孔）在24孔板中培养。培养24 h后，分别用10µM和40µM的化合物预处理2 h，然后加入LPS。加入1µg/mL LPS刺激IL-6的产生，孵育20小时。使用小鼠ELISA试剂盒检测上清中IL-6的水平，操作方法按照制造商的说明。[1]

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Western Blot分析[1]
将RAW264.7细胞以2 × 106个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中，培养24 h。然后用含有10、20、30µM化合物的新鲜培养基替换培养基，加入1µg/mL LPS。再培养30 min或20 h后，收获细胞，用添加1 mM苯甲磺酰氟的IP缓冲液裂解，冰孵育30 min。细胞裂解液在4℃下14000 × g离心10 min，去除不溶性物质，收集上清。用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。每个蛋白质样品与1 / 4体积的5X SDS- page样品上样缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS， 5% β-巯基乙醇，20%甘油和0.1%溴酚蓝）混合，7 S煮沸10分钟。每孔等量的细胞总蛋白在12.5%预制SDS- page凝胶中加载，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，在300 mA下超过60分钟。将膜用5%脱脂干牛奶加0.1% Tween 20 （TBST）在室温下阻断2小时，TBST中洗涤3次，每次5分钟，用一抗(抗SAPK/JNK、抗SAPK/JNK、抗ERK1/2磷酸化、抗ERK1/2、抗p38磷酸化、抗p38、抗IkBa磷酸化、抗IkBa、抗NF-kB p65、抗nf -κB p65)在4℃下过夜（所有一抗按1:1000的比例稀释），在TBST中洗涤3次，每次5 min，与抗兔或抗小鼠二抗（1:5000 TBST）孵育90 min，在TBST中洗涤，暴露于ECL试剂[1]。

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免疫荧光测定[1]
RAW264.7细胞（7 × 104个/孔）在24孔板中培养。培养24 h后，分别用20、30µM 18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG)预处理2 h，然后用LPS（1µg/mL）处理3 h。冷PBS洗涤2次，4%甲醛固定15 min， 0.3% Triton X-100在PBS中渗透10 min， 5% BSA阻断0.5 h。细胞用抗nf -κB p65抗体一抗孵育过夜，然后用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗孵育。洗一步后，用DAPI染色5分钟，获得图像。

18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG) Alleviated CCl4-induced Hepatic Fibrosis [1]
Healthy male C57BL6 mice were randomly divided into 4 groups: control group, model group, high-dose 18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG) group and low-dose 18α-GAMG group, and each with 10. All mice except normal group were given 20% CCl4 olive oil (2 mL/kg) by hypodermic injection，two times a week for 4 weeks. Control group was given 0.9% sodium chloride by hypodermic injection, two times a week for 4 weeks. 18α-GAMG (200 mg/kg and 100 mg/kg) was given by intra-gastric administration to high-dose 18α-GAMG group and low-dose 18α-GAMG, two times a week for 4 weeks at beginning of third week. All mice were killed at 4th week. Pathological changes in hepatic tissue were observed by HE and Masson staining. [1]

158471 mouse LD50 intravenous 912 mg/kg LUNGS, THORAX, OR RESPIRATION: RESPIRATORY STIMULATION; LUNGS, THORAX, OR RESPIRATION: OTHER CHANGES Zhongguo Yaoxue Zazhi. Chinese Pharmacuetical Journal., 28(215), 1993
158471 mouse LD50 oral 6460 mg/kg LUNGS, THORAX, OR RESPIRATION: RESPIRATORY STIMULATION; LUNGS, THORAX, OR RESPIRATION: OTHER CHANGES Zhongguo Yaoxue Zazhi. Chinese Pharmacuetical Journal., 28(215), 1993

[1].18α-Glycyrrhetinic acid monoglucuronide as an anti-inflammatory agent through suppression of the NF-κB and MAPK signaling pathway. Medchemcomm. 2017 Jun 2;8(7):1498–1504.

[2].Mechanism of antihepatotoxic activity of glycyrrhizin. I: Effect on free radical generation and lipid peroxidation. Planta Med. 1984 Aug;50(4):298-302.

alpha-Glycyrrhizin has been reported in Glycyrrhiza uralensis, Glycyrrhiza glabra, and Glycyrrhiza inflata with data available.

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In conclusion, the clear structure–activity relationships of glycyrrhizin with anti-inflammatory activity was explained; among them, the glucuronide unit and the 18-α/β-stereoisomer were important factors. Among these compounds, 18α-glycyrrhetinic acid monoglucuronide (18α-GAMG) was found to exhibit strongest inhibition. Western blotting and immunofluorescence results showed that 18α-GAMG decreased the expression of iNOS, COX-2, and MAPKs, as well as the activation of NF-κB in the LPS-stimulated RAW264.7 cells. Overall, 18α-GAMG exerted its anti-inflammatory activity through the inhibition of NO generation as a result of inhibition of the NF-κB and MAPKs-related inflammatory signaling pathways. In addition, the in vivo results showed that 18α-GAMG could significantly improve the pathological changes of CCl4-induced hepatic fibrosis. Therefore, 18α-GAMG may be clinically useful for the reduction of inflammation in the future. [1]

C42H62O16

822.93

822.404

83896-44-0

158471

White to off-white solid powder

2.245

267.04

8

16

7

58

1730

19

CC1(C2CCC3(C(C2(CCC1OC4C(C(C(C(O4)C(=O)O)O)O)OC5C(C(C(C(O5)C(=O)O)O)O)O)C)C(=O)C=C6C3(CCC7(C6CC(CC7)(C)C(=O)O)C)C)C)C

LPLVUJXQOOQHMX-IOHDZAKGSA-N

InChI=1S/C42H62O16/c1-37(2)21-8-11-42(7)31(20(43)16-18-19-17-39(4,36(53)54)13-12-38(19,3)14-15-41(18,42)6)40(21,5)10-9-22(37)55-35-30(26(47)25(46)29(57-35)33(51)52)58-34-27(48)23(44)24(45)28(56-34)32(49)50/h16,19,21-31,34-35,44-48H,8-15,17H2,1-7H3,(H,49,50)(H,51,52)(H,53,54)/t19-,21+,22+,23+,24+,25+,26+,27-,28+,29+,30-,31-,34+,35+,38-,39+,40+,41-,42-/m1/s1

(2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4S,5S,6S)-2-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,11S,12aS,14aR,14bS)-11-carboxy-4,4,6a,6b,8a,11,14b-heptamethyl-14-oxo-2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14a-dodecahydro-1H-picen-3-yl]oxy]-6-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid

alpha-Glycyrrhizin; 83896-44-0; 18alpha-Glycylrrhizin; Isoglycyrrhizinic acid; 18; A-Glycyrrhizic acid; (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4S,5S,6S)-2-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,11S,12aS,14aR,14bS)-11-carboxy-4,4,6a,6b,8a,11,14b-heptamethyl-14-oxo-2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14a-dodecahydro-1H-picen-3-yl]oxy]-6-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid; 80ARS2076G;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Typically soluble in DMSO (e.g. 10 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。