SMN2

Risdiplam 提高 SMN 蛋白的量并控制 SMN2 前 mRNA 的剪接以生成全长 SMN2 mRNA。 Risdiplam 是 SMN2 的剪接调节剂，可以增加全长 SMN2 蛋白的量，从而增强 SMN 蛋白的功能。导致婴儿死亡的最常见遗传病仍然是SMA（SMA）。由于东南运动神经元 1 (SMN1) 基因中的双联体，早期运动神经元蛋白 (SMN) 水平低是导致这种常染色体隐性神经病的原因，其特征是进行性运动和呼吸肌减弱。残留失活和基因丢失的其他来源[1]。

为了进一步探索利斯地普兰的分布，研究人员在动物模型中评估了利斯地普兰的体外特征和体内药物水平，以及对不同组织中SMN蛋白表达的影响。小鼠（n = 90）、大鼠（n = 148）和猴子（n = 24）的血浆、肌肉和脑中的总药物水平相似。正如预期的那样，基于它的高被动渗透性和不是人类多药耐药蛋白1底物，里斯迪普兰CSF水平反映了猴子血浆中游离化合物的浓度。当猴子每天服用一次利西泮，连续39周，组织分布没有变化。在给药的两种SMA小鼠模型中，CNS和外周组织中SMN蛋白水平呈平行剂量依赖性增加。这些体外和体内的临床前数据有力地表明，利斯地普兰治疗后患者血液中功能性SMN蛋白的增加应该反映了CNS、肌肉和其他外周组织中功能性SMN蛋白的类似增加。[1]

体外转运试验[1]
使用亲本猪肾上皮LLC PK1 （Lewis肺癌猪肾1）和犬肾上皮MDCKII细胞系。LLC‐PK1， MDCKII, L‐MDR1 (LLC‐PK1细胞转染了人MDR1), L‐Mdr1a (LLC‐PK1细胞转染了啮齿动物Mdr1a), M‐BCRP (MDCKII细胞转染了人乳腺癌抵抗蛋白；BCRP)和M - Bcrp1（转染啮齿动物Bcrp1的MDCKII细胞）细胞系在许可协议下使用。啮齿动物Mdr1a是一种小鼠蛋白，其氨基酸序列与大鼠Mdr1a具有95%的同源性，因此本文将其称为“啮齿动物”Mdr1a。化验按前面所述进行。简单地说，将细胞培养在半透性的96孔植入物上(表面积0.11 cm2，孔径0.4 mm；在播种后第3天或第4天进行双向输运测量。将培养基从顶部（100 mL）和基底外侧（240 mL）室中取出，在受者一侧替换为不含酚红和含有或不含抑制剂（zosuquidar， L‐MDR1和L‐Mdr1a的抑制剂为1 μM）的培养基；Ko143, 1 μM M - BCRP和M - BCRP)。通过向含有试验底物（risdiplam或RG7800，在1 μM下测试）和10 μM路西弗黄的供体室中添加培养基，启动跨细胞运输。加入Lucifer黄以确认单层的完整性，对照底物孵育作为MDR1/Mdr1a或BCRP/ BCRP活性的对照。在37°C和5% CO2下连续摇瓶（100 rpm）孵育3.5小时。样品（每种条件下三份）从供体和受体区室中取出，并通过闪烁计数或串联质谱的高效液相色谱分析，如前所述的液相色谱，使用10ADvp泵系统与PAL HTS自动进样器耦合，对于MS， API 4000或QTrap4000系统配备TurboIonspray源。

大鼠研究设计（研究 6、7 和 8）[1]
\nRisdiplam 以 10 mM 抗坏血酸/0.01 mg/mL 硫代硫酸钠五水合物（pH 3）溶液的形式，每日一次灌胃给药，给药体积为 10 mL/kg（研究 6）或 4 mL/kg（研究 7 和 8）。各研究的具体剂量和给药持续时间请参见表 1。每只动物均在异氟烷麻醉下处死。通过切断主要血管使动物放血。在放血前立即从颈静脉采集终末血样，并收集到含有 K3-EDTA 抗凝剂的试管中。将整个脑组织收集到标记的 7 mL Precellys® 匀浆管 (CK14) 中，液氮速冻后置于干冰上保存。组织经珠磨匀浆和/或用空白组织匀浆或空白大鼠血浆稀释。分析物通过乙腈/乙醇沉淀法从基质（EDTA血浆或组织匀浆）中分离，沉淀液中含有内标（¹³C、²D²稳定同位素标记的risdiplam或RG7800），并通过窄径高效液相色谱法（HPLC）与其他样品成分分离。检测采用加热电喷雾（HESI）串联质谱（MS/MS）正离子选择反应监测（SRM）模式。脑脊液和组织样品的定量分析以用相应空白组织匀浆或空白血浆稀释的大鼠血浆校准曲线为基准。 risdiplam 或 RG7800 在大鼠血浆中的定量下限 (LLOQ) 为 0.250 ng/mL（取 20 μL 等分试样），在脑脊液中的定量下限为 0.500 或 1.00 ng/mL，在组织中的定量下限为 2 ng/g（取 20 μL 组织匀浆）。

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\n猴子研究设计（研究 9 和 10）[1]
\nRisdiplam 或 RG7800 以 10 mM 抗坏血酸/0.01 mg/mL 硫代硫酸钠五水合物（pH 3）溶液的形式，每日一次通过灌胃法口服给药，给药体积为 1.5 mL/kg（研究 9）或 5 mL/kg（研究 10）。有关各项研究的剂量和给药持续时间的详细信息，请参见表1。\n\n给药结束后，处死动物，收集终末血浆和组织样本并冷冻保存。在研究10中，分别收集脑干和皮质样本（0.5 g）。从所有动物中收集0.5 mL脑脊液样本。\n\n将组织匀浆并用空白食蟹猴血浆稀释。按照研究6-8所述的方法从基质中分离分析物。采用HESI MS/MS正离子SRM模式进行检测。使用20 μL等分试样，食蟹猴血浆中的定量下限（LLOQ）为0.250 ng/mL（研究9）或0.500 ng/mL（研究10）。所有其他样本均根据食蟹猴血浆校准曲线进行定量。由于样本稀释，脑脊液（研究 9）中的定量下限为 0.500 ng/mL，组织中的定量下限介于 0.500 至 5000 ng/g 之间（脑组织中为 10.0 ng/g）。研究 10 采用了一种专用的、灵敏的脑脊液检测方法，其定量下限为 0.100 ng/mL。游离血浆浓度通过将测得的血浆总浓度乘以测得的血浆游离分数（成年食蟹猴为 15%）计算得出。\n

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\n大鼠定量全身放射自显影 (QWBA) 研究设计（研究 13）[1]
\n\nWistar 大鼠接受单次口服 14C-risdiplam 或 RG7800（通过胃灌注），或单次静脉注射 14C-risdiplam 或 RG7800（通过尾静脉注射）。口服和静脉注射的剂量分别为 5 mg/kg 和 2 mg/kg。对于全身放射自显影，在异氟烷深度麻醉后，分别于给药后以下时间点对单只动物进行冷休克处死（冷休克液为过量干冰的己烷混合物）：静脉给药组10分钟，口服给药组2、24、72和168小时。动物尸体完全冷冻后，进行全身放射自显影处理。使用经验证的图像分析系统，从全身放射自显影图像中定量分析组织中的放射性浓度。将成像板置于铜衬铅曝光箱中曝光7天后，使用FUJI FLA 5000或5100放射发光成像系统进行处理。使用经验证的基于PC的图像分析软件包分析电子图像。在终末麻醉状态下，通过心脏穿刺从每只动物身上采集约 3 mL 血液，注入预先涂有肝素锂的试管中。测定血液和血浆的总放射性。\n

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\n小鼠研究设计（研究 1、2、3、4、5、11 和 12）[1]
\n这些研究使用了两种不同的 SMA 小鼠模型。在成年小鼠的研究中，使用了轻度 SMA 的 C/C 等位基因小鼠模型。与正常小鼠相比，C/C 等位基因小鼠的寿命接近正常，但表现出肌肉功能下降、体重增加减少和外周坏死。此外，还使用了新生 SMNΔ7 小鼠，这是一种重度 SMA 的小鼠模型。这些小鼠在出生后约2周死亡。\n\n对于成年小鼠的口服给药，化合物配制成含0.1% Tween 80的0.5%羟丙基甲基纤维素悬浮液。对于幼鼠的腹腔注射（IP）给药，化合物配制成二甲基亚砜溶液，给药体积为2.5 mL/kg。重复给药时，化合物每日给药一次。在研究5中，小鼠从出生后第3天（PND3）至第23天（PND23）进行腹腔注射给药，从出生后第24天（PND24）开始进行灌胃给药。有关各研究的剂量和给药持续时间的详细信息，请参见表1。\n

吸收、分布和排泄
口服后达峰时间（Tmax）约为1-4小时。每日一次，与早餐（或哺乳后）同服，利司他普兰约7-14天达到稳态血药浓度。在SMA患者中，所有研究剂量下利司他普兰的药代动力学均呈近似线性关系。
口服18mg利司他普兰后，约53%的剂量经粪便排出，28%经尿液排出。未代谢的原药占粪便排出剂量的14%，占尿液排出剂量的8%。
口服后，利司他普兰能很好地分布于中枢神经系统和周围组织。稳态表观分布容积为 6.3 L/kg。
对于体重 14.9 kg 的患者，利司普拉的表观清除率为 6.3 L/kg。

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代谢/代谢物
利司普拉的代谢主要由黄素单加氧酶 1 和 3 (FMO1 和 FMO3) 介导，CYP1A1、CYP2J2、CYP3A4 和 CYP3A7 也参与其中。原药约占循环药物总量的 83%。一种药理学上无活性的代谢物 M1 已被确定为主要的循环代谢物——体外实验观察到该代谢物 M1 可抑制 MATE1 和 MATE2-K 转运蛋白，与母体药物类似。

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生物半衰期
利司帕林在健康成年人体内的末端消除半衰期约为 50 小时。

蛋白结合
利司他林在血浆中的蛋白结合率约为 89%，主要与血清白蛋白结合。

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肝毒性
在注册前临床试验中，利司他林治疗未引起血清实验室指标的临床显著变化，利司他林组与安慰剂组患者的血清 ALT、AST 和胆红素值无差异。虽然安全性结果仅基于数百例患者，但未出现疑似药物性肝损伤伴黄疸的病例。此外，自 2020 年利司他林获批以来，尚未有已发表的临床表现明显的肝损伤病例。
可能性评分：E（不太可能是临床表现明显的肝损伤的原因）。

[1]. Risdiplam distributes and increases SMN protein in both the central nervous system and peripheral organs. Pharmacol Res Perspect. 2018 Nov 29;6(6):e00447.

利司迪普拉姆（Risdiplam）是一种口服生物利用度高的mRNA剪接调节剂，用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。它通过提高SMN2基因转录效率来增加全身SMN蛋白浓度。其作用机制与其前体药物[nusinersen]类似，最大的区别在于给药途径：nusinersen需要鞘内注射，一次性基因疗法[onasemnogene abeparvovec]也需要鞘内注射，而利司迪普拉姆则具有口服生物利用度高的便利性。利司迪普拉姆于2020年8月获得FDA批准，用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。与其他现有的SMA疗法相比，利司迪普拉姆的价格将大幅降低，有望为各种严重程度和类型的SMA患者提供一种新型且相对容易获得的治疗选择。
利司迪普拉姆是一种运动神经元存活2剪接调节剂。利司帕仑的作用机制是作为运动神经元存活2剪接调节剂、多药和毒素外排转运蛋白1抑制剂以及多药和毒素外排转运蛋白2K抑制剂。利司帕仑的生理效应是通过增加蛋白质合成实现的。

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药物适应症
利司帕仑适用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。
依维司群适用于治疗5q脊髓性肌萎缩症（SMA），适用于临床诊断为SMA 1型、2型或3型，或携带1至4个SMN2基因拷贝的患者。

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作用机制
脊髓性肌萎缩症 (SMA) 是一种严重的进行性先天性神经肌肉疾病，由运动神经元存活基因 1 (SMN1) 突变引起，该基因负责合成 SMN 蛋白。SMA 的临床特征包括脊髓运动神经元的退化，最终导致肌肉萎缩，在某些情况下还会出现肌力丧失。SMN 蛋白在全身广泛表达，被认为在 DNA 修复、细胞信号传导、内吞作用和自噬等多种细胞内过程中发挥着重要作用。第二个SMN基因（SMN2）也能产生SMN蛋白，但其序列中一个微小的核苷酸替换导致约85%的转录本在剪接过程中缺失外显子7——这意味着SMN2产生的SMN蛋白中只有约15%具有功能，不足以弥补SMN1突变造成的缺陷。越来越多的证据表明，许多细胞和组织对SMN浓度降低具有选择性敏感性，这使得SMN蛋白成为治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的理想靶点。利司迪普拉姆（Risdiplam）是一种SMN2 mRNA剪接修饰剂，它能增加剪接过程中外显子7的包含，最终提高SMN2产生的功能性SMN蛋白的量。它通过与SMN2前体mRNA上的两个位点结合发挥作用：内含子7的5'剪接位点（5'ss）和外显子7的外显子剪接增强子2（ESE2）。

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药效学
利司他普兰通过刺激脊髓性肌萎缩症患者体内一种关键蛋白的生成，帮助缓解脊髓性肌萎缩症的症状。早期利司他普兰试验表明，治疗12周后，脊髓性肌萎缩症患者的SMN蛋白浓度最多可增加2倍。

C22H23N7O

401.464323282242

401.2

C, 65.82; H, 5.77; N, 24.42; O, 3.99

1825352-65-5

Risdiplam-d4

118513932

White to yellow solid powder

0.5

78.1

1

6

2

30

886

0

ASKZRYGFUPSJPN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H23N7O/c1-14-9-18(26-29-11-15(2)24-21(14)29)17-10-20(30)28-12-16(3-4-19(28)25-17)27-8-7-23-22(13-27)5-6-22/h3-4,9-12,23H,5-8,13H2,1-2H3

7-(4,7-diazaspiro[2.5]octan-7-yl)-2-(2,8-dimethylimidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl)pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one

RG7916; RO703406; RG-7916; RO-7034067; Risdiplam; 1825352-65-5; Evrysdi; Risdiplam [INN]; RG 7916; RO 7034067; Evrysdi

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~1.7 mg/mL (~4.2 mM)
Ethanol: < 1 mg/mL
H2O: < 0.1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。