TC-Mps1-12

Mps1 (IC50 = 6.4 nM)

在自磷酸化测定中，TC-Mps1-12 抑制 pMps1 细胞系的生长，IC50 值为 131 nM[1]。
TC-Mps1-12（72 小时）抑制细胞生长，IC50 值为 0.84 μM，呈剂量依赖性[1]。

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接下来，我们将注意力转向吡啶环的C2侧链，以进一步提高JNK1的酶活性和选择性。晶体结构显示，乙醚的C2侧链位于由疏水残基Val539和Ile663组成的核糖囊中。因此，我们研究了一小部分疏水取代基，发现用叔丁基氨基（TC-Mps1-12）取代导致效力提高了6倍，Mps1的选择性是JNK1[1]的36倍

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一旦鉴定出高效的Mps1抑制剂9和12/TC-Mps1-12，我们就检查了这些化合物的细胞效应（表2）。为了研究Mps1的细胞抑制作用，我们开发了一种自磷酸化试验，该试验使用在四环素（Tet）可抑制启动子控制下稳定表达FLAG标记的Mps1细胞系TC-Mps1-12显示IC50值为131 nM，而9个在该自磷酸化试验中显示出弱抑制作用（1.8μM）。在A549肺癌细胞系中也检测了这些抗增殖活性。化合物9和TC-Mps1-12抑制了这些细胞系的生长，IC50值分别为9.5和0.84μM。抗增殖作用与Mps1的细胞抑制有关[1]

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为了评估激酶的选择性，我们针对95种激酶对化合物TC-Mps1-12进行了筛选。我们发现，除Flt3和Flt3突变体（D835Y）外，TC-Mps1-12在该面板中显示出优异的选择性特征（在1μM下分别抑制50%和86%；支持信息）。这种选择性可以用酶和抑制剂复合物的晶体结构来解释。我们的化合物以一种不同寻常的方式与Gly605旁边的Cys604的翻转羰基和铰链区的Glu603的羰基形成氢键。因此，我们的Mps1抑制剂不能与其他激酶的“通常”铰链区结合，这解释了TC-Mps1-12具有优异的激酶选择性。

C-Mps1-12（25-100 mg/kg；口服；每日；持续 19 天）在体内以剂量依赖性方式抑制 A549 细胞生长。 TC-Mps1-12 在 100 mg/kg 剂量下可抑制肿瘤生长 47%，且不会导致体重减轻[1]。
TC-Mps1-12 TC-Mps1-12 表现出良好的 PK 特性，Cmax 为 3542口服剂量 25 mg/kg 时，AUC 为 6604 ng/mL[1]。

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使用小鼠研究TC-Mps1-12的药代动力学（PK）特征（表2）。TC-Mps1-12/化合物12在口服剂量为25mg/kg时表现出良好的PK特性，Cmax为3542ng/mL，AUC为6604ng/h/mL。受这些结果的鼓舞，用A549异种移植物模型检查了12的体内疗效。携带异种移植物的小鼠每天口服一次，剂量从25增加到100mg/kg，持续19天。结果显示，12以剂量依赖的方式抑制A549细胞的生长（图5）。在100mg/kg的剂量下，12只表现出47%的肿瘤生长抑制，而体重没有减轻。[1]

Mps1酶测定。[1]
Mps1激酶活性通过DELFIA®测定法进行测量，该测定法使用磷酸化位点特异性抗体监测p38 MAPK肽（生物素AGAGAGAGALARHTDDEMTGYVA）的磷酸化。将测试化合物制备为DMSO中的10mM溶液，并根据需要用水稀释，以提供一系列最终测定条件。将测试化合物（1µL，10%DMSO）、Mps1溶液（5µL）（由0.5µg/mL全长Mps1、25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mMβ-甘油磷酸、0.1 mM Na3VO4、5 mM MgCl2和2 mmol/L DTT组成）和底物溶液。将平板在25°C下孵育90分钟。通过加入由25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM EDTA、0.01%（v/v）TritonX-100和0.1%（w/v）BSA组成的淬灭缓冲液来停止每个反应。将2.4µL溶液的等分试样转移到另一个384孔平板中，向其中加入淬灭缓冲溶液（60µL）。将50µL溶液的等分试样转移到涂有NeutrAvidin的黑色板中，并在室温下孵育30分钟。用100µL TTBS（10 mM Tris、40 mM TrisHCl、150 mM NaCl和0.05%（v/v）Tween20）洗涤板三次。向该板中加入50µL抗p38（磷酸T180）抗体溶液，并在室温下孵育2小时。将平板用TTBS（100µL）洗涤五次，加入50µL铕标记的抗兔IgG，然后在室温下孵育2小时。将平板用TTCS（100µL）洗涤五遍，加入50μL增强溶液，然后在常温下孵育5分钟。使用时间分辨测量模式在615 nm处读取荧光，在ARVO多标记计数器上读取平板。将抑制Mps1活性50%所需的试验化合物的浓度计算为IC50。

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JNK1酶测定。[1]
使用酶联免疫吸附试验（ELISA）通过JNK1底物ATF2的磷酸化来测量测试化合物对JNK1激酶活性的抑制。用DMSO连续稀释的测试化合物（DMSO中的10mM）用工作溶液（TBS（10mM Tris、40mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH=7.6）、0.1%（w/v）BSA、10mM MgCl、5mM MnCl、0.2mM Na3VO4和1mM DTT的一致溶液）进一步稀释，以制备测试化合物溶液（10%DMSO）。制备ATP溶液、生物素化-ATF2底物溶液和用工作溶液稀释的JNK1酶溶液。酶反应在384孔板中进行，最终体积为55µL。将5µL试验化合物溶液、20µL底物溶液（终浓度：50 nM）和20µL酶溶液（JNK1激酶活性与每批酶呈线性关系）加入384孔板中，通过加入10µL ATP溶液（终剂量：0.2µM）启动酶反应。在室温下孵育平板1小时后，通过加入5µL 0.5M EDTA溶液（pH=8.0）停止酶反应。将40µL的等分试样转移到涂有白色Neutravidin的384孔板中，并在室温下孵育0.5小时。用100µL TTBS（10 mM Tris、40 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和0.05%（v/v）吐温20）洗涤板三次。用含有0.1%（w/v）BSA的TBS以1:500稀释的40µL抗磷酸化-ATF2（磷酸化Thr 69，71）抗体处理该板，并在室温下孵育1.5小时。用TTBS（100µL）洗涤平板三次，加入40µL HRP偶联的抗鼠IgG 1:20000稀释液，其中TBS含有0.1%（w/v）BSA，然后在室温下孵育1.5小时。用100µL TTBS洗涤平板三次，使用比色ELISA在室温下加入40µL TMB溶液5分钟检测磷酸化ATF2。通过加入40µL 0.5M H2SO4溶液停止比色反应，然后将40µL溶液转移到新的透明底部384板中。使用在450nm处读取吸光度的光度测量模式在ARVO多标记计数器上读取该板。将抑制JNK1活性50%所需的试验化合物的浓度计算为IC50。

细胞系：549个细胞
孵育时间：72小时
结果：以剂量依赖性方式抑制细胞生长，IC50值为0.84 μM。

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细胞增殖试验。[1]
该测定使用ATCC提供的A549人肺腺癌上皮细胞系进行。A549细胞在DMEM培养基S9中培养，该培养基补充了10%胎牛血清、50单位/mL青霉素和50µg/mL链霉素，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。将A549细胞以1000个细胞/100µL/孔的密度接种在96孔板中，并孵育过夜。用培养基将测试化合物（DMSO中的10mM）稀释500倍，然后再稀释两倍，共九步。将与细胞培养体积相同量的连续稀释化合物转移到含有细胞的96孔板上。在37°C、5%CO2下孵育72小时后，将细胞加入10µL WST-8中，使用Emax酶标仪定量450nm和650nm处的光密度。IC50值被确定为将细胞存活率降低DMSO对照的50%所需的化合物浓度。

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Mps1自磷酸化试验。[1]
表达FLAG Mps1的RERF-LC-AI Tet-off细胞（内部，RERF-LC-AI细胞由RIKEN提供）在DMEM培养基中维持，该培养基在37°C、5%CO2下补充了10%Tet System批准的FBS、50单位/mL青霉素和50µg/mL链霉素、300µg/mL G418和1µg/mL多西环素。在无G418和强力霉素的培养基中，将细胞以2.8×105个细胞/皿的密度接种在15 cm的培养皿中，培养5小时。用PBS（-）洗涤后，将细胞在无强力霉素培养基中培养3天。将细胞以2.8×104个细胞/孔的速度重新接种在24孔板中，并培养过夜。在无强力霉素培养基中连续稀释的试验化合物（10 mM DMSO）用于处理24孔板中的细胞3小时。用PBS（-）洗涤细胞，然后用1×SDS样品缓冲液（100µL/孔）裂解，然后在98°C下变性10分钟。细胞裂解物在SDS-PAGE（6%丙烯酰胺）上溶解，转移到PVDF膜上，PVDF膜又被1%BlockAce封闭，并与抗FLAG M2抗体一起孵育。用HRP偶联的抗鼠IgG处理膜。使用ECL Plus和LAS-3000检测到FLAG标记的Mps1。通过带移来区分磷酸化形式和非磷酸化形式。使用Multigauge定量每个带的密度。试验化合物的抑制活性由DMSO-S10处理样品中条带密度的百分比表示。将FLAG-Mps1的自磷酸化抑制50%所需的试验化合物的浓度计算为IC50。

A549 mouse xenograft model
25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg
Oral administration; once daily; for 19 days

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In vivo antitumor assay.[1]
A549 cells were cultured in the medium described above. A549 cells (1 × 107 cells) were inoculated subcutaneously into the flank of female nude mice (BALB/cA Jcl-nu/nu, 7 weeks old). The treatment was started when the tumor volumes reached around 200 mm3 . The test compound/TC-Mps1-12 suspended in 0.5% methylcellulose solution was administered p.o. daily for 19 days (n = 6). Tumors were measured with a caliper to calculate tumor volume formulas as follows: tumor volume = (length × width × width)/2. Tumor sizes and mouse body weights were recorded on days 2, 5, 9, 12, 16 and 19. Antitumor activity was expressed as T/C (%): (the mean tumor volume of treated animals/mean tumor volume of control animals) × 100. [1]

The pharmacokinetic (PK) profile of TC-Mps1-12 was studied using mice (Table 2). TC-Mps1-12/Compound 12 showed good PK properties with a Cmax of 3542 ng/mL and AUC of 6604 ng h/mL at an oral dose of 25 mg/kg. Encouraged by these results, the in vivo efficacy of 12 was examined with the A549 xenograft model. Mice bearing xenografts were dosed orally once daily with an escalating dose from 25 to 100 mg/kg for 19 days. The results showed that 12 inhibited the growth of A549 cells in a dose-dependent manner (Figure 5). At a dose of 100 mg/kg, 12 exhibited 47% tumor growth inhibition without body weight loss. [1]

[1]. Diaminopyridine-based potent and selective mps1 kinase inhibitors binding to an unusual flipped-Peptide conformation. ACS Med Chem Lett. 2012 Jun 6;3(7):560-4.

Monopolar spindle 1 (Mps1) is an attractive cancer drug target due to the important role that it plays in centrosome duplication, the spindle assembly checkpoint, and the maintenance of chromosomal stability. A design based on JNK inhibitors with an aminopyridine scaffold and subsequent modifications identified diaminopyridine 9 with an IC50 of 37 nM. The X-ray structure of 9 revealed that the Cys604 carbonyl group of the hinge region flips to form a hydrogen bond with the aniline NH group in 9. Further optimization of 9 led to 12 with improved cellular activity, suitable pharmacokinetic profiles, and good in vivo efficacy in the mouse A549 xenograft model. Moreover, 12 displayed excellent selectivity over 95 kinases, indicating the contribution of its unusual flipped-peptide conformation to its selectivity. [1]

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In conclusion, potent and selective diaminopyridine-based Mps1 inhibitors have been successfully identified. X-ray crystallographic data indicate that the Cys604 carbonyl group of the hinge region flips to form a hydrogen bond with the aniline NH group at the 6-position of pyridine. The excellent kinase selectivity of the optimized compound 12 can be explained by the unusual peptide flip at the hinge region. The diaminopyridine scaffold should be a good template for more advanced inhibitors of Mps1. Diaminopyridine 12 also exhibited good cellular activity and pharmacokinetic properties and was efficacious in the A549 lung cancer xenograft model. Additionally, 12 has good leadlike profiles: low MW (324), CLog P (2.8), and high LE (0.47). The selective Mps1 inhibitor 12 with in vivo efficacy could be used as a valuable tool for elucidating the biological functions in cancer therapy.[1]

C17H20N6O

324.380302429199

324.169

C, 62.95; H, 6.21; N, 25.91; O, 4.93

1206170-62-8

1206170-62-8

70682875

White to off-white solid powder

2.5

130

4

6

5

24

485

0

XDEFNAWAKYQBQY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H20N6O/c1-17(2,3)23-16-12(9-18)13(19)8-14(22-16)21-11-6-4-10(5-7-11)15(20)24/h4-8H,1-3H3,(H2,20,24)(H4,19,21,22,23)

4-[[4-amino-6-(tert-butylamino)-5-cyanopyridin-2-yl]amino]benzamide

TCMps112; TC Mps1 12; TC-Mps1-12

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。