FaX-IN-1   中文名称: 阿哌沙班中间体C

FaX

体外抗凝血活性[1]
通过使用人和兔血浆在体外评估所有目标化合物的抗凝血活性。结果以凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）表示。PT测量化合物对凝血外在途径的影响，而APTT代表对内在途径的影响。结果以EC2x值表示，并总结在表1中。表1中的EC2x值是至少三个独立实验的平均值

如表1所示，大多数目标化合物表现出中等至优异的活性，EC2x值为30至0.5μM，其中化合物14a（PT=0.5，APTT=0.8）、16（PT=0.8，APTT=1.9）、18c（PT=1.0，APTT=2.3）、26c（PT=1.1，APTT=4.4）、35a（PT=0.9，APTT=0.9）和35b（PT=0.9APTT=1.1）的活性与阿哌沙班（PT=0.8APTT=0.9）相当。特别是，化合物14a是这些系列中进一步研究的最有力候选者。此外，兔和人血浆中的抗凝血活性是相关的

在C-3吡唑位置的研究过程中，如表1所示，14a（PT=0.5，APTT=0.8）与未取代的1,2,4-三唑显示出优异的抗凝血活性。不幸的是，甲氧基位置的不同吸电子基团（EWG）明显降低了活性。抗凝活性的顺序为-OCH3（14a）>-F（14d）>-OCHF2（14c）>-Cl（14e）>-OCF3（14b）>-Br（14f），表明甲氧基作为P1配体中的供电子基团（EDG）的重要性

在比较异构体15和16时，观察到2-N-甲基和1-N-甲基在抗凝血活性方面存在显著差异。通过从N-甲基位置切换到C-甲基位置，通过将5-C-甲基引入1,2,4-三唑中制备18a。18a的活性介于化合物15和16之间（16>18a>15）。随后，在5-C下合成了一系列具有不同取代基的衍生物18b–18e。除了化合物18c与叔丁基（PT=1.0，APTT=2.3）外，它们的抗凝血效力降低，表明5-C取代的EDG和空间效应是不可忽视的因素

还合成了化合物21a-21d，通过添加碱性亲水基团来增加亲水性或溶解度。所有这些都显示出效力下降。为了增加氢键作用，将5-氧代取代的1,2,4-三唑与4-N-苯基引入C-3吡唑中，得到化合物23a、23b和23c。药理学数据表明，活性完全丧失（PT>12，APTT>20）。对此的一个合理解释是，引入大基团产生的空间位阻影响了活性

进一步研究了不同含氮杂环化合物对C-3吡唑的影响。化合物26a、26b和26c是用碱性取代的吡咯部分合成的。生物数据显示，化合物26c（PT=1.1，APTT=2.4）、26a（PT=1.5，APTT=3.5）和26b（PT=1.6，APTT=4.7）具有很高的抗凝血活性

如表1所示，将二氢咪唑和四氢嘧啶基团引入疏水袋（P4区）可以提高抗凝血活性，如化合物35a（PT=0.9，APTT=0.9）和35b（PT=0.8，APTT=1.1）。关于P4部分的更多研究正在进行中

基于表1中EC2x值的SAR表明，P2中含氮杂环的氢键作用和大小以及P4中的亲脂性区域是抗凝血活性的原因。

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体外FXa酶测定和体内抗血栓作用[1]
根据抗凝血效力，如表1所示，六种受试化合物14a、16、18c、26c、35a和35b显示出优异的抗凝血活性。因此，如表2所示，这些化合物在IC50值下对人FXa进行了体外测试。图4和图5分别总结了表示抑制百分比的拟合曲线和详述14a和35b IC50值的曲线。其中化合物14a对人FXa的活性最强，IC50值为0.15μM，在大鼠静脉血栓形成试验中抑制率为99%，优于阿哌沙班。

体内抗血栓作用[1]
根据抗凝血效力，如表1所示，六种受试化合物14a、16、18c、26c、35a和35b显示出优异的抗凝血活性。因此，如表2所示，这些化合物以IC50值在体内对大鼠静脉血栓形成进行了测试。图4和图5分别总结了表示抑制百分比的拟合曲线和详述14a和35b IC50值的曲线。其中化合物14a对人FXa的活性最强，IC50值为0.15μM，在大鼠静脉血栓形成试验中抑制率为99%，优于阿哌沙班。

体外凝血试验[1]
使用市售试剂盒测量PT和APTT。血液取自健康的人类志愿者或兔子，用3.8%的柠檬酸钠抗凝。在2000g离心10分钟后获得血浆。在DMSO中制备抑制剂的初始储备溶液。随后进行了稀释。使用对照血浆和含有5至7种不同浓度抑制剂的血浆测定凝血时间。根据试剂说明书，在温度控制的自动凝血装置中使用凝血酶-S试剂盒进行PT测量。每种血浆浓度的测定一式两份

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体外人FXa抑制试验[1]
在96孔微量滴定板上使用显色底物评估了六种受试化合物对人FXa的强效抑制活性。人因子Xa的酶促作用是通过转化FXa特异性的显色底物来测量的。FXa从显色底物中裂解对硝基苯胺（表4）。

In vivo experimental vein thrombosis [1]
Vein thrombosis was induced according to Reyers et al.25 with modifications. Briefly, the animals were anesthetized with pentobarbital (40 mg/kg, ip) and the abdomen was opened. The venacava inferior was carefully separated from surrounding tissues and ligated tightly with a cotton thread just below the left renal vein. The abdomen was then closed with a double layer of sutures. After 2 h, the abdomen was reopened, and the vena cava was dissected longitudinally and the formed thrombus was removed. The obtained thrombi were kept at 37 °C for 24 h and after this time, their dry weight was measured.

[1]. Design, synthesis, and structure-activity relationship of novel and effective apixaban derivatives as FXa inhibitors containing 1,2,4-triazole/pyrrole derivatives as P2 binding element. Bioorg Med Chem. 2016 Nov 1;24(21):5646-5661.

Four series of novel and potent FXa inhibitors possessing the 1,2,4-triazole moiety and pyrrole moiety as P2 binding element and dihydroimidazole/tetrahydropyrimidine groups as P4 binding element were designed, synthesized, and evaluated for their anticoagulant activity in human and rabbit plasma in vitro. Most compounds showed moderate to excellent activity. Compounds 14a, 16, 18c, 26c, 35a, and 35b were further examined for their inhibition activity against human FXa in vitro and rat venous thrombosis in vivo. The most promising compound 14a, with an IC50 (FXa) value of 0.15μM and 99% inhibition rate, was identified for further evaluation as an FXa inhibitor.[1]

In this study, four series of novel potent FXa inhibitors based on apixaban were designed and synthesized. The pharmacological data indicated that several compounds (14a, 16, 18c, 26c, 35a, and 35b) exhibited moderate to excellent anticoagulant potency in human and rabbit plasma in vitro. The SARs, based on the EC2x values shown in Table 1, showed that the hydrogen bond action and size of the nitrogenous heterocyclic in P2 and the lipophilic region in P4 were responsible for the anticoagulant activity. Eventually, compound 14a possessing a novel scaffold was selected for further exploration owing to its pronounced enzymatic anticoagulant activity with an IC50 value of 0.15 μM in vitro and 99% inhibition rate in rat venous thrombosis test in vivo. The docking model indicated that compound 14a formed a hydrogen bond with Glu146, and 1,2,4-triazole provided a much more suitable size (5-membered triazole ring) accommodating the position of P2 compared with apixaban. [1]

C27H28N4O5

488.54

488.205

503614-91-3

22240488

Solid powder

1.3±0.1 g/cm3

758.7±60.0 °C at 760 mmHg

412.6±32.9 °C

0.0±2.6 mmHg at 25°C

1.658

2.47

93.97

0

6

7

36

808

0

CCOC(C1=NN(C2C=CC(OC)=CC=2)C2C(N(C3C=CC(N4CCCCC4=O)=CC=3)CCC1=2)=O)=O

PULNLYVCJSOXKS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H28N4O5/c1-3-36-27(34)24-22-15-17-30(19-9-7-18(8-10-19)29-16-5-4-6-23(29)32)26(33)25(22)31(28-24)20-11-13-21(35-2)14-12-20/h7-14H,3-6,15-17H2,1-2H3

ethyl 1-(4-methoxyphenyl)-7-oxo-6-[4-(2-oxopiperidin-1-yl)phenyl]-4,5-dihydropyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxylate

503614-91-3; ethyl 1-(4-methoxyphenyl)-7-oxo-6-(4-(2-oxopiperidin-1-yl)phenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxylate; 1-(4-Methoxyphenyl)-7-oxo-6-[4-(2-oxopiperidin-1-yl)phenyl]-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxylic acid ethyl ester; Apixaban Impurity 9; APIXABAN V; ethyl 1-(4-methoxyphenyl)-7-oxo-6-[4-(2-oxopiperidin-1-yl)phenyl]-4,5-dihydropyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxylate; Apixaban Ethyl Ester; MFCD18072444;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。