ER-076349   中文名称: 艾瑞布林中间体

Tubulin polymerization; microtubule

ER-076349抑制多种癌细胞的增殖，IC50分别为0.59 nM（MDA-MB-435）、2.4 nM（COLO 205）、7.3 nM（DLD-1）、3.6 nM（DU 145）、1.8 nM（LNCaP）、3.2 nM（LOX）、2.6 nM（HL-60）、4.0 nM（U937）[1]。

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Halichondin B是一种最初在海绵中发现的强效抗癌剂。尽管天然产物的稀缺阻碍了将卤软骨蛋白B开发为新的抗癌药物的努力，但完整合成路线的存在允许合成结构更简单的类似物，这些类似物保留了母体化合物的显著效力。在本研究中，我们发现卤球粒蛋白B的两种大环酮类似物ER-076349和ER-086526在体外对许多人类癌症细胞系具有亚nM的生长抑制活性。ER-076349和ER-086526诱导G2-M细胞周期阻滞和有丝分裂纺锤体的破坏，这与卤线粒体B的基于微管蛋白的抗有丝分裂机制一致。这进一步得到了生物素化类似物ER-040798与微管蛋白的直接结合以及ER-076449和ER-0865 26在体外抑制微管蛋白聚合的支持。在结构简化、完全合成的类似物中保留了卤软骨蛋白B的非凡体外和体内活性，这确立了将卤软骨蛋白B-基药物开发为高效新型抗癌药物的可行性[1]。

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Eribulin和ER-076349对U-2 OS细胞有丝分裂的影响[2]
这些实验的目的是在抑制增殖和阻止有丝分裂的药物浓度下，测量活U-2 OS人骨肉瘤细胞中着丝粒的运动，这是由于其附着的动态微管的生长和缩短动力学造成的。因此，我们首先确定了eribulin和ER-076349对细胞增殖（28小时，一个细胞周期）和有丝分裂进程的影响。30 nmol/L艾里布林和3 nmol/L ER-076349的IC50抑制了细胞增殖（图1B）。

通过用药物（3 pmol/L–10µmol/L，20小时）孵育细胞并通过显微镜测定有丝分裂指数（材料和方法）来测量药物对有丝分裂进程的影响。当eribulin的浓度>3 nmol/L和ER-076349的浓度>0.1 nmol/L时，细胞在有丝分裂中积累，在1µmol/L eribulin和100 nmol/LER-076349时达到最大值60%（图1C）。半最大阻滞发生在30 nmol/L艾里布林和2 nmol/L ER-076349，与观察到的增殖IC50几乎相同。因此，ER-076349在U-2 OS细胞中的效力是艾里布林的15倍。

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GFP-CENP-B的主轴和微管组织与定位[2]
图2，A-D显示了在有和没有药物的情况下（4小时孵育）GFP-CENP-B、微管和染色体在固定和免疫染色的U-2 OS细胞中的定位。在中期对照细胞中（图2A），染色体完全聚集在中期板上，着丝粒对（箭头）平行于纺锤体轴。在后期，姐妹染色单体及其相关着丝粒分离，着丝粒呈现为单个球形点（图2B）。在与30 nmol/L艾里布林或2 nmol/LER-076349孵育4小时后，纺锤体稍小，但通常是双极性的，所有染色体都聚集在中期板上。然而，许多纺锤体是双极的，但具有“滞后”染色体或染色体卡在一极或两极（箭头，图2C）。一些主轴是三极或多极的（图2D）。

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Eribulin和ER-076349对着丝粒动力学的影响[2]
在与药物孵育4小时后，我们检查了有丝分裂IC50下的着丝粒动力学，以及两种化合物（30和60 nmol/L艾里布林和2和4 nmol/LER-076349）的有丝分裂IC50的两倍。如表I所示，两种药物在抑制有丝分裂的浓度下都抑制了着丝粒动态。最显著和浓度依赖性的变化是拉伸和放松时间百分比的减少，暂停状态时间百分比的增加，以及整体动态性的抑制（30 nM和60 nM艾里布林分别减少6%和35%，2 nM和4 nM ER-076349分别减少5%和32%）（表I）。尽管对拉伸速率的影响很小，但两种化合物都显著抑制了松弛速率，在2×IC50下抑制了21%。IC50时，转变频率不受影响，但在2×IC50时降低（艾里布林和ER-076349分别降低了24%和35%）。与长春花碱和紫杉醇对着丝粒动力学的影响相反，eribulin和ER-076349对平均分离距离没有显著影响。

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Eribulin和ER-076349的细胞内水平 图4显示了厄里布林和ER-076349在IC50和2×IC50时被U-2 OS细胞摄取的时间过程。厄立布林（30 nmol/L和60 nmol/L）被迅速吸收到细胞中，在添加后4小时分别达到1µM和3.5µM的细胞内浓度，并在至少20小时内保持在大约这些水平。因此，厄立布林在细胞中的积累是其在培养基中浓度的30-60倍ER-076349（2 nmol/L和4 nmol/L）被更快地吸收，在添加后4小时分别达到300 nmol/L的细胞内浓度和3.2µM，并且高水平至少保持到20小时。因此，诱导有丝分裂阻滞的细胞内药物浓度与这两种药物相当（艾立布林为3.5µmol/L，ER-076349为3.2µmol/L），这些细胞内浓度对微管动力学的影响相似。ER-076349的积累程度大于eribulin（即2和4 nmol/L ER076349分别为150倍和800倍）。对于这两种药物（eribulin和ER-076349），在20小时洗涤细胞并在无药物培养基中孵育会导致细胞中药物的快速损失，尽管洗涤后的第一个小时内，细胞内eribulin的损失不到一半，而几乎所有的细胞内ER-076449都损失了。洗涤24小时后，两种药物的细胞内浓度与背景浓度相等（数据未显示）。

在这项研究中，我们发现卤球粒蛋白B的两种大环酮类似物，ER-076349和ER-086526，在0.1-1 mg/kg下对四种人类异种移植物具有显著的体内活性：MDA-MB-435乳腺癌症、COLO205癌症、LOX黑色素瘤和NIH:OVCAR-3卵巢癌症。在结构简化、完全合成的类似物中保留了卤软骨蛋白B的非凡体外和体内活性，这确立了将卤软骨蛋白B-基药物开发为高效新型抗癌药物的可行性[1]。

细胞增殖和有丝分裂指数[2]
将细胞接种在聚-L-赖氨酸处理过的无菌玻璃盖玻片上（50mg/ml，2小时，37°C，用无菌水洗涤一次），以1×105个细胞/2 ml/孔的速度接种在六孔板中。一天后，用含有一定浓度（0.003-10000 nmol/L）的艾里布林或ER-076349的新鲜培养基替换培养基，并进一步培养一个细胞周期（28小时）。通过将漂浮细胞与附着细胞结合来收获细胞，附着细胞是通过胰蛋白酶化（0.5 mg/ml的PBS溶液：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，8.1 mmol/L Na2HPO4，0.5 mmol/L EDTA，pH 7.2）（5分钟，37°C）释放的，并使用血细胞计数器计数活细胞。台盼蓝染料用于区分活细胞和死细胞。为了评估有丝分裂指数，细胞在药物存在和不存在的情况下生长20小时。有丝分裂指数是通过显微镜检查福尔马林/甲醇（如下所述）固定的细胞中的染色体和GFP-CENP-B着丝粒来确定的，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并使用尼康Eclipse E800（尼康，梅尔维尔，纽约）显微镜以60×和100×（两者的数值孔径均为1.4）物镜成像。结果是5个独立实验的平均值和标准误差，其中每个实验中每个条件下至少计数1000个细胞。IC50是通过增殖或有丝分裂指数与药物浓度的双倒数图的线性回归来确定的。

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细胞内药物浓度[2]
将U-2 OS细胞接种到聚赖氨酸处理的闪烁瓶中（1×105个细胞，2ml）。24小时后，用含有30-60nmol/L[3H]艾里布林（用未标记的艾里布林稀释后的最终比活：2mCi/mol）或2-4nmol/L[3H]ER-076349（最终比活性：18-24mCi/mol）或未标记药物（用于测定细胞数量）的新鲜培养基替换培养基。在药物添加后30分钟至20小时内从小瓶中取出培养基，用2ml PBS快速冲洗细胞两次，并通过闪烁计数测定细胞内药物浓度。在清洗培养基中仅含有放射性标记药物的小瓶后，确定了背景放射性。在添加药物时和20小时后，在使用未标记药物平行处理的小瓶中使用血细胞计数器通过手动细胞计数来确定细胞数量。细胞内药物浓度是通过将细胞内艾里布林的摩尔数除以平均细胞体积乘以细胞数/瓶来确定的。根据胰蛋白酶处理后细胞的平均直径四舍五入计算平均细胞体积（n=38；平均细胞体积，3.2×10-12L）。此外，20小时后，用2ml PBS洗涤细胞，并加入新鲜培养基1小时和24小时，以确定药物从细胞中洗掉的难易程度。所有时间点均进行了两次测量，结果为5个实验的平均值和标准误差。

艾立布林 (E7389) 是一种作用机制独特的微管抑制剂，目前正处于癌症治疗的 III 期临床试验阶段。与效力更强的化合物 ER-076349 相比，艾立布林在体内表现出更优的疗效，而这种疗效差异并非由二者药代动力学性质不同所致。通过流式细胞术有丝分裂阻滞可逆性分析（采用全剂量/反应处理），我们观察到艾立布林（而非 ER-076349）诱导的有丝分裂阻滞是不可逆的，这提示了一种基于细胞的药效学解释。药物清除 5 天后，细胞活力分析证实了有丝分裂阻滞可逆性与细胞长期存活率之间的关系。在 U937、Jurkat、HL-60 和 HeLa 细胞中也观察到了类似的结果，排除了细胞类型特异性效应。对其他微管蛋白抑制剂的研究表明，有丝分裂阻滞可逆性是抗有丝分裂药物普遍存在的可量化的化合物特异性特征。 Bcl-2磷酸化模式与艾立布林和ER-076349的有丝分裂阻滞可逆性模式平行，提示持续的Bcl-2磷酸化是艾立布林不可逆阻滞后导致细胞长期存活率下降的原因之一。药物摄取和清除/滞留研究表明，[3H]艾立布林的细胞内积累水平低于[3H]ER-076349，但其滞留时间更长，且滞留水平更高。不可逆长春新碱和可逆长春碱也观察到了类似的结果，表明持续的细胞滞留是其不可逆性的一个组成部分。我们的研究结果表明，艾立布林在体内的优势源于其诱导不可逆有丝分裂阻滞的能力，而这种能力似乎与药物的持续滞留和Bcl-2的持续磷酸化有关。更广泛地说，我们的结果表明，抗有丝分裂药物的化合物特异性可逆性特征有助于细胞药效学和体内药代动力学之间的相互作用，从而决定间歇给药条件下的抗肿瘤疗效。Cancer Res; 71(2); 496–505.

[1]. In vitro and in vivo anticancer activities of synthetic macrocyclic ketone analogues of halichondrin B. Cancer Res. 2001 Feb 1;61(3):1013-21.

[2]. Inhibition of Centromere Dynamics by Eribulin (E7389) during Mitotic Metaphase. Mol Cancer Ther. 2008 Jul;7(7):2003–2011.

艾立布林 (E7389) 是一种合成的哈利康德林 B 类似物，目前正处于乳腺癌 III 期临床试验阶段。它能与微管蛋白和微管结合。低浓度下，艾立布林可抑制间期细胞中微管动态不稳定性生长阶段，阻滞有丝分裂并诱导细胞凋亡，提示抑制纺锤体微管动力学可导致有丝分裂阻滞。为了进一步验证这一假设，我们利用延时共聚焦显微镜在活体有丝分裂期 U-2 OS 人骨肉瘤细胞中，测量了艾立布林对着丝粒及其连接的动粒微管动力学的影响。绿色荧光蛋白标记的着丝粒结合蛋白 B 可标记着丝粒和动粒微管的加端。在对照细胞中，姐妹染色单体着丝粒对在张力作用下交替出现分离度增加和减少（拉伸和松弛）的状态。艾立布林在足以阻滞有丝分裂的浓度下抑制了着丝粒动力学。在 60 nmol/L 艾立布林（2 倍有丝分裂 IC50）浓度下，纺锤体松弛率降低 21%，暂停时间增加 67%，动态性降低 35%（但平均着丝粒间距未减少），表明艾立布林降低了动粒处正常的微管依赖性纺锤体张力，从而阻止了有丝分裂检查点信号的传递。我们还检测了一种效力更强但对肿瘤疗效较差的抗增殖哈利康德林衍生物 ER-076349。在 2 倍 IC50（4 nmol/L）浓度下，有丝分裂阻滞也与着丝粒动态性的抑制同时发生。尽管两种化合物的培养基 IC50 值相差 15 倍，但细胞内浓度相似，表明与艾立布林相比，ER-076349 更容易被细胞摄取。动粒微管动力学抑制与有丝分裂停滞之间存在很强的相关性，这表明艾立布林阻断有丝分裂的主要机制是抑制纺锤体微管动力学。[2]

C40H58O12

730.88

730.393

253128-15-3

11297138

White to off-white solid powder

141

2

12

4

52

1370

19

O1[C@H](C[C@H](O)CO)[C@@H](OC)CC(=O)C[C@]2([H])CC[C@@]([H])(C2)C[C@]2([H])O[C@@]3(C[C@@]2([H])CC3)CC2O[C@@]3([H])O[C@]([H])(C(=C)C2C3)CCO2O[C@@]3([H])O[C@@]4([H])C1C2CO(C)C4C3=C

SOGFSQSGBFDQFA-JBQZKEIOSA-N

InChI=1S/C40H58O12/c1-19-11-24-5-7-28-20(2)12-26(45-28)9-10-40-17-33-36(51-40)37-38(50-33)39(52-40)35-29(49-37)8-6-25(47-35)13-22(42)14-27-31(16-30(46-24)21(19)3)48-32(34(27)44-4)15-23(43)18-41/h19,23-39,41,43H,2-3,5-18H2,1,4H3/t19-,23+,24+,25-,26+,27+,28+,29+,30-,31+,32-,33-,34-,35+,36+,37+,38-,39+,40+/m1/s1

(1S,3S,6S,9S,12S,14R,16R,18S,20R,21R,22S,26R,29S,31R,32S,33R,35R,36S)-20-[(2S)-2,3-dihydroxypropyl]-21-methoxy-14-methyl-8,15-dimethylidene-2,19,30,34,37,39,40,41-octaoxanonacyclo[24.9.2.13,32.13,33.16,9.112,16.018,22.029,36.031,35]hentetracontan-24-one

253128-15-3; (1S,3S,6S,9S,12S,14R,16R,18S,20R,21R,22S,26R,29S,31R,32S,33R,35R,36S)-20-[(2S)-2,3-Dihydroxypropyl]-21-methoxy-14-methyl-8,15-dimethylidene-2,19,30,34,37,39,40,41-octaoxanonacyclo[24.9.2.13,32.13,33.16,9.112,16.018,22.029,36.031,35]hentetracontan-24-one; (2R,3R,3aS,7R,8aS,9S,10aR,11S,12R,13aR,13bS,15S,18S,21S,24S,26R,28R,29aS)-2-[(2S)-2,3-Dihydroxypropyl]hexacosahydro-3-methoxy-26-methyl-20,27-bis(methylene)-11,15:18,21:24,28-triepoxy-7,9-ethano-12,15-methano-9H,15H-furo[3,2-i]furo[2 inverted exclamation marka,3 inverted exclamation marka:5,6]pyrano[4,3-b][1,4]dioxacyclopentacosin-5(4H)-one; ER-076349; 67XUM42NP8; CHEMBL1683522; Eribulin mesylate intermediate 3; SCHEMBL16765869;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光（避免光照）。  (2). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气下），避免暴露在潮湿环境中。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。