TC-Mps1-12

Mps1 (IC50 = 6.4 nM)

在自磷酸化测定中，TC-Mps1-12 抑制 pMps1 细胞系的生长，IC50 值为 131 nM[1]。
TC-Mps1-12（72 小时）抑制细胞生长，IC50 值为 0.84 μM，呈剂量依赖性[1]。

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接下来，我们将注意力转向吡啶环的C2侧链，以进一步提高JNK1的酶活性和选择性。晶体结构显示，乙醚的C2侧链位于由疏水残基Val539和Ile663组成的核糖囊中。因此，我们研究了一小部分疏水取代基，发现用叔丁基氨基（TC-Mps1-12）取代导致效力提高了6倍，Mps1的选择性是JNK1[1]的36倍

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一旦鉴定出高效的Mps1抑制剂9和12/TC-Mps1-12，我们就检查了这些化合物的细胞效应（表2）。为了研究Mps1的细胞抑制作用，我们开发了一种自磷酸化试验，该试验使用在四环素（Tet）可抑制启动子控制下稳定表达FLAG标记的Mps1细胞系TC-Mps1-12显示IC50值为131 nM，而9个在该自磷酸化试验中显示出弱抑制作用（1.8μM）。在A549肺癌细胞系中也检测了这些抗增殖活性。化合物9和TC-Mps1-12抑制了这些细胞系的生长，IC50值分别为9.5和0.84μM。抗增殖作用与Mps1的细胞抑制有关[1]

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为了评估激酶的选择性，我们针对95种激酶对化合物TC-Mps1-12进行了筛选。我们发现，除Flt3和Flt3突变体（D835Y）外，TC-Mps1-12在该面板中显示出优异的选择性特征（在1μM下分别抑制50%和86%；支持信息）。这种选择性可以用酶和抑制剂复合物的晶体结构来解释。我们的化合物以一种不同寻常的方式与Gly605旁边的Cys604的翻转羰基和铰链区的Glu603的羰基形成氢键。因此，我们的Mps1抑制剂不能与其他激酶的“通常”铰链区结合，这解释了TC-Mps1-12具有优异的激酶选择性。

C-Mps1-12（25-100 mg/kg；口服；每日；持续 19 天）在体内以剂量依赖性方式抑制 A549 细胞生长。 TC-Mps1-12 在 100 mg/kg 剂量下可抑制肿瘤生长 47%，且不会导致体重减轻[1]。
TC-Mps1-12 TC-Mps1-12 表现出良好的 PK 特性，Cmax 为 3542口服剂量 25 mg/kg 时，AUC 为 6604 ng/mL[1]。

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使用小鼠研究TC-Mps1-12的药代动力学（PK）特征（表2）。TC-Mps1-12/化合物12在口服剂量为25mg/kg时表现出良好的PK特性，Cmax为3542ng/mL，AUC为6604ng/h/mL。受这些结果的鼓舞，用A549异种移植物模型检查了12的体内疗效。携带异种移植物的小鼠每天口服一次，剂量从25增加到100mg/kg，持续19天。结果显示，12以剂量依赖的方式抑制A549细胞的生长（图5）。在100mg/kg的剂量下，12只表现出47%的肿瘤生长抑制，而体重没有减轻。[1]

Mps1酶测定。[1]
Mps1激酶活性通过DELFIA®测定法进行测量，该测定法使用磷酸化位点特异性抗体监测p38 MAPK肽（生物素AGAGAGAGALARHTDDEMTGYVA）的磷酸化。将测试化合物制备为DMSO中的10mM溶液，并根据需要用水稀释，以提供一系列最终测定条件。将测试化合物（1µL，10%DMSO）、Mps1溶液（5µL）（由0.5µg/mL全长Mps1、25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mMβ-甘油磷酸、0.1 mM Na3VO4、5 mM MgCl2和2 mmol/L DTT组成）和底物溶液。将平板在25°C下孵育90分钟。通过加入由25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM EDTA、0.01%（v/v）TritonX-100和0.1%（w/v）BSA组成的淬灭缓冲液来停止每个反应。将2.4µL溶液的等分试样转移到另一个384孔平板中，向其中加入淬灭缓冲溶液（60µL）。将50µL溶液的等分试样转移到涂有NeutrAvidin的黑色板中，并在室温下孵育30分钟。用100µL TTBS（10 mM Tris、40 mM TrisHCl、150 mM NaCl和0.05%（v/v）Tween20）洗涤板三次。向该板中加入50µL抗p38（磷酸T180）抗体溶液，并在室温下孵育2小时。将平板用TTBS（100µL）洗涤五次，加入50µL铕标记的抗兔IgG，然后在室温下孵育2小时。将平板用TTCS（100µL）洗涤五遍，加入50μL增强溶液，然后在常温下孵育5分钟。使用时间分辨测量模式在615 nm处读取荧光，在ARVO多标记计数器上读取平板。将抑制Mps1活性50%所需的试验化合物的浓度计算为IC50。

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JNK1酶测定。[1]
使用酶联免疫吸附试验（ELISA）通过JNK1底物ATF2的磷酸化来测量测试化合物对JNK1激酶活性的抑制。用DMSO连续稀释的测试化合物（DMSO中的10mM）用工作溶液（TBS（10mM Tris、40mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH=7.6）、0.1%（w/v）BSA、10mM MgCl、5mM MnCl、0.2mM Na3VO4和1mM DTT的一致溶液）进一步稀释，以制备测试化合物溶液（10%DMSO）。制备ATP溶液、生物素化-ATF2底物溶液和用工作溶液稀释的JNK1酶溶液。酶反应在384孔板中进行，最终体积为55µL。将5µL试验化合物溶液、20µL底物溶液（终浓度：50 nM）和20µL酶溶液（JNK1激酶活性与每批酶呈线性关系）加入384孔板中，通过加入10µL ATP溶液（终剂量：0.2µM）启动酶反应。在室温下孵育平板1小时后，通过加入5µL 0.5M EDTA溶液（pH=8.0）停止酶反应。将40µL的等分试样转移到涂有白色Neutravidin的384孔板中，并在室温下孵育0.5小时。用100µL TTBS（10 mM Tris、40 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和0.05%（v/v）吐温20）洗涤板三次。用含有0.1%（w/v）BSA的TBS以1:500稀释的40µL抗磷酸化-ATF2（磷酸化Thr 69，71）抗体处理该板，并在室温下孵育1.5小时。用TTBS（100µL）洗涤平板三次，加入40µL HRP偶联的抗鼠IgG 1:20000稀释液，其中TBS含有0.1%（w/v）BSA，然后在室温下孵育1.5小时。用100µL TTBS洗涤平板三次，使用比色ELISA在室温下加入40µL TMB溶液5分钟检测磷酸化ATF2。通过加入40µL 0.5M H2SO4溶液停止比色反应，然后将40µL溶液转移到新的透明底部384板中。使用在450nm处读取吸光度的光度测量模式在ARVO多标记计数器上读取该板。将抑制JNK1活性50%所需的试验化合物的浓度计算为IC50。

细胞系：549个细胞
孵育时间：72小时
结果：以剂量依赖性方式抑制细胞生长，IC50值为0.84 μM。

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细胞增殖试验。[1]
该测定使用ATCC提供的A549人肺腺癌上皮细胞系进行。A549细胞在DMEM培养基S9中培养，该培养基补充了10%胎牛血清、50单位/mL青霉素和50µg/mL链霉素，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。将A549细胞以1000个细胞/100µL/孔的密度接种在96孔板中，并孵育过夜。用培养基将测试化合物（DMSO中的10mM）稀释500倍，然后再稀释两倍，共九步。将与细胞培养体积相同量的连续稀释化合物转移到含有细胞的96孔板上。在37°C、5%CO2下孵育72小时后，将细胞加入10µL WST-8中，使用Emax酶标仪定量450nm和650nm处的光密度。IC50值被确定为将细胞存活率降低DMSO对照的50%所需的化合物浓度。

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Mps1自磷酸化试验。[1]
表达FLAG Mps1的RERF-LC-AI Tet-off细胞（内部，RERF-LC-AI细胞由RIKEN提供）在DMEM培养基中维持，该培养基在37°C、5%CO2下补充了10%Tet System批准的FBS、50单位/mL青霉素和50µg/mL链霉素、300µg/mL G418和1µg/mL多西环素。在无G418和强力霉素的培养基中，将细胞以2.8×105个细胞/皿的密度接种在15 cm的培养皿中，培养5小时。用PBS（-）洗涤后，将细胞在无强力霉素培养基中培养3天。将细胞以2.8×104个细胞/孔的速度重新接种在24孔板中，并培养过夜。在无强力霉素培养基中连续稀释的试验化合物（10 mM DMSO）用于处理24孔板中的细胞3小时。用PBS（-）洗涤细胞，然后用1×SDS样品缓冲液（100µL/孔）裂解，然后在98°C下变性10分钟。细胞裂解物在SDS-PAGE（6%丙烯酰胺）上溶解，转移到PVDF膜上，PVDF膜又被1%BlockAce封闭，并与抗FLAG M2抗体一起孵育。用HRP偶联的抗鼠IgG处理膜。使用ECL Plus和LAS-3000检测到FLAG标记的Mps1。通过带移来区分磷酸化形式和非磷酸化形式。使用Multigauge定量每个带的密度。试验化合物的抑制活性由DMSO-S10处理样品中条带密度的百分比表示。将FLAG-Mps1的自磷酸化抑制50%所需的试验化合物的浓度计算为IC50。

A549 小鼠异种移植模型
25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg
口服给药；每日一次；持续 19 天

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体内抗肿瘤试验。[1]
将 A549 细胞培养于上述培养基中。将 A549 细胞（1 × 10⁷ 个细胞）皮下接种于 7 周龄雌性裸鼠（BALB/cA Jcl-nu/nu）侧腹部。当肿瘤体积达到约 200 mm³ 时开始治疗。将测试化合物/TC-Mps1-12悬浮于 0.5% 甲基纤维素 溶液中，每日口服给药，持续 19 天（n = 6）。使用游标卡尺测量肿瘤，并按以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积 = (长 × 宽 × 宽)/2。在第 2、5、9、12、16 和 19 天记录肿瘤大小和小鼠体重。抗肿瘤活性以 T/C (%) 表示：（治疗组动物的平均肿瘤体积/对照组动物的平均肿瘤体积）× 100。[1]

使用小鼠研究了TC-Mps1-12的药代动力学(PK)特征（表2）。TC-Mps1-12/化合物12在25 mg/kg口服剂量下表现出良好的PK特性，Cmax为3542 ng/mL，AUC为6604 ng·h/mL。基于这些结果，我们使用A549异种移植瘤模型检测了化合物12的体内疗效。荷瘤小鼠每日口服一次，剂量从25 mg/kg递增至100 mg/kg，持续19天。结果表明，化合物12以剂量依赖的方式抑制A549细胞的生长（图5）。在100 mg/kg剂量下，化合物12使肿瘤生长抑制率达到47%，且未引起体重减轻。[1]

[1]. Diaminopyridine-based potent and selective mps1 kinase inhibitors binding to an unusual flipped-Peptide conformation. ACS Med Chem Lett. 2012 Jun 6;3(7):560-4.

单极纺锤体1 (Mps1) 因其在中心体复制、纺锤体组装检查点和染色体稳定性维持中发挥的重要作用，而成为极具吸引力的抗癌药物靶点。基于氨基吡啶骨架的JNK抑制剂设计及其后续修饰，筛选出IC50为37 nM的二氨基吡啶类化合物9。化合物9的X射线晶体结构显示，其铰链区Cys604羰基发生翻转，与苯胺NH基团形成氢键。对化合物9进行进一步优化，得到化合物12，该化合物具有更高的细胞活性、更佳的药代动力学特征以及在小鼠A549异种移植模型中良好的体内疗效。此外，化合物12对95种激酶表现出优异的选择性，表明其独特的翻转肽构象是其选择性的关键因素。[1] 总之，我们成功筛选出高效且选择性的二氨基吡啶类Mps1抑制剂。 X射线晶体衍射数据表明，铰链区Cys604的羰基翻转，与吡啶环6位上的苯胺NH基团形成氢键。优化后的化合物12具有优异的激酶选择性，这可归因于铰链区不寻常的肽链翻转。二氨基吡啶骨架有望成为开发更高级Mps1抑制剂的良好模板。二氨基吡啶12还表现出良好的细胞活性和药代动力学性质，并在A549肺癌异种移植模型中显示出疗效。此外，12还具有良好的先导化合物特性：低分子量（324）、低CLog P值（2.8）和高LE值（0.47）。具有体内疗效的选择性Mps1抑制剂12可作为阐明癌症治疗中生物学功能的重要工具。[1]

C17H20N6O

324.380302429199

324.169

C, 62.95; H, 6.21; N, 25.91; O, 4.93

1206170-62-8

1206170-62-8

70682875

White to off-white solid powder

2.5

130

4

6

5

24

485

0

XDEFNAWAKYQBQY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H20N6O/c1-17(2,3)23-16-12(9-18)13(19)8-14(22-16)21-11-6-4-10(5-7-11)15(20)24/h4-8H,1-3H3,(H2,20,24)(H4,19,21,22,23)

4-[[4-amino-6-(tert-butylamino)-5-cyanopyridin-2-yl]amino]benzamide

TCMps112; TC Mps1 12; TC-Mps1-12

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。