HIF/hypoxia-inducible factor hydroxylase

核 HIF-1 对 TRC160334（100~400 μM；4 小时；Hep3B 细胞）的反应以剂量依赖性方式稳定 [1]。用 TRC160334（75~300 μM；4 小时）处理的 Hep3B 细胞表现出剂量依赖性 HIF-1 转录激活。 HIF 靶基因，包括肾上腺髓质素和 EPO，在 TRC160334 中以剂量依赖性方式表达 [1]。

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TRC160334治疗导致HIF激活[1]
TRC160334治疗导致Hep3B细胞中HIF-1α的剂量依赖性稳定（图2a），从而导致HIF的剂量依赖激活（图2b）。因此，用TRC160334处理的Hep3B细胞显示出HIF靶基因的剂量依赖性表达，如EPO（EC50 84µM）和肾上腺髓质素（EC50 91µM）（图2c，d）。

TRC160334（0.1 和 0.3 mg/kg；腹腔注射）显着降低血清肌酐和血尿素氮 [1]。 TRC160334（0.3 和 0.6 mg/kg；腹腔注射）显示出减少急性肾小管坏死的趋势[1]。 TRC160334 显着降低电解质排泄的剂量依赖性增加。与匹配的载体对照相比，TRC160334 缺血前治疗导致肾脏中 HSP70 显着诱导 6 小时，而 TRC160334 缺血后治疗导致肾脏中 HSP70 显着诱导 12 小时 [1]。

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TRC160334缺血前后治疗可改善缺血性AKI患者的肾功能[1]
缺血前和缺血后使用TRC160334治疗可显著改善肾功能。对于所有研究的参数，除非另有说明，否则TRC160334治疗的改善都是在其峰值效应水平上报告的，即第1天和/或第2天。在诱导肾缺血/再灌注（I/R；双侧肾动脉闭塞35分钟）后24小时，未经治疗的大鼠（赋形剂对照）的血清肌酐从基线水平显著增加（约7至8倍，峰值上升）。TRC160334治疗组的血清肌酐水平没有像对照组那样升高，TRC16034缺血前治疗剂量依赖性地降低了血清肌酐的升高。与赋形剂对照组大鼠相比，在最高剂量（TRC-0.3mg前）下，TRC160334在第1天和第2天分别显著降低了42%（p<0.01）和66%（p<0.05）的血清肌酐（图3a）。

同样，肾缺血发作后2小时开始的TRC160334缺血后治疗显著降低了血清肌酐水平。在最高剂量（TRC-0.6 mg后）下，与赋形剂对照组大鼠相比，TRC160334在第1天和第2天分别显著降低了23%（p<0.01）和71%（p<0.01）的血清肌酐（图3b）。

TRC160334缺血前治疗可剂量依赖性地降低升高的BUN水平。在最高剂量（TRC-0.3mg前）下，与赋形剂对照组大鼠相比，TRC160334在第1天和第2天分别显著降低了24%（p<0.05）和55%（p<0.05）的BUN（图3c）。

此外，在缺血后治疗的情况下，TRC160334剂量依赖性地降低了升高的BUN水平。在最高剂量（TRC-0.6 mg后）下，与赋形剂对照组大鼠相比，TRC160334在第1天和第2天分别显著降低了16%（p<0.01）和48%（p<0.01）的BUN（图3d）。

缺血性急性肾损伤的特征是存在少尿期和缺血后利尿期。未经治疗的大鼠表现出这两种特征，即24小时内为少尿期，48小时后为利尿剂。在缺血前和缺血后两种情况下服用TRC160334，剂量依赖性地消除了这种对尿量的影响，在最高剂量下，TRC16034治疗大鼠的尿量显著维持在缺血前水平（图4a，b）。

肾缺血导致电解质排泄分数显著增加，如钠（FeNa）排泄分数。缺血后24小时观察到FeNa的峰值升高。缺血前用TRC160334治疗显著降低了电解质排泄的增加，呈剂量依赖性。在第1天，最高剂量（TRC-0.3mg预处理）治疗的大鼠的FeNa减少了80%（p<0.05），在第2天，减少了72%（p<0.05）（图4c）。

同样，缺血后用TRC160334治疗也减少了电解质排泄的增加。在最高剂量（TRC-0.6 mg后）治疗的大鼠中，在第1天观察到FeNa减少59%（p<0.05），在第2天观察到FeNa减少79%（p<0.05）（图4d）。

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TRC160334缺血前后治疗可保护肾脏结构[1]
缺血再灌注损伤后，载体对照动物肾脏代表性HE切片的组织病理学检查显示中度急性肾小管坏死（ATN）；其特征为小管囊性扩张，小管扩张并失去刷状边界，肾小管细胞坏死，间质间隙扩大并伴有细胞浸润（图5a）。再灌注后7天的ATN评分显示，在用TRC160334（TRC-0.3mg预处理）进行缺血前治疗后，肾脏形态得到了更好的保护。TRC160334缺血前治疗显示肾脏组织学有显著改善。大多数肾小管和肾小管间质间隙显示轻度ATN（图5b，c）。与相应的载体相比，观察到用TRC160334（TRC-0.6 mg后）进行缺血后处理后形态保持的趋势。TRC160334缺血后治疗也显示ATN呈下降趋势（图5d，e）。

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TRC160334缺血前后治疗可诱导HSP70的产生[1]
通过免疫印迹法监测载体处理和TRC160334处理动物肾脏中EPO、肾上腺髓质素和HSP70的表达。发现EPO和肾上腺髓质素的表达在实验条件下不受影响。与相应的载体对照组相比，TRC160334缺血前治疗在6小时内显著诱导了肾脏中的HSP70（图6a），而TRC16034缺血后治疗在12小时内显著促进了肾脏中HSP70的诱导（图6b）。

Western Blot 分析[1]
细胞类型： Hep3B 细胞
测试浓度： 100~400 μM
孵育时间： 4 小时
实验结果：导致核 HIF-1 剂量依赖性稳定。

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HIF-α稳定化[1]
Hep3B细胞用载体或TRC-160334处理指定剂量4小时。然后制备核提取物，在SDS-PAGE上分离核蛋白，然后进行免疫印迹。用HIF-1α抗体检测免疫印迹。

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HIF交易激活[1]
Hep3B细胞瞬时转染HIF-1荧光素酶载体（pHIF1-Luc）和正常化载体β-半乳糖苷酶。转染的细胞用载体或TRC-160334按指定剂量处理4小时。然后制备细胞裂解物并分析萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。结果表示为HIF激活的倍数诱导超过载体对照。

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EPO的表达[1]
Hep3B细胞用载体或TRC-160334按指定剂量处理16小时。16小时后，收集细胞培养基并离心以去除任何碎片。通过ELISA分析获得的上清液中的EPO。结果表示为与载体对照相比的折叠诱导。

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肾上腺髓质素的表达[1]
Hep3B细胞用载体或TRC-160334处理指定剂量6小时。6小时后，细胞裂解并分离总RNA。使用ABI 7900 HT通过实时PCR监测肾上腺髓质素mRNA的表达以及18S rRNA的表达。肾上腺髓质素的mRNA表达相对于18S rRNA表达进行了标准化。结果表示为肾上腺髓质素信使RNA相对于载体对照的倍数诱导。

动物/疾病模型： SD（SD（Sprague-Dawley））雄性大鼠（250–300 g）[1]
剂量： 0.1 和 0.3 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)
实验结果： 血清肌酐和血尿素氮显著降低。

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动物/疾病模型： SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠（250–300 g）[1]
剂量： 0.3 和 0.6 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)
实验结果： 显示出急性肾小管坏死减轻的趋势。

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动物 [1]
Sprague-Dawley 雄性大鼠（体重 250–300 g）来自本实验室自繁自养的种群。这些大鼠饲养于特定病原体清除 (SPF) 级动物房内，光照/黑暗周期为 12 小时，温度和湿度均受控，并可自由获取食物和水。

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实验方案和分组[1]
测试化合物和制剂[1]
为了测试TRC-160334的体内疗效，将其配制成注射液，所用辅料为临床认可的制剂辅料。无论剂量如何，均以1 ml/kg的剂量腹腔注射测试化合物制剂。使用pH值调节至7.4的磷酸盐缓冲液作为溶剂。

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肾脏缺血/再灌注的诱导[1]
大鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg，2 ml/kg，腹腔注射）麻醉。确认麻醉诱导成功后，用剃毛器剃除腹部毛发，并将动物置于恒温毯上，以在整个手术过程中将体温维持在37 ± 0.5°C。双侧肾脏缺血的诱导方法参照先前描述的步骤。简而言之，在腹部正中做切口，取出内脏，并用预热至37℃的生理盐水浸湿的纱布包扎。分离双侧肾动脉和肾静脉，并用微血管夹阻断35分钟。肾动脉和肾静脉阻断后，用3-0缝线缝合腹部以防止热量散失。再灌注时（阻断后35分钟），再次打开腹部，目视确认双侧肾脏已充分阻断（出现明显的紫绀）。通过移除微血管夹实现肾脏再灌注。向每个肾脏灌注0.5 ml温生理盐水（37℃），然后目视观察肾脏是否已充分再灌注（颜色恢复正常）。将动物再次缝合后，置于保温箱（维持在 37°C）中使其从麻醉中恢复。随后，每只动物均接受苄青霉素（33,333 IU，0.1 ml/kg 皮下注射，每日两次，共 2 天）和丁丙诺啡（0.15 mg，0.5 ml/kg 肌注，每日两次，共 2 天）作为术后护理。在肾脏微血管夹移除后，若动物在再灌注前或移除后出现完全性紫绀，则将其排除在研究之外。

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TRC-160334治疗[1]
缺血前治疗[1]
动物按以下方式分组（每组至少9只）：
第1组（Veh-pre）：在诱导肾脏缺血前，注射1 ml/kg的载体（PBS，pH 7.4）（作为第2组和第3组的对照）。
第2组（TRC-0.1 mg-pre）：在诱导肾脏缺血前，注射三次TRC-160334（0.1 mg/kg）进行预处理。
第3组（TRC-0.3 mg-pre）：在诱导肾缺血之前，对动物进行三次TRC-160334（0.3 mg/kg）注射预处理。
第2组和第3组动物通过腹腔注射途径接受TRC-160334注射。第一次注射在手术诱导肾缺血前12小时，第二次注射在6小时，第三次注射在1小时。第 1 组动物以类似方式接受载体注射。

缺血后治疗 [1]
动物按以下方式分组（每组至少 9 只）：
第 4 组（载体-缺血后）：诱导肾缺血后，载体对照组动物注射 1 ml/kg 载体（PBS，pH 7.4）（作为第 5 组和第 6 组的对照）。
第 5 组（TRC-0.3 mg-缺血后）：肾缺血发生 2 小时后，动物接受 TRC-160334 注射（每组 3 只）。
第 6 组（TRC-0.6 mg-缺血后）：肾缺血发生 2 小时后，动物接受 TRC-160334 注射（每组 3 只）。第 5 组和第 6 组动物6只动物在肾缺血手术诱导后2小时开始接受腹腔注射TRC-160334（第5组动物注射0.3 mg/kg，第6组动物注射0.6 mg/kg），并在术后6小时和10小时分别进行第二次和第三次注射（第5组动物注射0.1 mg/kg，第6组动物注射0.2 mg/kg）。第4组动物以类似方式接受载体注射。

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血清和尿液生化分析[1]
通过舌下穿刺采集每只动物的定时血样，并分离血清（150 µl）。血样采集时间点从肾缺血诱导前24小时开始，直至诱导后72小时。同样，将动物置于代谢笼中，收集每只动物的混合尿液样本。所有动物在正式采集前1天适应代谢笼环境。记录每只动物在每个时间点的总尿量。随后，在缺血发生后第7天，每组至少处死4只动物，并处理双肾进行形态学研究。分析血清和尿液样本中的肌酐和钠含量，而BUN仅在血清中进行测定。所有生化参数均使用全自动临床化学分析仪Olympus AU400进行测定。图1展示了用于评估TRC-160334缺血前或缺血后治疗疗效的实验方案。

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基因表达研究[1]
对载体组和TRC-160334治疗组动物的肾脏进行全细胞提取物制备。蛋白质经SDS-PAGE分离后，采用EPO抗体、肾上腺髓质素抗体和HSP70抗体进行免疫印迹分析。

[1]. Treatment with a novel hypoxia-inducible factor hydroxylase inhibitor (TRC160334) ameliorates ischemic acute kidney injury. Am J Nephrol. 2012;36(3):208-218.

背景：缺氧诱导因子 (HIF) 转录系统在细胞适应低氧水平中发挥着核心作用。HIF 的预激活和/或其靶基因产物的表达可导致缺氧/缺血性肾损伤的细胞保护作用，这一点已得到充分证实。越来越多的证据表明，HIF 激活参与了心脏、大脑和肾脏的缺氧/缺血后适应。然而，鲜有研究采用药物评估缺血后 HIF 激活对肾损伤的潜在益处。我们假设，缺血后使用药物增强 HIF 激活可以保护肾脏免受缺血/再灌注损伤。为此，我们使用了一种新型 HIF 羟化酶抑制剂 TRC160334。
方法：合成了新型 HIF 羟化酶抑制剂 TRC160334。本研究在Hep3B细胞中评估了TRC160334稳定HIF-α及其后续激活HIF的能力。此外，还利用缺血/再灌注诱导的急性肾损伤（AKI）大鼠模型评估了TRC160334的疗效。研究采用了两种不同的治疗方案：一种是在缺血发生前给予TRC160334治疗，另一种是在肾脏再灌注后给予治疗。结果显示，TRC160334治疗可稳定Hep3B细胞中的HIF-α，进而激活HIF。两种治疗方案均显著减轻了肾损伤，且在再灌注后给予TRC160334治疗可显著降低血清肌酐水平（24小时和48小时分别降低23%和71%，p < 0.01）。两种治疗方案均显著改善了24小时内的尿量。
结论：本文数据提供了药理学证据，表明TRC160334可增强缺血后HIF的激活，这是一种有前景且临床可行的肾脏缺血/再灌注损伤治疗策略。[1]

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我们使用新型HIF羟化酶抑制剂TRC160334的研究结果与之前的报道一致，即在缺血前通过药理学方法抑制HIF羟化酶可保护肾脏。此外，我们的研究首次证实，在缺血后给予HIF羟化酶抑制剂可有效改善缺血性急性肾损伤（AKI）。这些发现凸显了TRC160334在预防和治疗缺血性AKI方面的临床应用潜力。[1]

C14H13N3NA2O5S

381.31

1293290-41-1

1293290-41-1 (sodium);1293290-44-4 (potassium);1293289-69-6 (free acid); 1293290-45-5 (calcium);

Typically exists as solids at room temperature

O=C([O-])CNC(C1=C([O-])N=C(SC2=C3CCCCC2)N3C1=O)=O.[Na+].[Na+]

KDOUTFVJRKEFFZ-UHFFFAOYSA-L

InChI=1S/C14H15N3O5S.2Na/c18-9(19)6-15-11(20)10-12(21)16-14-17(13(10)22)7-4-2-1-3-5-8(7)23-14;;/h21H,1-6H2,(H,15,20)(H,18,19);;/q;2*+1/p-2

sodium (2-oxido-4-oxo-7,8,9,10-tetrahydro-4H,6H-cyclohepta[4,5]thiazolo[3,2-a]pyrimidine-3-carbonyl)glycinate

TRC-160334 sodium salt; TRC 160334 di-sodium salt; TRC160334

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。