ASK1 (pIC50 = 8.3)

Selonsertib (GS-4997) 是一种临床阶段的 ASK1 抑制剂，已被评估为肾纤维化和糖尿病肾病的潜在治疗方法[1]。 Selonsertib (GS-4997) 是一种每日一次的口服 ASK1 抑制剂，具有高选择性和效力，可与 ASK1 催化激酶结构域中的 ATP 竞争。

一种口服生物可利用的凋亡信号调节激酶 1 (ASK1) 抑制剂，可能具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化特性。 ATP 竞争性 ASK1 抑制剂 GS-4997 口服后靶向并结合 ASK1 的催化激酶结构域，防止其磷酸化和激活。这会阻止下游激酶，包括 p38 MAPK 和 c-Jun N 末端激酶 (JNK) 磷酸化。 GS-4997 可抑制细胞增殖，下调纤维化相关基因的表达，并通过阻止 ASK1 依赖性信号转导途径的激活来抑制过度细胞凋亡 [2]。炎症细胞因子的产生也被阻止。

ASK1酶抑制试验[3]
材料：使用ASKI重组蛋白和HTRF®KinEASE™STK底物3试剂盒。根据供应商提供的方案，在pH 7.0的250mM Hepes缓冲液中进行激酶测定，缓冲液中含有NaN3 0.1%, 0.05% BSA， 0.5mM正钒酸盐，5mM MgCl2,1mM DTT, 1% DMSO（复合添加后）。[3]

方法：IC50测定——在化合物（不同浓度，0 ~ 10uM）、固定剂量的ATP （200uM，终浓度）、底物STK3 （1uM，终浓度）存在下测定每种化合物的IC50值。加入ASK1 （10nM，终浓度）启动酶促反应。实验在室温（~ 22℃）下进行。60 min后，使用CisBio试剂盒提供的停止试剂停止酶促反应。使用Multidrop Combi试剂分配器将所有试剂分配到白色384 SV格莱纳板中。利用BMG PHERAstar平板阅读器在337 nm（激发波长）处检测产物的释放度，并测量665/620 nm（发射波长）的荧光比。[3]

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人和大鼠肝微粒体稳定性测定：[3]
混合的大鼠或人肝微粒体在进一步处理前迅速解冻。在Tecan液体处理机上，将室温NADPH溶液加入含有测试化合物或对照化合物以及肝微粒体的预热孔中，开始反应。最终培养液（20 μL）含有1 μM试验化合物或对照物、肝微粒体（0.5 mg/mL）、2 mM NADPH和50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）。37℃孵育0、5、15、30分钟。加入40 μL 0.1 M的三氯乙酸（TCA）猝灭液终止反应。在4500g下离心20 min，用LC-MS/MS测定上清液中被试化合物或对照物的峰面积。Waters Quattro Premier UPLC-MS/MS系统包括Acquity二元溶剂管理器使用Waters Acquity样本管理器和Waters Acquity样本管理器进行肝微粒体样本分析。使用Waters MassLynx软件进行仪器控制、数据采集、数据处理和色谱/光谱浏览。液相色谱使用本·C18海域,执行1.7μm, ID 2.1 x 50毫米50°C列与流动相洗脱:0.04%的甲酸水和流动相乙:0.04%的甲酸乙腈流量为0.35毫升最低为1和一个梯度1%到99%的B / 1.0分钟。代谢半衰期(t1/2)值计算使用公式1,一个是初始峰面积表示为100%,一阶速率常数k, t是时间分钟。[3]

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Selonsertib（也称为 GS-4997）是一种高选择性和强效的每日一次口服 ASK1（凋亡信号调节激酶 1）抑制剂，具有高强效和选择性，pIC50 为 8.3-0.07。 Selonsertib (GS-4997) 是一种每日一次的口服 ASK1 抑制剂，具有高选择性和效力，可与 ASK1 催化激酶结构域中的 ATP 竞争。

ASK1-HEK293 P-JNK细胞测定。[3]
利用四环素诱导基因表达（Tet-on）系统对人ASK1/HEK-293细胞进行工程化，使其表达人ASK1，该系统通过在培养基中添加四环素（Tet）来激活感兴趣的基因。细胞保存在含有10%胎牛血清、100units/ml青霉素G/100ug/ ml硫酸链霉素、500ug/ml遗传素和5ug/ml囊胚素的DMEM高糖培养基中。细胞以300,000个细胞/ml， 145ul/孔的剂量接种于96孔黑色透明板上，涂有PolyD Lysine，在37°C下5% CO2下孵育5小时，然后在所有孔中加入15ul四环素（11ug/ml）诱导ASK1表达（没有Tet/ no H2O2阴性对照除外）。细胞在37°C、5% CO2下孵育过夜。第二天早上制备5倍浓度连续稀释的复方板，每次稀释取0.040 mL转移到细胞板上。然后在37°C下5% CO2下孵育30分钟，然后通过在所有孔中添加20ul 10mM H2O2激活ASK-1 30分钟（阴性对照除外）。在H2O2孵育结束时，轻轻抽吸细胞上清，加入70ul/well的全MSD裂解缓冲液裂解细胞。采用MESO Scale ELISA法检测磷酸化和总JNK水平。[3]

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小鼠巨噬细胞RAW264.7在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的1640培养基中培养，并在含5% CO2的湿化气氛中37℃保存。将细胞用Selonsertib (GS-4997)（5µM）或mdivi（10µM）预孵育6 h，然后用LPS （500 ng/ml）孵育4 h，收集上清和细胞样本进行进一步分析[4]。

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一种口服生物可利用的凋亡信号调节激酶 1 (ASK1) 抑制剂，可能具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化特性。 ATP 竞争性 ASK1 抑制剂 GS-4997 口服后靶向并结合 ASK1 的催化激酶结构域，防止其磷酸化和激活。这会阻止下游激酶，包括 p38 MAPK 和 c-Jun N 末端激酶 (JNK) 磷酸化。 GS-4997 可抑制过度细胞凋亡、抑制细胞增殖、下调纤维化相关基因的表达，并通过阻止 ASK1 依赖性信号转导途径的激活来阻止炎症细胞因子的产生。

ALF小鼠模型及治疗[4]
将C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS（10 μg/kg，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）和D-GalN（400 mg/kg，Sigma-Aldrich），建立LPS/GalN诱导的ALF小鼠模型。在LPS/GalN注射前30分钟或注射后0.5、1、2和4小时，腹腔注射Selonsertib (GS-4997)（15、30和60 mg/kg，MCE）。为了进一步研究JNK通路在介导Selonsertib (GS-4997)保护作用中的作用，本研究采用腹腔注射法给予JNK激活剂茴香霉素（20 mg/kg，MCE），并联合使用Selonsertib (GS-4997)。另设一组小鼠，在LPS/GalN注射前30分钟腹腔注射mdivi（30 mg/kg，MCE）。对照组注射溶剂（n = 6）。分别于LPS/GalN注射后0.5、1、2、4和6小时处死小鼠，采集血清和肝脏样本以评估肝损伤程度。同时检测血清的生化指标。对肝脏样本进行组织化学和蛋白质印迹分析。大鼠药代动力学：[3]
对已插管的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠禁食过夜后，以5 mg/kg的剂量通过灌胃给予19（Selonsertib (GS-4997)的类似物），该化合物配制于20% (2-羟丙基)-β-环糊精的0.05M甲磺酸溶液中。给药体积为5 ml/kg，19以1 mg/ml的浓度配制成溶液。保留剩余的给药液，并分析其精确的剂量浓度。给药后，分别于0.25、0.5、1、2、4、7和24小时，通过颈静脉导管从清醒的动物身上采集200 μl血液。血液样本保存在冰上，直至进行血浆处理。血浆样品经5℃离心制备后，冷冻保存于-70℃直至分析。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析19种血浆浓度。简而言之，取25 μL血浆与100 μL含有适量内标的乙腈混合。样品涡旋振荡1分钟后，于2-8℃下以300 rpm离心5分钟。取40 μL上清液，用水以1:2的比例稀释，并涡旋振荡5分钟。使用配备岛津液相色谱系统和LEAP自动进样器的AB Sciex API-4000三重四极杆质谱仪进行分析。采用反相梯度洗脱法，在Phenomenex Kinetic C18色谱柱（2.1 mm内径×50 mm；粒径5.0 μm）上，流速为0.500 mL/min，对测试样品进行分离。流动相为水（A）和乙腈（B），两者均添加了0.04%（体积比）的甲酸。样品经电离后，采用多反应监测（MRM）模式进行检测，监测m/z 394.051→336.100的离子对。使用在混合大鼠血浆中制备的含内标的分析物标准品对样品进行定量。该方法的定量下限为1.00 ng/mL，线性范围为1.00 ng/mL至2500 ng/mL。朗根多夫灌注心脏模型：[3]
雄性Sprague Dawley大鼠购自Harlan实验室，并在实验前适应环境至少48小时。每笼饲养2-3只大鼠，实验期间自由摄取食物和水。在离体缺血/再灌注（I/R）前1、4、6或8小时，分别给予大鼠赋形剂或化合物。采用恒压循环朗根多夫装置进行整体无血流离体I/R。在腹腔注射氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（7.5 mg/kg）前10分钟，给予大鼠500 U/kg肝素。术前皮下注射镇痛药（盐酸丁丙诺啡，0.05 mg/kg）。确认麻醉和镇痛深度合适后，处死动物，迅速取出心脏并置于冰冷的改良克雷布斯-亨塞莱特缓冲液中。随后对主动脉进行插管，将心脏安装于朗根多夫灌注装置上，并以80 mmHg的恒定压力用含氧克雷布斯-亨塞莱特缓冲液进行灌注。心脏始终浸没在温度为37°C的缓冲液中。经过30分钟的平衡期后，心脏经历30分钟的无血流缺血，随后进行90分钟的再灌注。缺血/再灌注结束后，将心脏置于干冰上速冻，并使用大鼠心脏切片器和剃须刀片进行冠状切片，切成3毫米厚的切片（共6块）。然后用1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色10分钟以显示存活组织，最后在10%福尔马林溶液中固定过夜。

[1]. Nephron . 2015;129(1):29-33.

[2]. NCI Drug Dictionary. ASK1 inhibitor GS-4997

[3]. ACS Med Chem Lett . 2017 Feb 8;8(3):316-320.

[4]. Cell Biosci . 2021 Jan 7;11(1):9.

Selonsertib 正在临床试验 NCT03053050（Selonsertib 治疗成人非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 和桥接 (F3) 纤维化的安全性和有效性研究）中进行研究。
Selonsertib 是一种口服生物利用度高的凋亡信号调节激酶 1 (ASK1) 抑制剂，具有潜在的抗炎、抗肿瘤和抗纤维化活性。口服后，Selonsertib 以 ATP 竞争性方式靶向并结合 ASK1 的催化激酶结构域，从而阻止其磷酸化和激活。这可以阻止下游激酶（例如 c-Jun N 端激酶 (JNK) 和 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 MAPK)）的磷酸化。 GS-4997 通过抑制 ASK1 依赖性信号转导通路的激活，从而抑制炎症细胞因子的产生，下调纤维化相关基因的表达，抑制过度凋亡并抑制细胞增殖。ASK1，又称丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶 5 (MAP3K5)，在氧化应激、内质网 (ER) 应激、钙离子内流和感染等情况下被激活。它在某些心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病以及某些类型癌症的发生发展中起着关键作用。

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药物适应症
用于治疗非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)。

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凋亡信号调节激酶 1 (ASK1/MAP3K) 是丝裂原活化蛋白激酶家族成员，已被证实参与急性缺血/再灌注损伤。利用基于结构的药物设计方法，对已知的ASK1抑制剂进行解构和重新优化，鉴定出一种先导化合物。该化合物在离体灌注心脏损伤模型中表现出对MAP3K通路的强效抑制作用，并能缩小梗死面积。[3]

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背景：急性肝衰竭（ALF）死亡率高，除肝移植和人工肝疗法外，目前尚无其他有效治疗方法。本研究旨在探讨选择性ASK1抑制剂selonsertib治疗ALF的效果、治疗窗口和机制。结果：采用脂多糖/D-半乳糖胺（LPS/GalN）模型模拟ALF。我们发现，selonsertib预处理可显著改善ALF，表现为肝坏死面积减少，血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和炎症细胞因子水平降低。然而，selonsertib 仅在 LPS/GalN 给药后早期有效，其有限的治疗窗口与 JNK 和 DRP1 的激活及其线粒体转位有关。进一步的实验表明，selonsertib 可通过评估巨噬细胞的线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔的开放情况来减轻 LPS 诱导的巨噬细胞线粒体损伤。此外，selonsertib 还通过减少 DRP1 介导的线粒体功能障碍来抑制巨噬细胞中炎症细胞因子的释放，这一结果已通过使用特异性 DRP1 抑制剂 mdivi 得到证实。结论：selonsertib 通过减弱 JNK 介导的 DRP1 线粒体转位，进而挽救巨噬细胞中的线粒体损伤，从而保护机体免受 LPS/GalN 诱导的急性肝衰竭 (ALF) 的损伤，并可能具有治疗早期 ALF 患者的潜力。[4]

C24H25CLFN7O

481.953006505966

481.179

C, 59.81; H, 5.23; Cl, 7.36; F, 3.94; N, 20.34; O, 3.32

1448428-05-4

1448428-04-3;1448428-05-4 (HCl);

71654746

Typically exists as solid at room temperature

90.5

2

6

6

34

692

0

Cl.FC1=CC(C)=C(C=C1C(NC1=CC=CC(C2=NN=CN2C(C)C)=N1)=O)N1C=NC(=C1)C1CC1

DQKKBHINKKMQHS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H24FN7O.ClH/c1-14(2)32-13-27-30-23(32)19-5-4-6-22(28-19)29-24(33)17-10-21(15(3)9-18(17)25)31-11-20(26-12-31)16-7-8-16;/h4-6,9-14,16H,7-8H2,1-3H3,(H,28,29,33);1H

5-(4-cyclopropylimidazol-1-yl)-2-fluoro-4-methyl-N-[6-(4-propan-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-2-yl]benzamide;hydrochloride

Selonsertib hydrochloride; 1448428-05-4; Selonsertib HCl; A24IO3O2HW; Selonsertib HCl salt, GS-4997 HCl salt; 1448428-05-4 (HCl); 5-(4-cyclopropylimidazol-1-yl)-2-fluoro-4-methyl-N-[6-(4-propan-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-2-yl]benzamide;hydrochloride; Benzamide, 5-(4-cyclopropyl-1H-imidazol-1-yl)-2-fluoro-4-methyl-N-(6-(4-(1-methylethyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)-2-pyridinyl)-, hydrochloride (1:1);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。