Risdiplam (RG-7916, RO-7034067)   中文名称: 利司扑兰

SMN2
Risdiplam targets SMN2 pre-mRNA, binding directly to the RNA to modulate its splicing pattern. By promoting exon 7 inclusion in SMN2 mRNA, it increases the production of full-length SMN2 mRNA and functional SMN protein. The compound enhances the recruitment of two splicing activators (FUBP1 and KHSRP), and the formation of these ternary complexes contributes to its mechanism of action. It compensates for the defective SMN1 gene.

利司他林可提高SMN蛋白的含量，并调控SMN2前体mRNA的剪接，从而生成全长SMN2 mRNA。利司他林是一种SMN2剪接调节剂，能够增加全长SMN2蛋白的含量，进而增强SMN蛋白的功能。目前最常见的导致婴儿死亡的遗传性疾病是脊髓性肌萎缩症（SMA）。由于东南运动神经元1（SMN1）基因的重复突变，导致早期运动神经元蛋白（SMN）水平降低，从而引发这种常染色体隐性遗传的神经病。该病以进行性运动和呼吸肌无力为特征。其他原因包括残余失活和基因缺失[1]。体外实验表明，利司他林在SMA细胞模型中具有高效性。它能够提高SMN蛋白的含量，并调控SMN2前体mRNA的剪接，从而生成全长SMN2 mRNA。与其他SMN2剪接修饰剂相比，该修饰剂对SMN2外显子7的剪接具有更高的特异性。通过检测SMN蛋白水平和外显子7的包含情况，证实了其活性。

为了进一步探究利司帕仑的分布，研究人员评估了利司帕仑在动物模型中的体外特性、体内药物浓度以及对不同组织中SMN蛋白表达的影响。小鼠（n = 90）、大鼠（n = 148）和猴子（n = 24）的血浆、肌肉和脑组织中的总药物浓度相似。正如预期，由于利司帕仑具有较高的被动渗透性且并非人多药耐药蛋白1的底物，猴子脑脊液中的药物浓度反映了血浆中的游离药物浓度。猴子每日一次服用利司帕仑，持续39周，其组织分布保持不变。在两种接受利司帕仑治疗的SMA小鼠模型中，中枢神经系统和外周组织中的SMN蛋白水平均呈剂量依赖性增加。这些体外和体内临床前数据强烈提示，患者接受利司帕仑治疗后血液中功能性SMN蛋白的增加应反映在中枢神经系统、肌肉和其他外周组织中功能性SMN蛋白的类似增加。 [1]
在体内，risdiplam 对 SMA 小鼠模型有效。它能提高 SMN2FL mRNA 和功能性 SMN 蛋白的水平。该药耐受性良好，I 期研究通过 SMN2 剪接向全长 SMN2 mRNA 的预期转变证实了其作用机制。该药在中枢和外周均有分布。目前正在进行针对 SMA 患者的 II/III 期研究。

体外转运实验[1]
本研究使用了亲代猪肾上皮细胞系LLC-PK1（Lewis肺癌猪肾1细胞）和犬肾上皮细胞系MDCKII。LLC-PK1、MDCKII、L-MDR1（转染人MDR1的LLC-PK1细胞）、L-Mdr1a（转染啮齿动物Mdr1a的LLC-PK1细胞）、M-BCRP（转染人乳腺癌耐药蛋白BCRP的MDCKII细胞）和M-Bcrp1（转染啮齿动物Bcrp1的MDCKII细胞）细胞系均根据许可协议使用。啮齿动物Mdr1a是一种鼠源蛋白，与大鼠Mdr1a具有95%的氨基酸序列同一性，因此在本文中统称为“啮齿动物”Mdr1a。实验方法如前所述。简而言之，将细胞培养于半透性96孔插入板（表面积0.11 cm²，孔径0.4 mm；Millipore）上，并在接种后第3天或第4天进行双向转运测量。移除顶端（100 mL）和基底外侧（240 mL）隔室中的培养基，并在接收侧加入不含酚红且含或不含抑制剂（L-MDR1和L-Mdr1a的zosuquidar浓度为1 μM；M-BCRP和M-Bcrp的Ko143浓度为1 μM）的培养基。通过向供体隔室中加入含有测试底物（risdiplam或RG7800，浓度为1 μM）和10 μM荧光黄的培养基来启动跨细胞转运。加入荧光素黄以确认单层细胞的完整性，并孵育参考底物作为MDR1/Mdr1a或BCRP/Bcrp活性的对照。将培养板置于37°C、5% CO2条件下，以100 rpm的转速持续振荡孵育3.5小时。从供体和受体室中取样（每种条件重复三次），并采用闪烁计数或高效液相色谱-串联质谱法进行分析。液相色谱分析采用10ADvp泵系统和PAL HTS自动进样器，质谱分析采用配备TurboIonspray离子源的API 4000或QTrap4000系统。
由于risdiplam靶向RNA而非蛋白质，因此其无细胞检测方法并非标准方法。其与SMN2前体mRNA的结合可通过表面等离子共振(SPR)或RNA下拉实验等技术进行评估。其促进外显子7插入的能力可通过SMN2微基因构建体的体外剪接实验进行测定。其纯度通过高效液相色谱法（HPLC）确认。

使用SMA患者来源的成纤维细胞或细胞系进行risdiplam的细胞活性检测。用不同浓度的risdiplam处理细胞，并通过RT-PCR检测SMN2剪接情况，以确定外显子7的包含情况。采用ELISA或Western blotting定量SMN蛋白水平。同时评估细胞活力和SMN蛋白功能。

大鼠研究设计（研究 6、7 和 8）[1]
利司帕林以 10 mM 抗坏血酸/0.01 mg/mL 硫代硫酸钠五水合物（pH 3）溶液的形式，每日一次通过灌胃法口服给药，给药体积为 10 mL/kg（研究 6）或 4 mL/kg（研究 7 和 8）。有关各研究的剂量和给药持续时间的详细信息，请参见表 1。每只动物均在异氟烷麻醉下处死。通过切断主要血管使动物放血。在放血前立即从颈静脉采集终末血样，并收集到含有 K3-EDTA 抗凝剂的试管中。将整个脑组织收集到标记的 7 mL Precellys® 匀浆管 (CK14) 中，在液氮中速冻，并储存在干冰上。组织经珠磨匀浆和/或用空白组织匀浆或空白大鼠血浆稀释。分析物通过乙腈/乙醇沉淀法从基质（EDTA血浆或组织匀浆）中分离，沉淀液中含有内标（¹³C、²D²稳定同位素标记的risdiplam或RG7800），并通过窄径高效液相色谱法（HPLC）与其他样品成分分离。检测采用加热电喷雾（HESI）串联质谱（MS/MS）正离子选择反应监测（SRM）模式。脑脊液和组织样品的定量分析以用相应空白组织匀浆或空白血浆稀释的大鼠血浆校准曲线为基准。 risdiplam 或 RG7800 在大鼠血浆中的定量下限 (LLOQ) 为 0.250 ng/mL（取 20 μL 等分试样），在脑脊液中的定量下限为 0.500 或 1.00 ng/mL，在组织中的定量下限为 2 ng/g（取 20 μL 组织匀浆）。

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猴子研究设计（研究 9 和 10）[1]
Risdiplam 或 RG7800 以 10 mM 抗坏血酸/0.01 mg/mL 硫代硫酸钠五水合物（pH 3）溶液的形式，每日一次通过灌胃法口服给药，给药体积为 1.5 mL/kg（研究 9）或 5 mL/kg（研究 10）。有关各项研究的剂量和给药持续时间的详细信息，请参见表1。给药结束后，处死动物，收集终末血浆和组织样本并冷冻保存。在研究10中，分别收集脑干和皮质样本（0.5 g）。从所有动物中采集0.5 mL脑脊液样本。将组织匀浆并用空白食蟹猴血浆稀释。按照研究6-8所述的方法从基质中分离分析物。采用HESI MS/MS正离子SRM模式进行检测。使用20 μL等分试样，食蟹猴血浆中的定量下限（LLOQ）为0.250 ng/mL（研究9）或0.500 ng/mL（研究10）。所有其他样本均根据食蟹猴血浆校准曲线进行定量。由于样本稀释，脑脊液（研究 9）中的定量下限为 0.500 ng/mL，组织中的定量下限介于 0.500 至 5000 ng/g 之间（脑组织中为 10.0 ng/g）。研究 10 采用了一种专用的、灵敏的脑脊液检测方法，其定量下限为 0.100 ng/mL。游离血浆浓度通过将测得的血浆总浓度乘以测得的血浆游离分数（成年食蟹猴为 15%）计算得出。

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大鼠定量全身放射自显影 (QWBA) 研究设计（研究 13）[1]
Wistar 大鼠接受单次口服 14C-risdiplam 或 RG7800（通过胃灌注），或单次静脉注射 14C-risdiplam 或 RG7800（通过尾静脉注射）。口服剂量为 5 mg/kg，静脉注射剂量为 2 mg/kg。对于全身放射自显影，在异氟烷深度麻醉后，分别于给药后以下时间点对单只动物进行冷休克处死（冷休克液为过量干冰的己烷混合物）：静脉给药组10分钟，口服给药组2、24、72和168小时。动物尸体完全冷冻后，进行全身放射自显影处理。使用经验证的图像分析系统，从全身放射自显影图像中定量分析组织中的放射性浓度。将成像板置于铜衬铅曝光箱中曝光7天后，使用FUJI FLA 5000或5100放射发光成像系统进行处理。使用经验证的基于PC的图像分析软件包分析电子图像。在终末麻醉状态下，通过心脏穿刺从每只动物身上采集约 3 mL 血液，注入预先涂有肝素锂的试管中。测定血液和血浆的总放射性。

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小鼠研究设计（研究 1、2、3、4、5、11 和 12）[1]
本研究使用了两种不同的 SMA 小鼠模型。在成年小鼠的研究中，使用了轻度 SMA 的 C/C 等位基因小鼠模型。与正常小鼠相比，C/C 等位基因小鼠的寿命接近正常，但表现出肌肉功能下降、体重增长减少和外周坏死。此外，还使用了新生 SMNΔ7 小鼠，这是一种重度 SMA 小鼠模型。这些小鼠在出生后约2周死亡。成年小鼠口服给药时，化合物配制成含0.1% Tween 80的0.5%羟丙基甲基纤维素悬浮液。幼鼠腹腔注射（IP）给药时，化合物配制成二甲基亚砜溶液，给药体积为2.5 mL/kg。重复给药时，化合物每日给药一次。在研究5中，小鼠从出生后第3天（PND3）至第23天（PND23）进行腹腔注射给药，从PND24开始进行灌胃给药。有关各研究的剂量和给药持续时间的详细信息，请参见表1。
risdiplam的体内动物实验在SMA小鼠模型中进行。小鼠口服risdiplam，并在包括脑和脊髓在内的各种组织中测量SMN2剪接和SMN蛋白水平。评估运动功能、生存率和疾病进展。这些研究证实了其体内疗效，并支持其临床开发。

吸收、分布和排泄
口服给药后达峰时间 (Tmax) 约为 1-4 小时。每日一次，随早餐服用（或哺乳后服用），利西他普兰可在约 7-14 天内达到稳态血浆浓度。在 SMA 患者中，所有研究剂量下利西他普兰的药代动力学均近似呈线性。口服 18 mg 利西他普兰后，约 53% 的剂量经粪便排泄，28% 经尿液排泄。未代谢的肠外给药药物占粪便排泄的 14% 和尿液排泄的 8%。口服后，利西他普兰在中枢神经系统和外周组织中分布良好。稳态表观分布容积为 6.3 L/kg。对于体重 14.9 kg 的患者，利西他普兰的表观清除率为 6.3 L/kg。代谢/代谢物 赖肝素的代谢主要由黄素单加氧酶1和3（FMO1和FMO3）介导，CYP1A1、CYP2J2、CYP3A4和CYP3A7也参与其中。母体药物约占循环药物总量的83%。一种药理学上无活性的代谢物M1已被确定为主要的循环代谢物——体外研究表明，M1与母体药物类似，能够抑制MATE1和MATE2-K转运蛋白。生物半衰期 赖肝素在健康成人体内的末端消除半衰期约为50小时。
利司他普兰的分子量为401.46 g/mol，分子式为C22H23N7O。它是一种小分子，具有口服生物利用度。它可溶于DMSO，应在推荐条件下储存。其药代动力学特征表现为良好的口服吸收和向中枢神经系统及周围组织的分布。

蛋白结合
利西他林在血浆中的蛋白结合率约为 89%，主要与血清白蛋白结合。肝毒性
在注册前临床试验中，利西他林治疗未引起血清实验室参数的临床显著变化；利西他林组和安慰剂组的血清 ALT、AST 和胆红素水平无差异。尽管安全性结果仅基于数百例患者，但尚未报告疑似药物性肝损伤伴黄疸的病例。此外，自利西他林于 2020 年获批以来，尚未有已发表的具有临床意义的肝损伤病例。概率评分：E（不太可能是导致具有临床意义的肝损伤的原因）。
利西他林的毒理学特征已在临床试验中得到评估。其耐受性良好。与早期化合物相比，它在临床前模型中显示出更大的安全窗口，包括对脱靶视网膜病变的保护。一期临床研究中未报告严重不良事件。其安全性支持用于脊髓性肌萎缩症（SMA）患者。

[1]. Risdiplam distributes and increases SMN protein in both the central nervous system and peripheral organs. Pharmacol Res Perspect. 2018 Nov 29;6(6):e00447.

利司迪普拉姆（Risdiplam）是一种口服生物利用度高的mRNA剪接调节剂，用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。它通过增强SMN2基因的转录效率来提高全身SMN蛋白浓度。其作用机制与其前药诺西那生（nusinersen）相似，主要区别在于给药途径：诺西那生需要鞘内注射，一次性基因疗法onasemnogene abeparvovec也需要鞘内注射，而利司迪普拉姆具有口服生物利用度高的便利性。利司迪普拉姆于2020年8月获得FDA批准用于治疗SMA。与其他现有的SMA疗法相比，利司迪普拉姆有望显著降低成本，为各种严重程度和类型的SMA患者提供一种新型且相对容易获得的治疗选择。利司迪普拉姆是一种运动神经元存活2（SMN2）剪接调节剂。利沙帕兰的作用机制是作为运动神经元存活2剪接调节剂、多药和毒素外排转运蛋白1 (SMN1) 抑制剂以及MMN2K抑制剂。利沙帕兰的生理效应是通过增加蛋白质合成实现的。适应症：利沙帕兰适用于治疗脊髓性肌萎缩症 (SMA)。依维斯特兰适用于治疗临床诊断为1型、2型或3型脊髓性肌萎缩症 (SMA) 的5q脊髓性肌萎缩症 (SMA) 患者，或携带1至4个SMN2基因拷贝的患者。作用机制：脊髓性肌萎缩症 (SMA) 是一种严重的进行性先天性神经肌肉疾病，由运动神经元存活基因1 (SMN1) 的突变引起，该基因负责合成SMN蛋白。SMA的临床特征包括脊髓运动神经元的退化，最终导致肌肉萎缩，在某些情况下还会导致肌力丧失。 SMN蛋白广泛分布于全身，被认为在多种细胞内过程中发挥重要作用，包括DNA修复、细胞信号传导、内吞作用和自噬。第二个SMN基因（SMN2）也产生SMN蛋白，但其序列中一个微小的核苷酸替换导致约85%的转录本在剪接过程中缺失第7外显子——这意味着SMN2产生的SMN蛋白中只有约15%具有功能，不足以弥补SMN1突变造成的缺陷。越来越多的证据表明，许多细胞和组织对SMN浓度降低具有选择性敏感性，这使得SMN蛋白成为治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的理想靶点。利司迪普拉姆（Risdiplam）是一种SMN2 mRNA剪接调节剂，它能增加剪接过程中第7外显子的包含，最终增加SMN2产生的功能性SMN蛋白的数量。它通过与SMN2前体mRNA上的两个位点结合发挥作用：内含子7的5'剪接位点（5'ss）和外显子7的外显子剪接增强子2（ESE2）。

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药效学
利西他布拉姆通过刺激体内关键蛋白的生成来帮助缓解脊髓性肌萎缩症（SMA）的症状。早期利西他布拉姆试验表明，治疗12周后，SMA患者体内SMN蛋白的浓度可增加至多2倍。

利司他布（Risdiplam）是一种获得FDA批准的药物，以商品名Evrysdi上市，用于治疗脊髓性肌萎缩症。它是一种口服的小分子SMN2剪接调节剂。它由罗氏公司开发，是首个用于治疗SMA的口服药物。它已获准用于成人和儿童。
它也被称为 RG-7916 和 RO-7034067。

C22H23N7O

401.464323282242

401.2

C, 65.82; H, 5.77; N, 24.42; O, 3.99

1825352-65-5

Risdiplam-d4

118513932

White to yellow solid powder

0.5

78.1

1

6

2

30

886

0

ASKZRYGFUPSJPN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H23N7O/c1-14-9-18(26-29-11-15(2)24-21(14)29)17-10-20(30)28-12-16(3-4-19(28)25-17)27-8-7-23-22(13-27)5-6-22/h3-4,9-12,23H,5-8,13H2,1-2H3

7-(4,7-diazaspiro[2.5]octan-7-yl)-2-(2,8-dimethylimidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl)pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one

RG7916; RO703406; RG-7916; RO-7034067; Risdiplam; 1825352-65-5; Evrysdi; Risdiplam [INN]; RG 7916; RO 7034067; Evrysdi

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~1.7 mg/mL (~4.2 mM)
Ethanol: < 1 mg/mL
H2O: < 0.1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。