QC-01–175

CRBN; A152T and P301L mutant tau protein

Tauopathies是一种神经退行性疾病，其特征是tau蛋白积累的异常形式导致局灶性脑区神经元死亡。与病理性tau结合的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂用于诊断，但目前还没有消除这些tau物种的疗法。我们采用靶向蛋白质降解技术将tau PET探针转化为致病性tau的功能性降解物。杂双功能分子QC-01-175被设计为与tau和Cereblon（CRBN）结合，CRL4CRBN是E3泛素连接酶的底物受体，可触发tau泛素化和蛋白酶体降解。QC-01-175在额颞叶痴呆（FTD）患者衍生的神经元细胞模型中影响tau的清除，对健康对照神经元的tau影响最小，表明对疾病相关形式的特异性。QC-01-175还拯救了FTD神经元的应激脆弱性，通过表型复制CRISPR介导的MAPT敲除。这项工作表明，FTD患者来源的神经元中的异常tau易于靶向降解，代表了治疗学的重要进展。[1]

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Tau降解缓解ALS SNs诱导的线粒体形态改变[2]
为了确定减少tau是否可以挽救线粒体形态，在用对照或ALS衍生的SN治疗后，使用一种新型双功能tau降解剂QC-01-175来降低SH-SY5Y细胞中的pTau-S396水平，该降解剂能够将tau募集到E3泛素连接酶CRL4CRBN，导致其被蛋白酶体降解[36]。为了确定能够降低pTau-S396水平的QC-01-175的有效剂量和治疗时间，SH-SY5Y细胞在用ALS SN（10 ng/mL/24h）治疗后，首先用1或10μM的QC-01-175治疗2、4和24小时。虽然1μM QC-01-175对pTau-S396水平没有影响，但与载体处理的细胞相比，10μM的降解剂在4小时后降低了ALS-SNs处理细胞中的pTau-S396-，并且在相同浓度下24小时后没有这种影响（图6a，b）。因此，在通过蛋白质印迹评估pTau-S396水平之前，先用ALS SNs（10 ng/mL/24h）处理SH-SY5Y细胞，然后用QC-01-175（10μM）处理4小时。结果显示，与ALS SNs处理的细胞相比，ALS SNs+QC-01-175（10μM）中pTau-S396水平显著降低（图6c）。

对于线粒体形态评估，SH-SY5Y细胞用重组tau或来源于对照和ALS mCTX的SN（10 ng/mL/24h）处理，然后用QC-01-175（10μM/4h）处理，再评估线粒体形态参数（图7a）。与之前的实验一样，与载体和对照SNs处理的细胞相比，重组tau和ALS SNs处理显著缩短了线粒体长度和体积。重要的是，用QC-01-175降解tau可以逆转重组tau和ALS SNs对线粒体形态的影响。具体而言，与ALS SNs处理的细胞相比，ALS SNs+QC-01-175中较小的线粒体更少，较大的线粒体更多（图7b，c）。此外，使用QC-01-175选择性降解tau可以防止重组tau和ALS SN诱导的线粒体长度和体积改变，因为用tau或ALS SN治疗导致QC-01-175治疗后更小的线粒体（长度<2μm，体积<2μm3）减少（补充图7a-b）。最后，与ALS SNs处理的细胞相比，ALS SNs+QC-01-175中有更多更大的线粒体（体积>8μm3）（补充图7b）。

线粒体网络分析显示，与之前的实验类似，总网络/细胞的数量没有变化（图7d）。虽然ALS SNs诱导的大网络/细胞或线粒体分支长度的数量减少，但在ALS SNs+QC-01-175中没有观察到这种减少（图7e，f）。尽管与ALS SNs治疗相比，QC-01-175治疗使大型网络的数量增加了一倍多，但这种保护作用没有达到统计学意义。

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Tau降解可防止ALS SNs诱导的活性氧物种增加[2]
鉴于ALS SNs治疗会增加氧化应激，并且QC-01-175改善线粒体形态，我们接下来试图确定QC-01-175治疗是否也能减轻ALS SNs引起的氧化应激。SH-SY5Y细胞用重组tau或来源于对照和ALS mCTX的SN处理（10 ng/mL/24 h），然后用QC-01-175处理（10μM/4h），然后使用CellROX（一种用于测量活细胞氧化应激的荧光探针）评估ROS水平（图8a）。安霉素A（25μM/30min）用作阳性对照（补充图8）。与之前的结果类似，与载体和对照SNs治疗的细胞相比，重组tau和ALS SNs治疗诱导了ROS水平的增加（图8b）。重要的是，与重组tau和ALS SN处理的细胞相比，重组tau+QC-01-175和ALS SNs+QC-01-175处理的细胞中的ROS水平显著降低（图8b），表明tau特异性清除可以缓解氧化应激。

QC-01-175治疗[2]
QC-01-175是使用靶向蛋白质降解技术设计的，用于识别tau和Cereblon（CRBN），后者是E3泛素连接酶的底物受体，以特异性诱导致病性tau泛素化和降解。SH-SY5Y细胞在用对照或ALS SNs（10 ng/mL/24小时）处理后，用1或10μMQC-01-175处理2、4和24小时。进行蛋白质印迹实验，通过评估pTau-S396水平来验证QC-01-175的效率。如前所述，在用重组tau蛋白（10 ng/mL）或来源于对照组（n=3）和ALS mCTX（n=3）的SN处理24小时，然后暴露于QC-01-175（10μM）4小时的SH-SY5Y细胞中测量线粒体形态参数。

神经元应激和存活率测定[1]
应力脆弱性分析如前所述进行（Silva等人，2016）（图7B）。以96孔板型对NPC进行镀层和分化，持续8周。将QC-01-175、QC-03-075或载体（DMSO）直接加入培养基（100μL）中，使终浓度达到5μM，并在37°C下孵育8小时。然后，用10μM淀粉样β蛋白（1-42，或单独使用载体）处理每个孔，再孵育16小时。24小时后，根据制造商的说明，用Alamar Blue Cell存活率试剂测量存活率。在EnVision Multilabel平板阅读器中读取读数。

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样品制备TMT LC-MS3质谱[1]
分化6周的A152T神经元用DMSO载体、1µM降解剂QC-01-175或1µM阴性对照QC-03-075生物三份处理4小时，或用10µM MLN4924预处理30分钟，然后添加1µM QC-01-1753.5小时，作为生物复制品。在PBS中洗涤神经元细胞，并在3000g离心下收集。将裂解缓冲液（8 M尿素、50 mM NaCl、50 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（EPPS）pH 8.5）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂加入细胞颗粒中，并通过21号（1.25英寸长）针进行20次均质化，以获得蛋白质浓度在0.25-2 mg/mL之间的细胞裂解液。

[1]. Targeted degradation of aberrant tau in frontotemporal dementia patient-derived neuronal cell models. Elife. 2019 Mar 25;8:e45457.

[2]. Targeting Tau Mitigates Mitochondrial Fragmentation and Oxidative Stress in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Mol Neurobiol. 2022 Jan;59(1):683-702.

Potential off-target binding for the bifunctional molecule QC-01-175 could be mediated by either the tau-binding moiety, derived from T807, or by the CRBN ligand, in this case derived from pomalidomide (Figure 1C I). To address the first hypothesis, we tested the well-known off-target activity against monoamine oxidase-B (MAO-B) and monoamine oxidase-A (MAO-A) (Lemoine et al., 2018, Vermeiren et al., 2018) by implementing an in vitro MAO inhibition assay (relocated Figure 1—figure supplement 2), which revealed that QC-01-175 showed significantly reduced inhibition of MAO relative to T807. To address pomalidomide off-target engagement, as well as overall QC-01-175 effect on the global proteome, we employed multiplexed MS-based proteomics. Upon 4 h treatment with QC-01-175, the only significant changes observed comprise the validated immune-modulatory drug (IMiD) targets ZFP91, ZNF653 and ZNF827 (Donovan et al., 2018), while no QC-01-175 specific off-targets were observed (see Figure 6, and the Results subsection “Evaluation of degrader specificity in neurons”). We have also done this analysis upon 24 h treatment (not included) and the results were very similar with the same three IMiD targets showing the largest and only off-target significant effect (after tau). Future work to avoid IMiD target effect is now discussed in the third paragraph of the Discussion section.
Also, one cannot exclude other interactions by QC-01-175 that do not alter protein levels but modulate function and enzymatic activity. This is a very relevant and complex point that is brought up again in the Discussion section, where potential challenges for in vivo and clinical applications are discussed. [1]

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Collectively, our results in a large cohort of human post-mortem mCTX suggest that hyperphosphorylated tau at S396 may underlie mitochondrial fragmentation in ALS by interacting with the pro-fission GTPase DRP1. Lastly, our data provide the groundwork to assess QC-01-175 as a novel potential therapeutic strategy to improve mitochondrial morphology and function, and, in turn, motor neuron survival in ALS. [2]

C33H34N6O7

626.66

626.248

C, 63.25; H, 5.47; N, 13.41; O, 17.87

2267290-96-8

139593563

Light yellow to yellow solid powder

2

172

4

9

14

46

1140

0

O=C1C(CCC(N1)=O)N1C(C2C=CC=C(C=2C1=O)NCCOCCOCCNC(CCC1C=CC2C3C=NC=CC=3NC=2C=1)=O)=O

NWTCZTAQSRLSCP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H34N6O7/c40-28(8-5-20-4-6-21-23-19-34-11-10-24(23)37-26(21)18-20)36-13-15-46-17-16-45-14-12-35-25-3-1-2-22-30(25)33(44)39(32(22)43)27-7-9-29(41)38-31(27)42/h1-4,6,10-11,18-19,27,35,37H,5,7-9,12-17H2,(H,36,40)(H,38,41,42)

N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]-3-(5H-pyrido[4,3-b]indol-7-yl)propanamide

QC-01 C175; 2267290-96-8; QC-01-175; CHEMBL4465176;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。