QC-01–175

CRBN; A152T and P301L mutant tau protein

Tauopathies是一种神经退行性疾病，其特征是tau蛋白积累的异常形式导致局灶性脑区神经元死亡。与病理性tau结合的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂用于诊断，但目前还没有消除这些tau物种的疗法。我们采用靶向蛋白质降解技术将tau PET探针转化为致病性tau的功能性降解物。杂双功能分子QC-01-175被设计为与tau和Cereblon（CRBN）结合，CRL4CRBN是E3泛素连接酶的底物受体，可触发tau泛素化和蛋白酶体降解。QC-01-175在额颞叶痴呆（FTD）患者衍生的神经元细胞模型中影响tau的清除，对健康对照神经元的tau影响最小，表明对疾病相关形式的特异性。QC-01-175还拯救了FTD神经元的应激脆弱性，通过表型复制CRISPR介导的MAPT敲除。这项工作表明，FTD患者来源的神经元中的异常tau易于靶向降解，代表了治疗学的重要进展。[1]

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Tau降解缓解ALS SNs诱导的线粒体形态改变[2]
为了确定减少tau是否可以挽救线粒体形态，在用对照或ALS衍生的SN治疗后，使用一种新型双功能tau降解剂QC-01-175来降低SH-SY5Y细胞中的pTau-S396水平，该降解剂能够将tau募集到E3泛素连接酶CRL4CRBN，导致其被蛋白酶体降解[36]。为了确定能够降低pTau-S396水平的QC-01-175的有效剂量和治疗时间，SH-SY5Y细胞在用ALS SN（10 ng/mL/24h）治疗后，首先用1或10μM的QC-01-175治疗2、4和24小时。虽然1μM QC-01-175对pTau-S396水平没有影响，但与载体处理的细胞相比，10μM的降解剂在4小时后降低了ALS-SNs处理细胞中的pTau-S396-，并且在相同浓度下24小时后没有这种影响（图6a，b）。因此，在通过蛋白质印迹评估pTau-S396水平之前，先用ALS SNs（10 ng/mL/24h）处理SH-SY5Y细胞，然后用QC-01-175（10μM）处理4小时。结果显示，与ALS SNs处理的细胞相比，ALS SNs+QC-01-175（10μM）中pTau-S396水平显著降低（图6c）。

对于线粒体形态评估，SH-SY5Y细胞用重组tau或来源于对照和ALS mCTX的SN（10 ng/mL/24h）处理，然后用QC-01-175（10μM/4h）处理，再评估线粒体形态参数（图7a）。与之前的实验一样，与载体和对照SNs处理的细胞相比，重组tau和ALS SNs处理显著缩短了线粒体长度和体积。重要的是，用QC-01-175降解tau可以逆转重组tau和ALS SNs对线粒体形态的影响。具体而言，与ALS SNs处理的细胞相比，ALS SNs+QC-01-175中较小的线粒体更少，较大的线粒体更多（图7b，c）。此外，使用QC-01-175选择性降解tau可以防止重组tau和ALS SN诱导的线粒体长度和体积改变，因为用tau或ALS SN治疗导致QC-01-175治疗后更小的线粒体（长度<2μm，体积<2μm3）减少（补充图7a-b）。最后，与ALS SNs处理的细胞相比，ALS SNs+QC-01-175中有更多更大的线粒体（体积>8μm3）（补充图7b）。

线粒体网络分析显示，与之前的实验类似，总网络/细胞的数量没有变化（图7d）。虽然ALS SNs诱导的大网络/细胞或线粒体分支长度的数量减少，但在ALS SNs+QC-01-175中没有观察到这种减少（图7e，f）。尽管与ALS SNs治疗相比，QC-01-175治疗使大型网络的数量增加了一倍多，但这种保护作用没有达到统计学意义。

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Tau降解可防止ALS SNs诱导的活性氧物种增加[2]
鉴于ALS SNs治疗会增加氧化应激，并且QC-01-175改善线粒体形态，我们接下来试图确定QC-01-175治疗是否也能减轻ALS SNs引起的氧化应激。SH-SY5Y细胞用重组tau或来源于对照和ALS mCTX的SN处理（10 ng/mL/24 h），然后用QC-01-175处理（10μM/4h），然后使用CellROX（一种用于测量活细胞氧化应激的荧光探针）评估ROS水平（图8a）。安霉素A（25μM/30min）用作阳性对照（补充图8）。与之前的结果类似，与载体和对照SNs治疗的细胞相比，重组tau和ALS SNs治疗诱导了ROS水平的增加（图8b）。重要的是，与重组tau和ALS SN处理的细胞相比，重组tau+QC-01-175和ALS SNs+QC-01-175处理的细胞中的ROS水平显著降低（图8b），表明tau特异性清除可以缓解氧化应激。

QC-01-175治疗[2]
QC-01-175是使用靶向蛋白质降解技术设计的，用于识别tau和Cereblon（CRBN），后者是E3泛素连接酶的底物受体，以特异性诱导致病性tau泛素化和降解。SH-SY5Y细胞在用对照或ALS SNs（10 ng/mL/24小时）处理后，用1或10μMQC-01-175处理2、4和24小时。进行蛋白质印迹实验，通过评估pTau-S396水平来验证QC-01-175的效率。如前所述，在用重组tau蛋白（10 ng/mL）或来源于对照组（n=3）和ALS mCTX（n=3）的SN处理24小时，然后暴露于QC-01-175（10μM）4小时的SH-SY5Y细胞中测量线粒体形态参数。

神经元应激和存活率测定[1]
应力脆弱性分析如前所述进行（Silva等人，2016）（图7B）。以96孔板型对NPC进行镀层和分化，持续8周。将QC-01-175、QC-03-075或载体（DMSO）直接加入培养基（100μL）中，使终浓度达到5μM，并在37°C下孵育8小时。然后，用10μM淀粉样β蛋白（1-42，或单独使用载体）处理每个孔，再孵育16小时。24小时后，根据制造商的说明，用Alamar Blue Cell存活率试剂测量存活率。在EnVision Multilabel平板阅读器中读取读数。

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样品制备TMT LC-MS3质谱[1]
分化6周的A152T神经元用DMSO载体、1µM降解剂QC-01-175或1µM阴性对照QC-03-075生物三份处理4小时，或用10µM MLN4924预处理30分钟，然后添加1µM QC-01-1753.5小时，作为生物复制品。在PBS中洗涤神经元细胞，并在3000g离心下收集。将裂解缓冲液（8 M尿素、50 mM NaCl、50 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（EPPS）pH 8.5）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂加入细胞颗粒中，并通过21号（1.25英寸长）针进行20次均质化，以获得蛋白质浓度在0.25-2 mg/mL之间的细胞裂解液。

[1]. Targeted degradation of aberrant tau in frontotemporal dementia patient-derived neuronal cell models. Elife. 2019 Mar 25;8:e45457.

[2]. Targeting Tau Mitigates Mitochondrial Fragmentation and Oxidative Stress in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Mol Neurobiol. 2022 Jan;59(1):683-702.

双功能分子QC-01-175的潜在脱靶结合可能由源自T807的tau蛋白结合部分或源自泊马度胺的CRBN配体介导（图1C I）。为了验证第一个假设，我们通过体外MAO抑制实验（图1-图补充2）检测了其对单胺氧化酶B (MAO-B) 和单胺氧化酶A (MAO-A) 的已知脱靶活性（Lemoine等人，2018；Vermeiren等人，2018）。结果表明，与T807相比，QC-01-175对MAO的抑制作用显著降低。为了研究泊马度胺的脱靶效应以及QC-01-175对整体蛋白质组的影响，我们采用了基于多重质谱的蛋白质组学方法。QC-01-175处理4小时后，观察到的唯一显著变化是已验证的免疫调节药物（IMiD）靶点ZFP91、ZNF653和ZNF827（Donovan等人，2018），而未观察到QC-01-175特异性的脱靶效应（见图6和“结果”小节“神经元中降解剂特异性的评估”）。我们还进行了24小时处理后的分析（未包含在内），结果非常相似，相同的三个IMiD靶点显示出最大且唯一的显著脱靶效应（tau蛋白除外）。避免IMiD靶点效应的未来研究将在“讨论”部分的第三段中进行探讨。此外，也不能排除QC-01-175可能通过其他途径与线粒体相互作用，这些相互作用不会改变蛋白质水平，但会调节线粒体功能和酶活性。这是一个非常重要且复杂的问题，我们在讨论部分再次提及，其中探讨了体内和临床应用可能面临的挑战。[1]

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总的来说，我们对大量人类死后线粒体细胞碎片（mCTX）样本的研究结果表明，S396位点过度磷酸化的tau蛋白可能通过与促分裂GTP酶DRP1相互作用，导致ALS中的线粒体断裂。最后，我们的数据为评估QC-01-175作为一种潜在的新型治疗策略奠定了基础，该策略有望改善线粒体的形态和功能，进而提高ALS患者的运动神经元存活率。[2]

C33H34N6O7

626.66

626.248

C, 63.25; H, 5.47; N, 13.41; O, 17.87

2267290-96-8

139593563

Light yellow to yellow solid powder

2

172

4

9

14

46

1140

0

O=C1C(CCC(N1)=O)N1C(C2C=CC=C(C=2C1=O)NCCOCCOCCNC(CCC1C=CC2C3C=NC=CC=3NC=2C=1)=O)=O

NWTCZTAQSRLSCP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H34N6O7/c40-28(8-5-20-4-6-21-23-19-34-11-10-24(23)37-26(21)18-20)36-13-15-46-17-16-45-14-12-35-25-3-1-2-22-30(25)33(44)39(32(22)43)27-7-9-29(41)38-31(27)42/h1-4,6,10-11,18-19,27,35,37H,5,7-9,12-17H2,(H,36,40)(H,38,41,42)

N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]-3-(5H-pyrido[4,3-b]indol-7-yl)propanamide

QC-01 C175; 2267290-96-8; QC-01-175; CHEMBL4465176;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。