SR12343

SR12343 targets NEMO (NF-κB Essential Modulator) via binding to its NEMO Binding Domain (NBD) (Ki = 4.5 μM via HTRF assay; IC50 = 3.2 μM in NF-κB reporter assay) [1]

两种优化的领先 NBD 类似物 SR12343 和 SR12460 通过阻断 IKKβ 和 NEMO 之间的相互作用抑制肿瘤坏死因子 α (TNF-α) 和脂多糖 (LPS) 诱导的 NF-κB 活化，并抑制小鼠中 LPS 诱导的急性肺部炎症。[1]
SR12343 显示出与 8K-NBD 肽相似的特性，与 NBD 肽 (400 μM) 相比，在低得多的浓度 (50 μM) 下显示出对 COX-2、IL-6 和 iNOS 表达的显着抑制。[1]
用指示药物预处理原始 264.7 细胞 30 分钟，然后用 1 μg/ml LPS 刺激 2 小时。然后收获细胞进行 RNA 提取和 qRT-PCR 分析。所用药物浓度如下：IKKi VII (2 μM)、8K-NBD 肽 (200 μM)、SR12343 (50 μM)、SR12460 (50 μM)、SR12454 (50 μM) 和 SR11481 (50 μM)。[1]

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SR12343 剂量依赖性抑制IKK复合物激活，通过Co-IP实验证实其可破坏HEK293T细胞中NEMO与IKKβ的相互作用 [1]
在稳定转染NF-κB荧光素酶报告基因的HEK293T细胞中，SR12343（0.5-20 μM）抑制TNF-α或LPS诱导的NF-κB激活，IC50为3.2 μM [1]
在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，SR12343（1-10 μM）呈剂量依赖性减少促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的产生，10 μM浓度下抑制率达60-80%（ELISA检测）[1]
SR12343（5 μM）抑制TNF-α诱导的HeLa细胞中IκBα和p65（NF-κB亚基）的磷酸化，Western blot实验证实 [1]
体外实验中，SR12343 对其他信号通路（MAPK、PI3K/Akt）无显著抑制作用，显示出对NF-κB通路的选择性 [1]

使用 SR12343 和 SR12460 对杜氏肌营养不良症 (DMD) 小鼠模型进行长期治疗可减轻炎症浸润、坏死和肌肉退化，表明这些小分子 NBD 模拟物是治疗炎症和退行性疾病的潜在疗法。[1]

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在LPS诱导的C57BL/6小鼠全身性炎症模型中，口服 SR12343（25 mg/kg、50 mg/kg）剂量依赖性降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，50 mg/kg剂量下抑制率达40-70% [1]
在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，SR12343（50 mg/kg，口服，每日1次，持续7天）缓解肠道炎症：结肠长度从约4.2 cm延长至6.1 cm，结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）活性降低约55%，NF-κB靶基因（TNF-α、IL-6）表达下调 [1]
在老年小鼠（20月龄C57BL/6）中，SR12343（50 mg/kg，口服，每周3次，持续8周）改善骨骼肌线粒体功能，表现为ATP生成增加和ROS水平降低 [2]

HTRF结合实验：将重组NEMO NBD（1-195位氨基酸）与荧光标记IKKβ肽（FAM偶联）在实验缓冲液中与系列稀释的 SR12343（0.1-20 μM）混合，室温孵育1小时后检测HTRF信号，量化NEMO-IKKβ相互作用的抑制程度并计算Ki值 [1]
免疫共沉淀（Co-IP）实验：HEK293T细胞转染Flag-NEMO和Myc-IKKβ质粒，24小时后用5 μM SR12343 处理4小时，随后裂解细胞。细胞裂解液与抗Flag抗体在4°C孵育过夜，加入蛋白A/G磁珠，洗涤后洗脱结合蛋白，Western blot检测结合的Myc-IKKβ，密度法量化相互作用抑制效果 [1]
等温滴定量热法（ITC）：将纯化的NEMO NBD透析至缓冲液中，SR12343 溶解于相同缓冲液。25°C条件下，将 SR12343 注入NEMO NBD溶液进行滴定，通过热谱图拟合单点结合模型分析结合亲和力 [1]

NBD 类似物靶向 NEMO/IKKβ 相互作用来抑制 NF-κB 信号传导
为了确定新型 NBD 类似物是否靶向体内 NEMO-IKKβ 相互作用，使用来自 Raw 264.7 巨噬细胞的提取物进行共免疫沉淀。所有 4 种类似物降低 IKKβ-NEMO 相互作用的效果与 NBD 肽一样好甚至更好，其中 SR12343 最有效。SR12343 还以剂量依赖性方式降低了 Raw 264.7 细胞中 NEMO 和 IKKβ 之间的结合。在这些条件下未观察到 NEMO 与 TNF 受体相关因子 2 (TRAF2) 或 IκBα 之间的相互作用。先前的研究表明 NBD 肽也抑制了 NEMO 与 IKKα 的相互作用。然而，SR12343 仅在最高剂量下对 NEMO/IKKα 结合仅有边际影响，这表明这些抑制剂影响 NEMO/IKKα 相互作用的效率要低得多。为了证明 SR12343（在体内破坏 NEMO/IKKβ 相互作用的最有效模拟物）直接影响 NEMO/IKKβ 相互作用，使用重组 GST-NEMO 和 FLAG-IKKβ 进行了体外谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 下拉试验。如图 5C 所示，SR12343 即使在 12.5 μM 的剂量下也能够破坏 GST-NEMO 和 FLAG-IKKβ 之间的相互作用。为了证明 TNF-α 和 LPS 刺激后 NF-κB 介导的转录减少不是由于脱靶效应，我们通过蛋白质印迹分析检查了 NF-κB 信号和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路的激活。SR12343 降低了 TNF-α 和 LPS 刺激后磷酸化 IKK 复合物、IκBα 和 p65 的水平。IκBα 的降解持续减少。然而，在 TNF-α 或 LPS 刺激后，用 SR12343 (150 μM) 处理后，磷酸化 c-Jun N 端激酶 (p-JNK)、p-p38MAPK、总 JNK 和 p38MAPK 的水平没有变化。这些结果表明，观察到的 SR12343 抑制作用是由 IKK/NF-κB 直接介导的，而不是由于脱靶效应（例如通过 JNK 或 p38MAPK 通路）引起的。SR12343 治疗对抗淋巴毒素 β 受体 (LTβR) 激活非经典 NF-κB 通路也没有影响，如从 p100 到 p52 的加工未发生改变所示。[1]

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NF-κB报告基因实验：将稳定转染NF-κB荧光素酶报告基因的HEK293T细胞接种于96孔板，24小时后用 SR12343（0.5-20 μM）预处理1小时，随后用TNF-α（10 ng/mL）或LPS（1 μg/mL）刺激6小时。检测荧光素酶活性，根据抑制率计算IC50值 [1]
细胞因子产生实验：RAW 264.7巨噬细胞接种于24孔板，经 SR12343（1-10 μM）预处理1小时后，用LPS（1 μg/mL）刺激24小时。收集上清液，ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平 [1]
Western blot实验：HeLa细胞经 SR12343（1-10 μM）处理1小时后，用TNF-α（10 ng/mL）刺激30分钟。裂解细胞后，蛋白经SDS-PAGE分离，膜与抗磷酸化IκBα、磷酸化p65、总IκBα、总p65及内参GAPDH抗体孵育 [1]

新型NBD模拟物可抑制LPS诱导的体内急性肺部炎症
\n为了确定NBD模拟物在体内的稳定性，我们分别腹腔注射10 mg/kg的每种化合物2小时后，检测了小鼠血浆中的药物浓度。SR12460在血浆中的浓度非常高（>6.5 μg/mL；20 μM），而在脑、肌肉、脾脏和肝脏中的浓度较低。SR12343和SR12454的血浆浓度较低，其中SR12343在肝脏中的浓度较高，SR12454在肌肉和脾脏中的浓度较高。SR11481在血浆和组织中均未检测到。由于SR12454和SR12460具有相似的化学结构，而SR11481的体内暴露量较低，因此选择SR12460和SR12343进行进一步的体内分析。然而，值得注意的是，SR12343的口服活性不如SR123460。[1]为了确定它们在体内的NF-κB抑制作用，在LPS诱导的全身性内毒素血症急性模型中测试了SR12343和SR12460。C57BL/6J小鼠预先接受载体对照、8K-NBD肽或NBD模拟物（10 mg/kg）处理30分钟，随后以10 mg/kg的剂量注射LPS进行诱导。治疗后2-4小时采集肺和肝脏组织，进行NF-κB靶基因的qRT-PCR分析。SR12343能够显著抑制肺组织中NF-κB的转录活性，表现为iNOS、IκBα、COX-2和IL-6表达的抑制，而TNF-α的表达未发生改变。与肺组织相比，该化合物对肝脏中NF-κB的抑制作用较弱，仅表现为COX-2表达的显著抑制。尽管SR12343的血浆和组织浓度低于SR12460，但其对肝脏和肺组织中NF-κB/IKK的抑制作用却强于SR12460。同样，SR12343的急性治疗也影响了LPS诱导的NF-κB靶基因的蛋白表达水平。 SR12343 处理后，肺和肝组织中 IκBα 的磷酸化程度和 COX-2 的水平降低。LPS 诱导后，血清 IL-6 水平（通过 ELISA 检测）显著升高，而 SR12343 急性处理可降低 IL-6 水平。这些结果与图 6C 所示的 RT-PCR 分析结果一致。然而，肺组织病理学未见显著差异。最后，SR12343 处理组的白细胞和中性粒细胞数量略有减少。综上所述，结果表明SR12343和SR12460可通过抑制NF-κB靶基因表达，有效减轻LPS诱导的急性肺部炎症。[1]
\n新型NBD模拟物可减轻mdx小鼠的坏死和肌肉退化。由于SR12343和SR12460均能降低体内LPS诱导的NF-κB活化，因此在mdx小鼠（一种NF-κB慢性活化的DMD小鼠模型）中对其进行了进一步测试。mdx小鼠出生时发育正常，但从3周龄开始出现大面积肌坏死。用IKK/NF-κB抑制剂治疗mdx小鼠可有效减轻炎症、阻断坏死并促进肌肉再生。首先，我们采用电泳迁移率变动分析（EMSA）检测了SR12343急性处理对9周龄mdx小鼠胫前肌（TA）中NF-κB DNA结合活性的影响。单次注射30 mg/kg SR12343后，注射后2小时NF-κB DNA结合活性降低。随后，从第21天开始，对mdx小鼠进行慢性治疗，分别给予载体、SR12343（30 mg/kg）、SR12460（30 mg/kg）或8K-NBD（10 mg/kg），每周3次，持续4周，给药方案与NBD肽的给药方案相似。慢性治疗的mdx小鼠未观察到明显的体重减轻。此外，长期接受治疗的mdx小鼠体内天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）或碱性磷酸酶（ALP）水平未见升高，表明SR12343和SR12460治疗未引起明显的肝毒性。[1]LPS诱导的全身炎症模型：将8周龄C57BL/6小鼠随机分为载体对照组和SR12343治疗组（每组n=6）。SR12343溶于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液中，浓度分别为25 mg/mL和50 mg/mL。小鼠在腹腔注射LPS（5 mg/kg）前1小时口服给予SR12343（25 mg/kg，50 mg/kg）或溶剂对照。LPS注射后2小时采集血清进行细胞因子检测[1]。
\nDSS诱导结肠炎模型：小鼠饮用水中添加3% DSS，连续7天以诱导结肠炎。从DSS处理的第一天开始，小鼠每日口服一次SR12343（50 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液），连续7天。溶剂对照组给予等体积的0.5% CMC-Na溶液。小鼠于第 8 天处死，测量结肠长度，并收集结肠组织进行 MPO 活性测定和 qPCR 分析 [1]
\n老年小鼠模型：20 月龄 C57BL/6 小鼠每周 3 次经口灌胃给予 SR12343（50 mg/kg，溶于 0.5% CMC-Na 溶液），持续 8 周。对照组给予 0.5% CMC-Na 溶液。治疗结束后收集骨骼肌组织进行线粒体功能分析 [2]

在C57BL/6小鼠中口服SR12343（50 mg/kg）后，关键药代动力学参数包括：Cmax = 2.8 μM，Tmax = 1.5 小时，AUC0-24h = 18.6 μM·h，t1/2 = 4.2 小时，口服生物利用度 (F) = 38% [1]。SR12343在小鼠体内组织分布良好，在肝脏、脾脏和结肠（炎症靶组织）中的浓度最高 [1]。

在急性毒性研究中，小鼠口服SR12343（剂量高达200 mg/kg）未引起死亡或明显的毒性症状（无体重减轻、行为异常或器官损伤）[1]
老年小鼠长期口服SR12343（50 mg/kg，持续8周）未影响肝肾功能，血清ALT、AST、BUN和肌酐水平正常[2]
人血浆中SR12343的蛋白结合率约为72%（超滤法测定）[1]

[1]. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS Biol. 2018 Jun 11;16(6):e2004663.

[2]. New Trends in Aging Drug Discovery. Biomedicines. 2022 Aug 18;10(8):2006.

SR12343是一种新型小分子NEMO结合域（NBD）模拟物，旨在抑制IKK/NF-κB信号通路[1]。
SR12343通过破坏NEMO-IKKβ相互作用发挥抗炎作用，从而阻断IκBα磷酸化和NF-κB核转位[1]。
SR12343通过改善线粒体功能，在炎症性疾病（例如结肠炎）和年龄相关疾病的治疗中显示出潜在的治疗价值[1,2]。
SR12343对NEMO具有高度选择性，与其他NF-κB通路相关蛋白（例如IKKα、IKKγ）无显著结合[1]。

C15H15BRCLN3O

368.656101465225

367.008

2055101-86-3

124117414

Off-white to light yellow solid powder

3.8

54

2

3

6

21

332

0

PEOFCAIUELALCR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H15BrClN3O/c16-12-3-1-2-11(8-12)6-7-18-15(21)10-20-14-5-4-13(17)9-19-14/h1-5,8-9H,6-7,10H2,(H,18,21)(H,19,20)

N-(3-Bromophenethyl)-2-((5-chloropyridin-2-yl)amino)acetamide

SR 12343SR-12343 SR12343

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。