Muscle homing peptide M12

Proteins on the surface of muscle cells

M12介导体外肌母细胞对NPs的细胞摄取增强[2]
为了评估PLGA-PEG- m12 NPs对肌肉细胞的活性靶向性，我们使用荧光显微镜检测了C2C12成肌细胞对PLGA-PEG NPs和PLGA-PEG- m12 NPs的体外细胞摄取。C2C12细胞用PLGA-PEG NPs或PLGA-PEG- m12 NPs包封尼罗河红荧光染料孵育，以方便可视化。如图2A所示，孵育1 h后，细胞质内和细胞核周围检测到分散良好的红色荧光信号，这表明PLGA-PEG NPs已被C2C12细胞迅速吸收。NP表面的负电荷导致粒子间的排斥，从而防止团聚和稳定NP在细胞内的分散。与PLGA-PEG- m12 NPs孵育C2C12细胞时，与PLGA-PEG NP处理相比，细胞内红色荧光强度显著增强，表明PLGA-PEG- m12 NPs被C2C12细胞内化的程度大于非靶向NPs。定量分析显示，表面处理后NPs的细胞摄取效率增加了2.44倍，M12。

为了进一步验证PLGA-PEG-M12 NPs与C2C12成肌细胞表面受体之间的特异性相互作用，我们进行了竞争结合实验，在用PLGA-PEG-M12 NPs处理C2C12细胞之前，用浓度为50 μM的自由<强>M12溶液预孵育C2C12细胞，以饱和细胞表面的受体。我们的研究结果显示，与单独使用PLGA-PEG-M12 NPs孵育相比，游离M12预处理后的细胞内红色荧光强度显著降低（p≤0.001），这表明由于与游离M12的配体竞争，PLGA-PEG-M12 NPs与C2C12细胞中受体的相互作用以及随后的<强>M12受体介导的内吞作用受到抑制。相比之下，M12预孵育不影响PLGA-PEG NPs的细胞内化（p > 0.05）。我们还研究了3T3-L1前脂肪细胞对NPs的细胞摄取，以证实M12受体在肌肉细胞中的特异性。如图2A和2C所示，在3T3-L1细胞中既没有观察到细胞摄取增强，也没有观察到结合抑制。这些数据支持与非特异性内化相比，M12在体外介导成肌细胞对NPs的更有效的细胞摄取。 除了M12对小鼠C2C12成肌细胞和肌纤维的靶向能力外，我们的初步验证数据还表明，M12对人骨骼肌成肌细胞具有很高的结合亲和力（Supplementary Figure S1），这表明目标表位可能也存在于人类肌肉中。为了研究PLGA-PEG- m12 NPs是否能够实现对人类细胞的主动靶向，我们随后检测了PLGA-PEG NPs和PLGA-PEG- m12 NPs在人骨骼肌母细胞中的体外细胞摄取。与C2C12实验的结果类似，在两个处理组的细胞质中都检测到尼罗红包被NPs产生的分散良好的红色荧光信号，表明NPs在人骨骼肌成细胞中被快速摄取（图2D）。与PLGA-PEG NPs相比，PLGA-PEG-M12 NPs的孵育导致细胞内化显著增加，这表明M12介导了NP向人体肌肉细胞的传递。

---

将VO-OHpic封装至PLGA-PEG-M12纳米颗粒可实现PTEN信号通路的持续抑制且无体外细胞毒性[2]
通过蛋白质印迹分析检测了VO-OHpic对PTEN信号通路（包括PTEN、AKT及核糖体S6激酶蛋白水平）的影响。AKT与核糖体S6激酶是PTEN信号通路的下游靶点，抑制PTEN信号会导致磷酸化AKT（pAKT）和磷酸化S6（pS6）的激活[27]。结果显示，10 μM浓度的游离VO-OHpic或VO-OHpic封装的PLGA-PEG-M12 NPs处理均未引起PTEN蛋白水平的显著变化（附图S2），但显著上调了pAKT（p ≤ 0.005）和pS6（p ≤ 0.001）的表达，表明PTEN酶活性被有效抑制（图4A-4C）。由于细胞活性的限制，我们未能评估更长时间点的效果。当细胞与载药NPs孵育12小时时，pAKT和pS6表达水平持续升高。值得注意的是，载药NPs诱导的pAKT上调（p ≤ 0.001）比游离药物组更显著，这可能归因于NPs增强了向成肌细胞的细胞内递送。当NPs孵育时间延长至24小时，pAKT（p ≤ 0.05）和pS6（p ≤ 0.001）蛋白水平仍持续上调，表明载药NPs实现了PTEN信号通路的高效持续抑制。[2]

通过MTS实验检测了游离VO-OHpic及载药PLGA-PEG-M12 NPs对C2C12成肌细胞的细胞毒性。将C2C12细胞与游离药物或载药NPs分别孵育12、24和48小时后，结果以溶剂对照组标准化。研究发现，所用浓度的游离VO-OHpic会随时间推移导致细胞活性下降（图4D）。虽然处理前12小时内未检测到明显毒性，但孵育24小时和48小时后细胞活性分别显著降至64.78%（p ≤ 0.05）和45.73%（p ≤ 0.01）。相比之下，在相同药物浓度下，载药NPs处理组在整个培养期间均能良好维持细胞活性，表明VO-OHpic封装至PLGA-PEG-M12 NPs可显著提升PTEN抑制剂的安全性并保护肌细胞活性。此外，空白NPs处理组未观察到明显细胞毒性，证实M12偶联的NPs递送系统具有优异生物相容性。这些结果共同证明：将VO-OHpic封装至PLGA-PEG-M12 NPs可在无细胞毒性的前提下实现PTEN信号通路的高效抑制。

M12可促进纳米颗粒在体内全身给药后对骨骼肌的主动靶向[2]
为评估PLGA-PEG-M12纳米颗粒对体内骨骼肌的靶向效率，我们通过荧光光学成像系统观察了mdx小鼠静脉注射Alexa Fluor® 488标记纳米颗粒（AF488-PLGA-PEG NPs和AF488-PLGA-PEG-M12 NPs）后的生物分布。荧光染料AF488-NHS酯通过酰胺键与PLGA-PEG-NH2偶联，并按标准方案制备纳米颗粒。图3A展示了纳米颗粒注射时间线的实验设计。将浓度80 mg/kg的AF488-PLGA-PEG NPs或AF488-PLGA-PEG-M12 NPs生理盐水溶液经尾静脉注射至mdx小鼠体内。给药6小时后，AF488-PLGA-PEG-M12 NPs在整个后肢呈现强荧光信号，而非靶向NPs（AF488-PLGA-PEG NPs）在后肢肌肉组织仅有微量积累（图3B）。
全身成像后立即处死小鼠，解剖肝脏、肾脏、脾脏、心脏及骨骼肌等组织进行离体成像。如图3C所示，AF488-PLGA-PEG-M12 NPs的荧光信号特异性地出现在心脏和骨骼肌（包括股四头肌、腓肠肌和膈肌），尽管肝脏和肾脏因活跃代谢存在非特异性积累。非靶向AF488-PLGA-PEG NPs组则表现为全身各器官/组织的均匀分布，且骨骼肌荧光信号显著低于靶向组。该结果与全身成像结果一致，表明M12具有肌肉归巢特性。基于生物分布数据，我们量化了各骨骼肌群的荧光强度，并以机体主要代谢解毒器官肝脏的荧光强度进行标准化。与非靶向NPs相比，AF488-PLGA-PEG-M12 NPs组心脏、股四头肌、腓肠肌和膈肌的荧光强度比值分别提高了1.23、1.69、2.31和1.91倍（图3D），其中腓肠肌的组间差异具有统计学意义（p ≤ 0.05）。数据表明M12偶联可选择性增强纳米颗粒在肌肉组织的定位，同时减少脱靶器官的非预期积累。
为进一步确定纳米颗粒在组织内的分布，我们对腓肠肌进行切片分析。如图3E所示，AF488-PLGA-PEG NPs组仅在肌肉切片的有限区域检测到绿色荧光信号。而AF488-PLGA-PEG-M12 NPs组的荧光信号强度和分布面积均显著增加，证实了M12介导的纳米颗粒在腓肠肌的聚集。定量分析进一步显示，与对照组相比，M12偶联NPs组肌肉切片总AF488荧光强度提升1.7倍（图3F，p ≤ 0.005）。值得注意的是，部分AF488-PLGA-PEG-M12 NPs在观察时间窗内已定位于肌纤维内部，而AF488-PLGA-PEG NPs组肌纤维内几乎无荧光信号（图3E）。定量结果显示，AF488-PLGA-PEG-M12 NPs组肌纤维内荧光强度较对照组高约2.1倍（图3G，p ≤ 0.01），提示M12可能促进纳米颗粒与肌纤维结合并穿透肌膜。然而，在注射后6小时的时间点，基底膜和肌膜仍对纳米颗粒形成显著递送屏障，大部分荧光NPs仍滞留在细胞外基质中。

细胞培养与纳米颗粒的细胞摄取[2]
C2C12成肌细胞、3T3-L1前脂肪细胞和人骨骼肌成肌细胞均在含10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素和链霉素）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为37°C、5% CO₂和95%相对湿度。
将C2C12成肌细胞、3T3-L1前脂肪细胞和人骨骼肌成肌细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于12孔板，培养24小时。PBS洗涤后，细胞与含尼罗红标记纳米颗粒（终浓度0.1 mg/mL）的DMEM孵育1小时。随后，用Hoechst 33342（1 μg/mL PBS）在37°C下染色细胞核10分钟，并用PBS反复洗涤以去除残留纳米颗粒和死细胞。荧光图像通过配备CoolSnap HQ电荷耦合相机的Leica DM 6000B显微镜（20倍物镜）采集。未处理纳米颗粒的细胞作为阴性对照。在竞争性抑制实验中，C2C12成肌细胞和3T3-L1前脂肪细胞预先与50 μM游离M12溶液在DMEM中孵育1小时（37°C），后续步骤同上。使用ImageJ软件通过扣除背景的积分光密度法量化校正后的总细胞荧光强度，每组分析三次独立重复实验的200-300个细胞。

---

PTEN下游靶标的蛋白质印迹分析[2]
将C2C12成肌细胞以每孔3×10⁴个细胞的密度接种于6孔板，培养24小时后，向培养基中加入游离VO-OHpic溶液或载药PLGA-PEG-M12 NPs悬液（VO-OHpic终浓度10 μM），继续培养12或24小时。仅用DMSO溶剂或未载药的空白PLGA-PEG-M12 NPs处理的细胞作为阴性对照。使用含25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠和0.1% SDS的RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白浓度通过Pierce BCA蛋白检测试剂测定。蛋白经SDS-PAGE分离后转印至聚偏二氟乙烯膜，室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后与一抗（5%牛奶稀释）4°C孵育过夜，再与二抗室温孵育1小时。所用一抗包括pAKT（1:2000稀释）、AKT（1:2000）、pS6（1:2000）、S6（1:2000）及β-肌动蛋白（1:5000）；HRP标记的二抗（抗兔/抗鼠IgG，1:10,000稀释）用于检测。采用化学发光增强试剂显影，信号通过FluorChem R成像系统采集。

---

细胞活性评估[2]
采用基于线粒体四唑盐转化的MTS法检测游离VO-OHpic或载药PLGA-PEG-M12 NPs处理后的体外细胞活性。将C2C12细胞以每孔1×10³个细胞的密度接种于96孔板，培养24小时后，分别加入空白NPs、载药NPs或游离VO-OHpic溶液（药物终浓度10 μM），继续培养12、24或48小时。每孔加入20 μL CellTiter 96® AQueous单溶液试剂（100 μL培养基中），于37°C、5% CO₂湿润环境中孵育2小时。使用Tecan Spark™ 10M酶标仪在490 nm波长处测定吸光度（680 nm扣除背景）。含0.1% Triton X-100的培养基处理细胞作为阳性对照，仅含DMSO溶剂的培养基处理细胞作为阴性对照。

将荧光标记的AF 488纳米颗粒（AF488-PLGA-PEG纳米颗粒或AF488-PLGA-PEG-M12纳米颗粒）以80 mg/kg体重的单剂量经尾静脉注射（静脉注射）至mdx小鼠体内。注射后6小时，腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠。去除小鼠双后肢的毛发，并使用未经任何处理的对照小鼠调整曝光参数，以避免背景自发荧光。使用Ami光学成像系统进行成像。全身扫描（注射后6小时）后，立即处死小鼠，并采集包括肝脏、肾脏、脾脏、心脏、股四头肌、腓肠肌和膈肌在内的多种组织，进行离体成像。使用Living Image软件分析荧光图像，并通过将肝脏的荧光强度除以各肌肉组织的荧光强度来量化肌肉与肝脏的荧光比值。 [2]

[1]. Nanomaterial for Skeletal Muscle Regeneration. Tissue Eng Regen Med. 2022 Apr;19(2):253-261.

[2]. Polymeric nanoparticles functionalized with muscle-homing peptides for targeted delivery of phosphatase and tensin homolog inhibitor to skeletal muscle. Acta Biomater. 2020 Dec:118:196-206.

骨骼肌具有内在的再生能力，能够在急性损伤后恢复其结构和功能。然而，在先天性肌营养不良、大面积肌肉萎缩、恶病质或衰老等情况下，骨骼肌再生能力的下降会导致肌肉萎缩和功能障碍。近期研究表明，由于骨骼肌体积庞大且位置特殊，其质量和功能与发病率和死亡率密切相关。然而，目前治疗神经肌肉疾病的选择有限。纳米技术等生物医学工程策略已被应用于解决这一问题。本文将重点介绍利用纳米材料进行骨骼肌再生的最新研究进展。我们研究骨骼肌病理，并描述了使用纳米材料的各种概念验证和临床前研究，重点关注纳米级材料如何根据其维度用于骨骼肌再生。由于纳米级材料具有不同的物理和生化特性，其应用也因维度而异。纳米材料已被视为满足再生医学未满足需求的理想候选材料。凭借其独特的特性，纳米材料可应用于多种组织和疾病。然而，当仅限于肌肉组织时，纳米材料的应用靶点有限，未来研究可以拓展其应用范围。[1]

---

磷酸酶和张力蛋白同源物 (PTEN) 会抑制肌肉生长和修复，抑制 PTEN 已被证明可以改善杜氏肌营养不良症 (DMD) 小鼠模型的病理生理学和营养不良性肌肉功能。然而，由于靶向谱广泛，传统的PTEN抑制剂药物递送方式存在较高的非肌肉器官脱靶副作用风险。本文报道了一种用于细胞特异性递送PTEN抑制剂的肌肉靶向纳米颗粒平台。聚乳酸-羟基乙酸共聚物-b-聚乙二醇纳米颗粒（NPs）经肌肉靶向肽M12功能化修饰，可促进体外和体内肌肉细胞/组织的选择性摄取。此外，该NPs的配方可缓慢释放PTEN抑制剂，避免药物直接暴露引起的细胞毒性，并实现对PTEN的持续抑制。这种利用聚合物纳米材料和肌肉靶向肽的先进递送方法，为DMD的长期治疗策略的开发开辟了新的途径。 [2] 药理学抑制磷酸酶和张力蛋白同源物 (PTEN) 已被证实能够改善杜氏肌营养不良症 (DMD) 小鼠模型的肌肉功能，但由于存在脱靶副作用的潜在风险，将这种方法转化为临床应用仍然面临挑战。本文中，我们开发了一种纳米颗粒平台，该平台由聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 和肌肉靶向肽 M12 组成，用于将 PTEN 抑制剂特异性递送至特定细胞。M12 可促进纳米颗粒在成肌细胞中的内化，并使其选择性定位于骨骼肌。此外，纳米颗粒缓慢释放的药物可降低其细胞毒性，并实现对 PTEN 的持续抑制。这种利用纳米材料和靶向肽的先进递送方法为 DMD 治疗的长期治疗策略的开发开辟了新的途径。[2]

C59H100N24O17

1417.58

1416.76982

2896181-32-9

172638599

L-arginyl-L-arginyl-L-glutaminyl-L-prolyl-L-prolyl-L-arginyl-L-seryl-L-isoleucyl-L-seryl-L-seryl-L-histidyl-L-proline; H-Arg-Arg-Gln-Pro-Pro-Arg-Ser-Ile-Ser-Ser-His-Pro-OH

RRQPPRSISSHP

Typically exists as solids at room temperature

-11.7

683 Ų

21

22

42

100

2930

13

CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N

DHODDTORTQRISO-OFONGQOJSA-N

InChI=1S/C59H100N24O17/c1-3-30(2)44(52(95)79-38(27-85)49(92)78-37(26-84)48(91)76-36(24-31-25-68-29-72-31)54(97)83-23-9-15-42(83)56(99)100)80-50(93)39(28-86)77-47(90)34(12-6-20-71-59(66)67)74-51(94)40-13-7-21-81(40)55(98)41-14-8-22-82(41)53(96)35(16-17-43(61)87)75-46(89)33(11-5-19-70-58(64)65)73-45(88)32(60)10-4-18-69-57(62)63/h25,29-30,32-42,44,84-86H,3-24,26-28,60H2,1-2H3,(H2,61,87)(H,68,72)(H,73,88)(H,74,94)(H,75,89)(H,76,91)(H,77,90)(H,78,92)(H,79,95)(H,80,93)(H,99,100)(H4,62,63,69)(H4,64,65,70)(H4,66,67,71)/t30-,32-,33-,34-,35-,36-,37-,38-,39-,40-,41-,42-,44-/m0/s1

(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid

Muscle homing peptide M12; Muscle homing peptide M-12;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。